用于生成多细胞三维球体的 CD 实验室平台

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

我们提出了一种运动动力离心微流体装置,可以培养细胞球体。使用该装置,单细胞或多种细胞类型的球体在高重力条件下可以很容易地共同培养。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

三维球体细胞培养法在细胞实验中可以获得更有用的结果,因为它比二维细胞培养更好的模拟活体细胞微环境。在这项研究中,我们制造了一个电机驱动的实验室在CD(光盘)平台,称为离心微流体基球体(CMS)培养系统,以创建三维(3D)细胞球体实现高离心力。此设备可改变旋转速度,生成从 1 x g到 521 x g的重力条件。CMS系统直径6厘米,微井100400μm,由计算机数控机在聚碳酸酯模具中用聚二甲基硅氧烷成型。CMS 系统通道入口的屏障墙使用离心力将细胞均匀地分布到芯片内。在通道的末端,有一个滑动区域,允许细胞进入微井。作为证明,球体是由人类脂肪衍生干细胞和人类肺成纤维细胞在高重力条件下使用该系统的单一培养和共同培养产生的。CMS系统使用一个简单的操作方案来生产同心、Janus 和三明治等不同结构的共栽球体。CMS系统将可用于细胞生物学和组织工程研究,需要单细胞或多种细胞类型的球体和有机体培养。

Introduction

与二维(2D)细胞培养(例如,常规培养皿细胞培养)相比,使用三维(3D)球形细胞培养法在体内微环境中模拟生物更容易,从而产生更生理上逼真的实验结果1.目前可用的球形形成方法包括悬滴技术2、液体覆盖技术3、卡博基甲基纤维素技术4、磁力微流体技术5、使用生物反应器6.尽管每种方法都有其自身的优点,但还需要进一步提高可重复性、生产率和生成共培养球体。例如,虽然基于磁力的微流体技术5相对便宜,但必须仔细考虑强磁场对活细胞的影响。球体培养的好处,特别是在研究中细胞分化和增殖,已经报告在几项研究7,8,9。

离心微流体系统,也称为CD实验室(光盘),可用于轻松控制内部流体和利用基板的旋转,因此已用于生物医学应用,如免疫测定10,用于检测生化标记物11的色度测定、核酸扩增 (PCR) 测定、自动血液分析系统12和一体离心微流体装置13。控制流体的驱动力是旋转产生的向心力。此外,只需在这个单 CD 平台中,即可完成混合、val 和样品拆分的多种功能。然而,与上述生化分析方法相比,将CD平台应用于培养细胞,特别是球体14的试验较少。

在这项研究中,通过单一培养或人类脂肪衍生干细胞(hASC)和人肺成纤维细胞(MRC-5)的单培养或共培养,展示了离心微流体基球体(CMS)系统的性能。本文详细介绍了我们小组的研究方法15。因此,在CD上的球形培养实验室平台可以很容易地复制。介绍了一种CMS生成系统,包括CMS培养芯片、芯片支架、直流电机、电机安装和旋转平台。电机支座为 3D 打印,印有丙烯酰胺苯乙烯 (ABS)。芯片架和旋转平台是数控(计算机数控)与PC(聚碳酸酯)一起加工的。通过编码基于脉冲宽度调制的 PID(比例积分-衍生物)算法,电机的转速从 200 rpm 控制在 200 到 4,500 rpm。其尺寸为 100 mm x 100 mm x 150 mm,重量为 860 g,易于操作。使用CMS系统,可以在1 x g到521 x g的各种重力条件下生成球体,因此在高重力下细胞分化促进的研究可以从2D细胞16、17扩展到3D。球体。各类细胞的共生也是有效模拟体内环境的关键技术。CMS 系统可以轻松生成单一培养球体,以及各种结构类型(例如同心、Janus 和三明治)的共培养球体。CMS系统不仅可用于简单的球形研究,还可用于3D有机体研究,以考虑人体器官结构。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 离心微流体基球体 (CMS) 培养芯片制造

  1. 通过数控加工为 CMS 培养芯片的顶层和底层制作 PC 模具。图1给出了芯片的详细尺寸。
  2. 以 10:1 (w/w) 的比例将 PDMS 底座和 PDMS 固化剂混合 5 分钟,并在干燥器中放置 1 小时以去除气泡。
  3. 将 PDMS 混合物倒入 CMS 培养芯片的模具后,再去除气泡 1 小时,并在 80°C 的热室中固化 2 小时。
  4. 将它们放入真空等离子清洗器中,表面朝上粘结,并将其暴露在空气辅助等离子体中,功率为 18 W,为 30 s。
  5. 将 CMS 培养芯片的两层粘结,并将其置于 80°C 的加热室中 30 分钟,以增加粘附强度。
  6. 在 121 °C 和 15 psi 的高压灭菌器中对 CMS 培养芯片进行灭菌。

2. 细胞制备

  1. 在水浴36.5°C下将含有5×10 5+1+1+1+16hASCs或MRC-5s细胞的1 mL解冻2分钟。
  2. 将 1 mL 的 Dulbeco 改性鹰介质 (DMEM) 添加到小瓶中,并与 1,000 μL 移液器轻轻混合。
  3. 使用移液器将 15 mL 的预加热至 36.5 °C 的培养皿放入直径为 150 mm 的培养皿中,然后从小瓶中加入细胞。
  4. 1 天后,吸出 DMEM 并更换为 15 mL 的新鲜 DMEM。随后,每 2 或 3 天更改一次介质。
  5. 要从培养皿中分离细胞,向培养皿中加入4 mL的胰蛋白酶,并将其置于36.5°C的培养箱中,在5%的CO2中放置4分钟。

3. 单一栽培球形形成

  1. 将 2.5 mL 的 4% (w/v) 普乐 F-127 溶液放入 CMS 培养芯片(图 2A)的进口孔中,同时以 500-1,000 rpm 转速旋转芯片,然后使用 CMS 系统(图 2B) 以 4,000 rpm 旋转芯片 3 分钟。
    注: 在芯片旋转时,软体涂层可防止细胞附着到入口。确保空气没有滞留在微井中。
  2. 在5%CO2的36.5°C下,在36.5°C中孵育充满普鲁尼克溶液的CMS培养芯片。
  3. 取出绒毛溶液,用DMEM冲洗剩余的绒面溶液,在干净的工作台上干燥12小时。
  4. 将 2.5 mL 的 DMEM 添加到 CMS 培养芯片中,以 ±4,000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟,以预润芯片内部。
  5. 停止旋转并拉出 100 μL 的 DMEM,为注入细胞悬浮液腾出空间。
  6. 通过移液,通过移液 3~5x 进行移液,均匀分配细胞,加入包含 5 × 105 hASC 或 8× 105 MRC-5s 的细胞悬浮液 100 μL。
  7. 以 3,000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟,通过离心力捕获每个微井中的细胞。
    注: 转速过高可能导致细胞通过溶液弹出孔逃逸。
  8. 在36.5°C、>95%湿度和5%CO2下在培养箱中培养细胞3天,在1,000~2,000rpm下旋转。每天改变文化媒介。

4. 共栽球形形成

  1. 同心球形形成
    1. 添加第一个单元,2.5 × 105 hASC,并在 3,000 rpm 转速下旋转芯片。3分钟后,加入第二个细胞,4×105 MRC-5s,在3000rpm转速下旋转芯片3分钟。通过移液共注入100μL的细胞悬浮液。注入细胞时,将转速调至 500-1,000 rpm。
    2. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2下,在 1,000~2,000 rpm 转速下旋转培养培养培养培养箱中的细胞。同心球体在 24 小时内创建。对于长期文化,每天改变文化媒介。
  2. 贾努斯球形形成
    1. 在芯片以 500~1,000 rpm 转速旋转时,通过移液添加包含第一个细胞的 100 μL 电池悬浮液,2.5 × 105 hASC。然后,以 3,000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
    2. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2下孵育芯片,在 1,000~2,000 rpm 转速下旋转 3 小时。
    3. 在芯片以 500~1,000 rpm 转速旋转时,通过移液添加包含第二组细胞的 100 μL 细胞悬浮液,4 × 105 MRC-5s。然后,以 3,000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
    4. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2下,在 1,000~2,000 rpm 下旋转培养培养培养培养箱中的细胞。Janus 球体在 24 小时内创建。对于长期文化,每天改变文化媒介。
  3. 三明治球形形成
    1. 在芯片以 500~1,000 rpm 转速旋转时,通过移液添加包含第一个细胞的 1.5 × 105 hASC 的 100 μL 细胞悬浮液。然后,以 3,000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
    2. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2下孵育芯片,在 1,000~2,000 rpm 转速下旋转 3 小时。
    3. 当芯片在 500~1,000 rpm 转速下旋转时,通过移液添加包含第二个细胞的 100 μL 细胞悬浮液,3 × 105 MRC-5s。然后,以 3,000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
    4. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2下孵育芯片,在 1,000~2,000 rpm 转速下旋转 3 小时。
    5. 在芯片以 500~1,000 rpm 转速旋转时,通过移液添加包含第三个细胞的 1.5 × 105 hASC 的 100 μL 细胞悬浮液。然后,以 3,000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
    6. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO2下,在 1,000~2,000 rpm 转速下旋转培养培养培养培养箱中的细胞。三明治球体在12小时内产生。对于长期文化,每天改变文化媒介。

5. 细胞染色

  1. 将细胞荧光染料加热至室温(20°C)。
  2. 每瓶加入20μL无水二甲基硫氧化物(DMSO),以产生1 mM溶液。
  3. 使用 DMEM 将荧光稀释至 1 μM 的最终工作浓度。
  4. 将荧光添加到细胞悬浮液中,并使用移液器轻轻重新悬浮。
  5. 在36.5°C下孵育20分钟,湿度大于95%,CO2为5%。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

直径为6厘米的CMS培养芯片(图2)按照上述方案成功制造。首先,芯片与顶层和底层分开,然后通过等离子体粘接粘合在一起。通过分离芯片,可以轻松收集生成的球体。CMS 培养芯片的通道包括入口端口和中央、滑动和微井区域(图 3)。细胞、介质和压孔溶液通过直径为 5 mm 的入口孔注入。注射的细胞通过在入口端口区域中重新悬浮3~5倍均匀分布。细胞在中部地区受到离心力的影响,然后向外扩散。由于中心区域高于微井,它可以包含更多的介质,使球体存活更长时间。微孔的高度为 0.4 mm,中心区域的高度为 1.5 mm。吸孔位于中心区域的中心,可轻松拆下内部溶液。滑动区域是连接中心区域和微井区域的倾斜区域。细胞沿着45°的斜坡移动,并定居在微井区域,在那里细胞沉降、生长和缠绕形成球形。微井位于距芯片中心 14 mm 处,为半圆柱形,高度为 400 μm,直径为 400 μm。在100个微井中可以同时生成100个球体。

使用制备的CMS芯片,可以按协议所示的顺序生成球体(图4)。单培养和共培球体与hASC和MRC-5细胞一起生成。为了生成每种类型的细胞的单培养球体,注射了5×105 hASCs或8×10 5MRC-5s。注射的细胞数量与细胞大小无关。这两种细胞的延时图像在2000rpm下拍摄,直到细胞培养第3天(图5)。hASC 和 MRC-5 的共培养球体也使用同心、Janus 和三明治结构生成。为了使同心球体,注射了第一个细胞(2.5 × 105 hASCs),第二个细胞(4 × 105 MRC-5s)注射3分钟后(图6A)。当第一个细胞被注射时,由于高重力,它们变成U形,当第二个细胞被注射时,它们移动到U形的中间。随着时间的推移,第一个U形细胞包围了第二个细胞,并完成了同心球体。为了使Janus球体,注射了第一个细胞(2.5 × 105 hASCs),第二个细胞(4 × 105 MRC-5s)在3小时后注射(图6B)。当两个细胞之间的注射间隔很长时,第一个细胞的形状通过细胞聚合从U形变为椭圆形。一旦第二个细胞被添加到第一个细胞的椭圆形状,Janus球体被生成。在三明治球体的情况下,注射第一个细胞(1.5 × 105 hASCs),第二个细胞(3 × 105 MRC-5s)注射3小时后,第三个细胞(1.5 × 105 hASCs)在3小时后注射(图6C)).与 Janus 球体类似,每个细胞聚合成椭圆形,三层堆叠以生成三明治球形。最后,为了证明CMS的长期培养能力,hASCs被培养,暴露于高重力7天,然后进行活/死测定,以表明大多数细胞存活(图7)。此外,在MRC-5的培养3天后,拍摄了CMS所有微井的照片,以显示球体的优异性和球质性(图8)。

Figure 1
图 1:CMS 培养芯片的顶部和底层的尺寸。PC 模具使用 CNC 机器制成,并与 PDMS 进行复制,以基于 3D CAD(计算机辅助设计)程序创建的图形制作 CMS 培养芯片。顶部和底部图层边缘的四个圆圈用于对齐两个图层。尺寸以毫米为单位。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:CMS系统的照片。A) 已完成的 CMS 文化芯片的照片.芯片直径为6厘米,微井直径为400μm。微井上方的数字表示微井的单个数字,从 1 到 100。这些数字被刻在模具里。刻度条 = 400 μm。(B) 整个 CMS 系统的照片。CMS系统包括CMS培养芯片、芯片架、直流电机和旋转平台。CMS 设备可通过旋转力生成高达 521 x g的重力条件。芯片架由于高重力而防止CMS培养芯片分离。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:CMS 的通道组件。A) CMS 文化芯片的横截面的原理图像和 (B) 照片.CMS 培养芯片由入口端口和中央、滑动和微井区域组成。由于注入的细胞不会以低于 1,000 rpm 的转速通过屏障,因此屏障有助于细胞的重新悬浮,甚至分布到微孔。比例尺 = 2 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:将细胞加载到CMS培养芯片的过程。A) 为防止细胞粘在芯片底部,在 4,000 rpm 转速下涂上 2.5 mL 的普鲁尼克 F-127 溶液。等待一天,以便涂上涂层。(B) 取出压音溶液,用 2.5 mL 的 DMEM 介质预填充通道。(C) 取出 100 μL 的 DMEM 并添加 100 μL 的细胞悬浮液。此时,重新悬浮 3~5 倍,以便均匀分布单元格。(D) 通过旋转芯片将细胞移动到微井,然后在 1,000 到 2,000 rpm 下培养细胞 3 天。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:hASC和MRC-5细胞单培养球体的延时照片。细胞在2000rpm下生长24小时。球体在24小时内生成。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:共培养球体的荧光图像。A) 同心球形形状,其中 hASC 细胞(绿色)环绕 MRC-5 细胞(红色)。(B) 两个细胞对称的 Janus 球形形状。(C) 三明治球形形状,其中 hASC 层堆叠在两个 MRC-5 层之间。刻度条 = 400 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7:第7天hASC的实时/死亡测定。绿色荧光颜色表示活细胞,红色荧光颜色表示死细胞。刻度条 = 400 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8:第3天的MRC-5球体。相对恒定的细胞数量进入每个微井,形成在CMS系统中具有相对恒定的球状体。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 9
图9:收获球体。通过划分 CMS 培养芯片的两层,可以收获培养球体。两个等离子粘结层可通过手工轻松分离。然后,球体从底层的微井中收集,只需通过移液即可。刻度条 = 400 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CMS 是一个封闭的系统,所有注入的细胞进入微井时无浪费,使其比传统的基于微井的球形生成方法更高效、更经济。在 CMS 系统中,介质每 12~24 小时通过一个吸孔进行更换,该吸孔设计用于移除芯片中的介质(图 3A)。在介质吸入过程中,由于介质与微井壁之间的表面张力,几乎没有任何介质从微井内部逸出。用户可以通过用手指在芯片的微井区域附近按压,轻松移除被困介质,因为 PDMS 制成的芯片具有弹性和弹性。即使多次介质发生变化,微井中的细胞也能保持稳定,不会逃逸。为了在所有100个微井中实现相同的球体质量,器件的旋转不应偏心,芯片应该是不对称的。否则,可变数量的细胞可能会进入每个井,球形的大小和形状可能会有所不同。在传统的微井系统中,由于空气经常被困在微井中,因此有必要去除气泡。但是,CMS 系统不需要气泡去除过程,因为旋转产生的高离心力会导致介质将气泡推出微井。

与传统方法相比,CMS 系统也有其局限性。CMS 系统需要更大的培养空间(例如,大型培养箱空间),因为它包括电机、旋转平台和控制器,其总尺寸约为 100 mm x 100 mm x 150 mm(图2B)。此外,它会导致轻微但持久的振动。我们期望系统的小型化(希望类似于6个井板的大小)将解决这些问题。

需要注意的是,通过分离CMS系统的两个等离子体粘结层可以收集培养的球体(图9)。两层的粘合足够牢固,可防止介质在系统运行过程中泄漏。然而,由于粘接面积小,它是可分离的手工。球形可以通过移液从底层简单收集。

与传统的球形生成方法相比,CMS 系统具有更好的可重复性和生产率。传统方法,如普通微井或悬滴法,是劳动密集型的。然而,在CMS系统中,仅仅增加芯片尺寸就更容易增加球体的数量。有了这个装置,也可以生成需要多细胞类型的培养物的有机体,这在传统的培养方法中是不容易做到的。除了本研究中的细胞(hASC和MRC-5)外,CMS还可用于使用各种其他类型的细胞进行球形生产,这些细胞可以形成球形。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了NRF基础科学研究计划(2016R1D1A1B03934418)和生物与医疗技术发展计划(2018M3A9H1023141)的支持,并由韩国政府MSIT资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230, (1), 16-26 (2015).
  2. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136, (3), 473-478 (2011).
  3. Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41, (7), 2980-2984 (1981).
  4. Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297, (2), 415-423 (2004).
  5. Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
  6. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  7. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  8. Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
  9. Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14, (1), 105 (2014).
  10. Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87, (2), 922-928 (2015).
  11. Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
  12. Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
  13. Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86, (22), 11349-11356 (2014).
  14. Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10, (14), 1758-1773 (2010).
  15. Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9, (4), (2017).
  16. Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
  17. Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
  18. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32, (8), 760-772 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics