Plataforma Lab-on-a-CD para generar esferoides tridimensionales multicelulares

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Presentamos un dispositivo microfluídico centrífugo motorizado que puede cultivar esferoides celulares. Usando este dispositivo, los esferoides de uno o varios tipos de células podrían ser fácilmente cocultivos bajo condiciones de alta gravedad.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Un cultivo de células esferoides tridimensionales puede obtener resultados más útiles en experimentos celulares porque puede simular mejor los microambientes celulares del cuerpo vivo que el cultivo celular bidimensional. En este estudio, fabricamos una plataforma eléctrica de laboratorio en un CD (disco compacto), llamada sistema de cultivo de esferoides microfluídicos centrífugos (CMS), para crear esferoides celulares tridimensionales (3D) que implementan una alta fuerza centrífuga. Este dispositivo puede variar las velocidades de rotación para generar condiciones de gravedad de 1 x g a 521 x g. El sistema CMS tiene 6 cm de diámetro, tiene cien micropocillos de 400 m y se realiza mediante moldeo con polidimetilsiloxano en un molde de policarbonato prefabricado por una máquina de control numérico por ordenador. Una pared de barrera en la entrada del canal del sistema CMS utiliza fuerza centrífuga para esparcir las células uniformemente dentro del chip. Al final del canal, hay una región de diapositivas que permite que las celdas entren en los micropozos. Como demostración, los esferoides fueron generados por el monocultivo y la cocultura de células madre derivadas de adiposos humanos y fibroblastos pulmonares humanos en condiciones de alta gravedad utilizando el sistema. El sistema CMS utilizó un esquema de operación simple para producir esferoides de cocultura de varias estructuras de concéntrico, Janus y sándwich. El sistema CMS será útil en estudios de biología celular e ingeniería de tejidos que requieren esferoides y cultivo organoide de tipos de células simples o múltiples.

Introduction

Es más fácil simular microambientes biológicos in vivo con cultivo de células esferoides tridimensionales (3D) que con cultivo celular bidimensional (2D) (por ejemplo, cultivo celular de placa Petri convencional) para producir un cultivo experimental experimental más fisiológicamente realista resultados1. Los métodos de formación de esferoides actualmente disponibles incluyen la técnica de gota colgante2,la técnica de superposición de líquido sin carga3,la técnica de carboximetilcelulosa4,la técnica microfluídica basada en la fuerza magnética5,y el uso de biorreactores6. Aunque cada método tiene sus propios beneficios, es necesaria una mejora adicional en la reproducibilidad, la productividad y la generación de esferoides de cocultura. Por ejemplo, mientras que la técnica microfluídica basada en la fuerza magnética5 es relativamente barata, los efectos de los campos magnéticos fuertes en las células vivas deben ser cuidadosamente considerados. Los beneficios del cultivo esferoide, particularmente en el estudio de la diferenciación y proliferación de células madre mesenquimales, se han divulgado en varios estudios7,8,9.

El sistema microfluídico centrífugo, también conocido como laboratorio en un CD (disco compacto), es útil para controlar fácilmente el fluido en el interior y explotar la rotación del sustrato y, por lo tanto, se ha utilizado en aplicaciones biomédicas como los inmunoensayos10, ensayos colorimétricos para la detección de marcadores bioquímicos11, ensayos de amplificación de ácido nucleico (PCR), sistemas automatizados de análisis de sangre12y dispositivos microfluídicos centrífugos todo en uno13. La fuerza motriz que controla el fluido es la fuerza centrípeta creada por rotación. Además, múltiples funciones de mezcla, válvula y división de muestras se pueden hacer simplemente en esta única plataforma de CD. Sin embargo, en comparación con los métodos de análisis bioquímicos antes mencionados, ha habido menos ensayos aplicando plataformas de CD a las células de cultivo, especialmente los esferoides14.

En este estudio, mostramos el rendimiento del sistema centrífugo de esferoides microfluídicos (CMS) por monocultivo o cocultivo de células madre derivadas de adiposos humanos (hASC) y fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5). Este artículo describe en detalle la metodología de investigación de nuestro grupo15. Por lo tanto, la plataforma de laboratorio en un CD de cultivo de esferoide se puede reproducir fácilmente. Se presenta un sistema de generación CMS que comprende un chip de cultivo CMS, un soporte de chip, un motor de CC, un soporte de motor y una plataforma giratoria. El soporte del motor está impreso en 3D con acrilonitrilo butadieno estireno (ABS). El soporte de viruta y la plataforma giratoria son CNC (control numérico por ordenador) mecanizado con el PC (policarbonato). La velocidad de rotación del motor se controla de 200 a 4.500 rpm mediante la codificación de un algoritmo PID (proporcional-integral-derivado) basado en la modulación de ancho de pulso. Sus dimensiones son de 100 mm x 100 mm x 150 mm y pesa 860 g, por lo que es fácil de manejar. Usando el sistema CMS, los esferoides se pueden generar bajo diversas condiciones de gravedad de 1 x g a 521 x g,por lo que el estudio de la promoción de la diferenciación celular bajo alta gravedad se puede extender de las células 2D16,17 a 3D Esferoide. La cocultura de varios tipos de células es también una tecnología clave para imitar eficazmente el entorno in vivo18. El sistema CMS puede generar fácilmente esferoides de monocultivo, así como esferoides de cocultura de varios tipos de estructura (por ejemplo, concéntrico, janus y sándwich). El sistema CMS se puede utilizar no sólo en estudios simples de esferoides, sino también en estudios de organoides 3D, para considerar las estructuras de órganos humanos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabricación de chips de cultivo de esferoides (CMS) de base microfluídica centrífuga

  1. Haga moldes de PC para las capas superior e inferior de la viruta de cultivo CMS mediante mecanizado CNC. Las dimensiones detalladas del chip se indican en la Figura 1.
  2. Mezcle la base PDMS y el agente de curado PDMS con una proporción de 10:1 (p/p) durante 5 min y colóquelo en un desecador durante 1 h para eliminar las burbujas de aire.
  3. Después de verter la mezcla PDMS en los moldes del chip de cultivo CMS, retire las burbujas de aire durante 1 h más y cure en una cámara de calor a 80 oC durante 2 h.
  4. Colóquelos en el limpiador de plasma aspirado con las superficies a unir hacia arriba y expongalas al plasma asistido por aire a una potencia de 18 W durante 30 s.
  5. Unir las dos capas del chip de cultivo CMS y colocarlo en la cámara de calor a 80 oC durante 30 minutos para aumentar la resistencia a la adhesión.
  6. Esterilice el chip de cultivo CMS en un esterilizador de autoclave a 121 oC y 15 psi.

2. Preparación celular

  1. Descongelar el 1 ml del vial que contiene 5 x 105–1 x 106 hASCs o células MRC-5s en un baño de agua a 36,5 oC durante 2 min.
  2. Añadir 1 ml del medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco a un vial y mezclar suavemente con una pipeta de 1.000 ml.
  3. Poner 15 ml del DMEM precalentado a 36,5 oC en una placa Petri de 150 mm de diámetro utilizando una pipeta y añadir las células del vial.
  4. Después de 1 día, aspirar el DMEM y reemplazar con 15 mL de DMEM fresco. Posteriormente, cambie el soporte cada 2 o 3 días.
  5. Para separar las células de la placa Petri, añadir 4 ml de trippsina a los platos de Petri y colocarlas en una incubadora a 36,5 oC y 5% de CO2 durante 4 min.

3. Formación de esferoides monocultivos

  1. Poner 2,5 ml de solución pluronica F-127 del 4% (p/v) en el orificio de entrada del chip de cultivo CMS(Figura 2A)mientras gira el chip a 500–1.000 rpm y luego gire el chip a 4.000 rpm durante 3 minutos utilizando el sistema CMS(Figura 2B).
    NOTA: El recubrimiento pluónico evita la fijación celular al puerto de entrada mientras el chip gira. Asegúrese de que el aire no quede atrapado en los micropozos.
  2. Incubar el chip de cultivo CMS lleno de solución pluronica durante la noche a 36,5 oC en 5% de CO2.
  3. Retire la solución pluronic, lave la solución pluronica restante con DMEM y seque el chip durante 12 h en un banco limpio.
  4. Añadir 2,5 ml de DMEM al chip de cultivo CMS y girar el chip a 4.000 rpm durante 3 minutos para prehumedecer el interior del chip.
  5. Detenga la rotación y extraiga 100 ml de DMEM para dejar espacio para inyectar la suspensión celular.
  6. Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan 5 x 105 hASCs o 8 x 105 MRC-5s mediante pipeteo Distribuir uniformemente las células mediante pipeteo de 3 a 5x para la resuspensión.
  7. Gire el chip a 3.000 rpm durante 3 minutos para atrapar las células de cada micropozo por fuerza centrífuga.
    NOTA: La velocidad de rotación excesiva puede provocar el escape de la célula a través de orificios de eyección de la solución.
  8. Cultivo de las células durante 3 días en la incubadora a 36,5 oC, >95% de humedad y 5% CO2,girando a 1.000-2.000 rpm. Cambiar el medio cultural todos los días.

4. Formación de esferoides de cocultura

  1. Formación de esferoides concéntricos
    1. Agregue las primeras celdas, 2,5 x 105 hASCs, y gire el chip a 3.000 rpm. Después de 3 min, agregue las segundas celdas, 4 x 105 MRC-5s, y gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min. Inyecte un total de 100 l de suspensiones celulares pipeteando. Cuando se inyectan las células, cambie la velocidad de rotación a 500-1.000 rpm.
    2. Cultivo de las células en la incubadora a 36,5 oC, >95% humedad%, y 5% CO2 girando a 1.000–2.000 rpm. Los esferoides concéntricos se crean dentro de 24 h. Para la cultura a largo plazo, cambie el medio cultural cada día.
  2. Formación de esferoides de Janus
    1. Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan las primeras células, 2,5 x 105 hASC, pipeteando mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.
    2. Incubar el chip a 36,5 oC, >95% de humedad y 5% de CO2 girando a 1.000–2.000 rpm durante 3 h.
    3. Añadir 100 l de las suspensiones de células que contienen el segundo conjunto de células, 4 x 105 MRC-5s, mediante pipeteo mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.
    4. Cultivo de las células en la incubadora a 36,5 oC, >95% de humedad y 5%co2 girando a 1.000–2.000 rpm. Los esferoides de Janus se crean dentro de 24 h. Para la cultura a largo plazo, cambie el medio cultural cada día.
  3. Formación de esferoides sándwich
    1. Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan las primeras células, 1,5 x 105 hASC, pipeteando mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.
    2. Incubar el chip a 36,5 oC, >95% de humedad y 5% de CO2 girando a 1.000–2.000 rpm durante 3 h.
    3. Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan las segundas células, 3 x 105 MRC-5s, pipeteando mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.
    4. Incubar el chip a 36,5 oC, >95% de humedad%, y 5% CO2 girando a 1.000–2.000 rpm durante 3 h.
    5. Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan las terceras células, 1,5 x 105 hASC, pipeteando mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.
    6. Cultivo de las células en la incubadora a 36,5 oC, >95% humedad%, y 5% CO2 girando a 1.000–2.000 rpm. Los esferoides sándwich se crean dentro de 12 h. Para la cultura a largo plazo, cambie el medio cultural cada día.

5. Tinción celular

  1. Calentar el tinte de fluorescencia celular a temperatura ambiente (20 oC).
  2. Añadir 20 ml de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) por vial para hacer una solución de 1 mM.
  3. Diluir la fluorescencia a una concentración de trabajo final de 1 M utilizando DMEM.
  4. Agregue la fluorescencia a la suspensión celular y resuspenda suavemente con una pipeta.
  5. Incubar 20 min a 36,5oC, humedad de >95%, y 5%CO2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El chip de cultivo CMS de 6 cm de diámetro(Figura 2)se hizo con éxito siguiendo el protocolo anterior. En primer lugar, el chip se hizo por separado de una capa superior y una capa inferior y luego unido por unión por plasma. Los esferoides resultantes se pueden recoger fácilmente desplazándose el chip. El canal del chip de cultivo CMS comprende un puerto de entrada y regiones centrales, de diapositivas y de micropozos(Figura 3). Las soluciones celular, media y pluronic se inyectan a través de un orificio de entrada con un diámetro de 5 mm. Las células inyectadas se distribuyen uniformemente por resuspensión 3-5x en la región del puerto de entrada. Las células se someten a fuerza centrífuga en la región central y se extienden hacia afuera. Debido a que la región central es más alta que el micropozo, puede contener más medios, lo que permite que los esferoides sobrevivan más tiempo. La altura del micropozo es de 0,4 mm y la altura de la región central es de 1,5 mm. Los orificios de aspiración están presentes en el centro de la región central para eliminar fácilmente las soluciones internas. La región de deslizamiento es una zona inclinada que conecta la región central y la región micropozo. Las células se mueven a lo largo de una pendiente de 45o y se asientan en la región de micropozo, donde las células se asientan, crecen y se enredan para formar esferoides. Los micropozos situados a 14 mm del centro de la viruta son semicilíndricos con una altura de 400 m y un diámetro de 400 m. Un total de 100 esferoides se pueden generar simultáneamente en 100 micropozos.

Usando el chip CMS preparado, los esferoides se pueden generar en el orden mostrado en el protocolo(Figura 4). Se generaron esferoides monocultivos y cocultivos con células hASC y MRC-5. Para generar un esferoide monocultivo de cada tipo de célula, se inyectaron 5 x 105 hASC s o 8 x 105 MRC-5. El número de células inyectadas era independiente del tamaño de la célula. Las imágenes de lapso de tiempo de ambos tipos de células se tomaron a 2.000 rpm hasta el día 3 del cultivo celular (Figura 5). También se generaron esferoides de cocultura de hASCy MRC-5 con estructuras concéntricas, janus y sándwiches. Para hacer esferoides concéntricos, se inyectaron las primeras células (2,5 x 105 hASC) y se inyectaron las segundas células (4 x 105 MRC-5s) 3 minutos más tarde(Figura 6A). Cuando se inyectaron las primeras células, se convirtieron en forma de U debido a la alta gravedad, y cuando se inyectaron las segundas células, se movieron a la mitad de la forma de U. Con el tiempo, las primeras células en forma de U rodearon las segundas células y completaron los esferoides concéntricos. Para hacer esferoides de Janus, se inyectaron las primeras células (2,5 x 105 hASCs) y se inyectaron las segundas células (4 x 105 MRC-5s) 3 h más tarde(Figura 6B). Cuando el intervalo de inyección entre las dos celdas era largo, la forma de las primeras celdas cambió de una forma de U a una forma elíptica por agregación de celdas. Una vez que las segundas células se agregaron a la forma elíptica de las primeras células, se generaron los esferoides de Janus. En el caso de los esferoides sándwich, se inyectaron las primeras células (1,5 x 105 hASCs), se inyectaron las segundas células (3 x 105 MRC-5s) 3 h más tarde, y las terceras células (1,5 x 105 hASC) se inyectaron después de otras 3 h(Figura 6C) ). De forma similar al esferoide de Janus, cada celda se agrega en forma elíptica y las tres capas apiladas para generar esferoides sándwich. Por último, para demostrar la capacidad de cultivo a largo plazo del CMS, se cultivaron los HASC, expuestos a alta gravedad durante 7 días seguidos de un ensayo vivo/muerto realizado para mostrar que la mayoría de las células sobrevivieron(Figura 7). Además, las fotos de todos los micropozos del CMS fueron tomadas después de 3 días de cultivo MRC-5s para mostrar una excelente uniformidad y esfherición de esferoides(Figura 8).

Figure 1
Figura 1: Dimensiones de las capas superior e inferior de un chip de cultivo CMS. El molde de PC se hizo utilizando una máquina CNC y se replicó con PDMS para hacer un chip de cultivo CMS basado en el dibujo creado por un programa CAD 3D (diseño asistido por ordenador). Los cuatro círculos en los bordes de las capas superior e inferior son para alinear las dos capas. Las dimensiones están en milímetros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Fotografías del sistema CMS. (A) Fotografías del chip de cultivo CMS completado. El diámetro de la viruta es de 6 cm y el diámetro del micropozo es de 400 m. Los números por encima de los micropozos representan los números individuales de los micropozos de 1 a 100. Estos números fueron grabados en el molde. Barra de escala a 400 m. (B) Fotografía de todo el sistema CMS. El sistema CMS comprende el chip de cultivo CMS, el soporte de viruta, el motor de CC y la plataforma giratoria. Los dispositivos CMS pueden generar condiciones de gravedad de hasta 521 x g a través de la fuerza de rotación. El soporte de viruta evita la separación del chip de cultivo CMS debido a la alta gravedad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Componentes de canal del CMS. (A) Imágenes esquemáticas y (B) fotografías de una sección transversal del chip de cultivo CMS. El chip de cultivo CMS consta de un puerto de entrada y regiones centrales, de diapositivas y de micropozos. Debido a que las células inyectadas no pasan a través de la barrera a una velocidad de rotación de menos de 1.000 rpm, la barrera ayuda en la resuspensión de la célula e incluso la distribución al micropozo. Barra de escala de 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Proceso de carga de celdas en el chip de cultivo CMS. (A) Para evitar que las células se peguen a la parte inferior de la viruta, cubra con 2,5 ml de la solución pluronic F-127 a 4.000 rpm. Espere un día hasta que se aplique el recubrimiento. (B) Retire la solución pluronic y rellene previamente el canal con 2,5 ml del medio DMEM. (C) Retire 100 sL del DMEM y agregue 100 l de suspensión celular. En este momento, resuspenda de 3 a 5 veces para que las celdas se distribuyan uniformemente. (D) Mueva las células al micropozo girando el chip y luego comruye las células durante 3 días a 1.000 a 2.000 rpm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Fotografía de lapso de tiempo de esferoides monocultivos de células hASC y MRC-5. Las células se cultivaron durante 24 h a 2.000 rpm. El esferoide se generó dentro de 24 h. Barra de escala de 400 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Imágenes de fluorescencia de esferoides de cocultura. (A) Formas esferoides concéntricas en las que las células hASC (verdes) rodean las células MRC-5 (rojo). (B) Forma esferoide de Janus en la que dos células son simétricas. (C) Forma de esferoides de sándwich en la que las capas hASC se apilan entre dos capas MRC-5. Barra de escala a 400 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Ensayo vivo/muerto de hASC el día 7. El color fluorescente verde representa las células vivas y el color fluorescente rojo representa las células muertas. Barra de escala a 400 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Esferoides MRC-5 el día 3. Un número relativamente constante de células ingresan cada micropozo y forman esferoides con esfrocidad relativamente constante en el sistema CMS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Cosecha de esferoides. Los esferoides cultivados se pueden cosechar dividiendo las dos capas del chip de cultivo CMS. Las dos capas unidas por plasma se pueden separar fácilmente a mano. Luego, los esferoides se recogen de los micropozos en la capa inferior simplemente pipeteando. Barra de escala a 400 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El CMS es un sistema cerrado en el que todas las células inyectadas entran en el micropozo sin residuos, haciéndolo más eficiente y económico que los métodos convencionales de generación de esferoides basados en micropozos. En el sistema CMS, el medio se reemplaza cada 12-24 h a través de un orificio de aspiración diseñado para quitar el medio en el chip(Figura 3A). Durante el proceso de succión de medios, apenas cualquier medio escapa del interior del micropozo debido a la tensión superficial entre el medio y la pared del micropozo. Un usuario puede eliminar fácilmente el medio atrapado presionando cerca de la región micropozo del chip con un dedo, porque el chip hecho de PDMS es elástico y flexible. Las células del micropozo permanecen estables sin escapar, incluso con múltiples cambios en los medios. Para lograr la misma calidad de esferoide en los 100 micropozos, la rotación del dispositivo no debe ser excéntrica, y el chip debe ser axisimétrico. De lo contrario, un número variable de celdas puede ingresar cada pocea y el tamaño y la forma del esferoide podrían diferir. En el sistema de micropozo convencional, debido a que el aire a menudo está atrapado en el micropozo, es necesario eliminar las burbujas de aire. Sin embargo, el sistema CMS no requiere el proceso de eliminación de burbujas porque la alta fuerza centrífuga generada por la rotación hace que los medios empujen las burbujas y las expriman de los micropozos.

El sistema CMS también tiene sus limitaciones en comparación con los métodos convencionales. El sistema CMS requiere un mayor espacio de cultivo (por ejemplo, un gran espacio de incubadora), ya que comprende un motor, una plataforma giratoria y un controlador, y su tamaño total es de aproximadamente 100 mm x 100 mm x 150 mm(Figura 2B). Además, causa una ligera pero persistente vibración. Esperamos que la miniaturización del sistema (esperemos que sea similar al tamaño de 6 placas de pozos) resuelva estos problemas.

Cabe señalar que los esferoides cultivados se pueden recoger separando las dos capas de plasma del sistema CMS(Figura 9). La unión de las dos capas es lo suficientemente fuerte como para evitar que los medios se filtren durante el funcionamiento del sistema. Sin embargo, debido a la pequeña zona de unión, es separable a mano. Los esferoides se pueden recoger simplemente de la capa inferior mediante pipeteo.

El sistema CMS tiene mejor reproducibilidad y productividad que los métodos convencionales de generación de esferoides. Los métodos convencionales, como los métodos normales de micropozo o gotas colgantes, son intensivos en mano de obra. Sin embargo, en el sistema CMS, es mucho más fácil aumentar el número de esferoides simplemente aumentando el tamaño del chip. Con este dispositivo, también es posible generar organoides que requieren cultivo de tipos multicelulares, lo que no es fácil de hacer en los métodos de cultivo convencionales. Además de las células en este estudio (hASC y MRC-5), CMS podría ser utilizado para la producción de esferoides utilizando varios otros tipos de células que pueden formar esferoides.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación científica básica (2016R1D1A1B03934418) y el Programa de Desarrollo de Bio y Tecnología Médica (2018M3A9H1023141) de la NRF, y financiado por el gobierno coreano, MSIT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230, (1), 16-26 (2015).
  2. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136, (3), 473-478 (2011).
  3. Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41, (7), 2980-2984 (1981).
  4. Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297, (2), 415-423 (2004).
  5. Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
  6. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  7. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  8. Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
  9. Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14, (1), 105 (2014).
  10. Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87, (2), 922-928 (2015).
  11. Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
  12. Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
  13. Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86, (22), 11349-11356 (2014).
  14. Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10, (14), 1758-1773 (2010).
  15. Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9, (4), (2017).
  16. Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
  17. Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
  18. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32, (8), 760-772 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics