In vivo augmentation av Gut-homing reglerande T-cell induktion

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för in vivo förstoring av Gut-homing reglerande T cell induktion. I detta protokoll är dendritiska celler konstruerade för att lokalt producera höga koncentrationer av den aktiva vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D eller 1,25 [OH]2d) och den aktiva vitamin a (retinoic syra eller ra) de Novo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bi, H., Wasnik, S., Baylink, D. J., Liu, C., Tang, X. In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction. J. Vis. Exp. (155), e60585, doi:10.3791/60585 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) är en inflammatorisk kronisk sjukdom i magtarmkanalen (GUT). I USA, det finns cirka 1 400 000 IBD patienter. Det är allmänt accepterat att ett dysreglerat immunsvar mot tarmbakterier initierar sjukdomen och stör slemhinnor epitelial barriären. Vi visar nyligen att Gut-homing reglerande T (Treg) celler är en lovande terapi för IBD. I denna artikel presenteras därför ett protokoll för in vivo-förstärkning av Treg-cellinduktion i tarmen. I detta protokoll är dendritiska celler konstruerade för att producera lokalt höga koncentrationer av två molekyler de Novo, aktiv D-vitamin (1,25-dihydroxyvitamin D eller 1,25 [OH]2d) och aktiv vitamin a (retinoic syra eller ra). Vi valde 1,25 (OH)2d och ra baserat på tidigare fynd som visar att 1,25 (OH)2d kan inducera uttrycket av regulatoriska molekyler (t. ex. Forkhead Box P3 och interleukin-10) och att ra kan stimulera uttrycket av Gut-homing-receptorer i T-celler. För att generera sådana konstruerade dendritiska celler, använder vi en lentiviral vektor för att transduce dendritiska celler att överuttrycka två gener. En gen är cytokrom P450-familjen 27 underfamiljen B-medlem 1 som kodar för 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase, som fysiologiskt katalyserar syntesen av 1,25 (OH)2D. Den andra genen är aldehydehydrogenas 1 familjemedlem a2 som kodar retinaldehydehydrogenas 2, som fysiologiskt katalyserar syntesen av RA. Detta protokoll kan användas för framtida utredning av Gut-homing Treg celler in vivo.

Introduction

Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) är en inflammatorisk kronisk sjukdom i magtarmkanalen (GUT). I USA, det finns cirka 1 400 000 IBD patienter. Det är allmänt accepterat att ett dysreglerat immunsvar mot tarmbakterier initierar sjukdomen och stör slemhinnor epitelial barriär1,2. Av denna anledning, för närvarande tillgängliga amerikanska Food and Drug Administration (FDA)-godkända läkemedel hämmar funktionerna av inflammatoriska mediatorer eller blockera homing av immunceller i tarmen. Men de inflammatoriska mediatorer och immunceller som är riktade är också nödvändiga för immunförsvaret. Som ett resultat, den inflammatoriska medlaren inhibitorer kompromiss system immunförsvaret och immunceller homing blockerare försvaga Gut immunförsvaret, som båda kan leda till allvarliga konsekvenser3,4. Dessutom kan immun cells homing blockerare blockerar också homing av reglerande T (Treg) celler i tarmen och därmed kan förvärra redan äventyras Gut immuntolerans hos IBD patienter. Dessutom, blockering av Treg cell homing i tarmen kan också leda till systemisk immunsuppression på grund av ansamling av Treg celler i blodet5. Slutligen, hämmare och blockerare funktion transitivt och, därmed, kräver täta administrationer. Frekvent administrering av dessa hämmare och blockerare kan ytterligare förvärra ogynnsamma biverkningar.

Nyligen föreslog vi en ny strategi som potentiellt kan mildra eller till och med eliminera de biverkningar som förknippas med nuvarande läkemedel för IBD behandling6. Denna strategi förstärker induktion av Gut-homing Treg celler i perifera lymfoida vävnader6. Den logiska grunden för denna strategi är att Gut-homing Treg celler specifikt hem till tarmen och därmed kommer inte att äventyra systemiskt immunförsvar. Dessutom, eftersom Treg celler potentiellt kan bilda minne7,8, Gut-homing Treg celler kan potentiellt ge en stabil kontroll av kronisk tarminflammation i IBD patienter och därmed, behandling bör inte behöva administreras så ofta. Dessutom, eftersom denna strategi förstärker induktion av Gut-homing Treg celler in vivo, det har inte oron för in vivo instabilitet i en mycket proinflammatorisk miljö som är associerad med adoptiv överföring av in vitro-genererade Treg celler9,10. I detta avseende, in vitro-genererade Treg celler är en av de föreslagna strategierna för behandling av autoimmuna sjukdomar11,12,13 och transplantatavstötning14,15. Slutligen, i denna strategi, dendritiska celler (DCs) är konstruerade för att producera lokalt höga koncentrationer av två molekyler de Novo: aktiv vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D eller 1,25 [OH]2d) och aktiv vitamin a (retinoic syra eller ra). Vi valde 1,25 (OH)2d och ra eftersom 1,25 (OH)2d kan inducera uttrycket av regulatoriska molekyler (t. ex., forkhead Box P3 [FoxP3] och interleukin-10 [Il-10])16,17 och att ra kan stimulera uttrycket av Gut-homing receptorer i T-celler18. Eftersom både 1,25 (OH)2D och ra kan också tolerize DCS28,29, vi anledning att de konstruerade DCS kommer att stabilt upprätthållas i en tolerogen status in vivo och därmed kringgå in vivo instabilitet oro som är förknippade med in vitro genererade tolerogena DCS (toldcs)19,20,21. I detta avseende är toldcs också en av de föreslagna strategierna för in vivo förstoring av Treg cellfunktioner19,20,21. För att stödja vårt resonemang har vi visat att de konstruerade DCs, på in vivo leverans, kan öka induktion av Gut-homing Treg celler i perifera lymfoida vävnader6.

En ytterligare fördel med vår föreslagna strategi är att 1,25 (OH)2D också har andra funktioner som potentiellt kan gynna IBD patienter. Dessa andra funktioner inkluderar möjligheten att 1,25 (OH)2D för att stimulera utsöndringen av antimikrobiella medel22 och för att undertrycka carcinogenes23. Infektioner och cancer är ofta förknippade med IBD24,25.

För att generera DCs som kan producera lokalt höga koncentrationer av både 1,25 (OH)2D och ra de Novo, använder vi en lentiviral vektor för att konstruera DCS att överuttrycka två gener. En gen är cytokrom P450-familjen 27 underfamiljen B-medlem 1 (CYP27B1) som kodar för 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylas (1α-hydroxylase), som fysiologiskt katalyserar syntesen av 1,25 (OH)2d. Den andra genen är aldehydehydrogenas 1 familjemedlem a2 (ALDH1a2) som kodar retinaldehydehydrogenas 2 (RALDH2), som fysiologiskt katalyserar syntesen av RA6.

Eftersom in vivo förstoring av Gut-homing Treg cell induktion är potentiellt viktigt vid behandling av IBD, i följande protokoll kommer vi att specificera de förfaranden för generering av 1α-hydroxylase-RALDH2-överuttryck DCS (DC-CYP-aldh celler) som kan användas för framtida utredning av Gut-homing Treg celler in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla in vivo djurstudie protokoll granskades och godkändes av Loma Linda University institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) samt djuromsorg och använda Review Office (ACURO) av US Army medicinsk forskning och materiel Command (USAMRMC) av Försvarsdepartementet.

1. beredning av lentivirus som uttrycker både 1 α-hydroxylase och RALDH2 (lenti-CYP-ALDH-virus)

  1. Dag 0: i den tidiga morgonen, Förbered 5 x 105 celler/ml 293T celler i cm-10-D cell odlingssubstrat.
  2. Utsäde 20 mL/plåt i 150 mm x 25 mm kultur rätter. Odla cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för 24 h. confluency kommer att nå ~ 80-90% efter 24 h.
  3. Dag 1: gör 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, och 1,5 mM na2HPO4, pH 7,1). Och förvara vid-20 ° c.
  4. Gör 2 M CaCl2 och förvara i rumstemperatur.
  5. För varje 150 mm x 25 mm odlings fat, Förbered en DNA-utfällning blandning i en steril 50 mL odlings rör. Först, tillsätt 1 620 μL av 2x HBS, 9,5 μg PMD2G (VSVG), 17,5 μg pCMVR 8.74 (Capsid), 27 μg lenti-CYP-ALDH plasmid (en lentiviral vektor som bär både CYP27B1 och ALDH1a2). För det andra, tillsätt H2O till en slutlig volym på 3 037,5 μl.
  6. I sista, tillsätt 202,5 μl av 2 M CaCl2 droppvis samtidigt blanda lösningen till slutliga koncentrationer av 1x HBS och 125 mm CaCl2. CaCl2 måste vara den sista som ska läggas till. Lämna transfektion blandningar vid rumstemperatur i 20 min med enstaka blandning. För flera 150 mm x 25 mm kultur rätter, skala upp därefter.
  7. Tillsätt 3 240 μl DNA-fällnings blandning droppvis till 1 150 mm x 25 mm kultur rätt som innehåller 293t-cellerna. Snurra försiktigt kultur skålen sida till sida medan du lägger till DNA-nederbörden blandningen. Inkubera skålen vid 37 ° c och 5% CO2 för 24 h.
  8. Dag 2: ta bort kalciumfosfat transfektion lösning, tvätta försiktigt med 1x PBS, och föda upp cellkulturen med CM-4-D cellkulturmedium. Inkubera cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för 24 h.
  9. Dag 3: skörda supernatanterna i sterila förvaringsflaskor och förvara vid 4 – 8 ° c. Fylla cellkulturen med färskt CM-4-D cell odlingssubstrat. Odla cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för ytterligare 24 h.
  10. Dag 4: skörda supernatanterna i sterila förvaringsflaskor. Filtrera supernatanterna från dag 3 och dag 4 genom ett filter på 0,45 μm. För att koncentrera vsvg pseudotyp virus, överföra samman supernatanterna till Centrifugera rör och snurra på 4 780 x g för 24 h vid 4 ° c.
  11. Dag 5: Häll supernatanterna från pellets (pelleten är ofta synlig) och låt rören rinna på en pappershandduk i ett sterilt biosäkerhetsskåp i flera minuter.
  12. Omsuspendera pelletar genom pipettering med steril PBS innehållande 5% glycerol. Volymen för resuspension kommer att vara 33,3 μL per 150 mm x 25 mm kultur rätt.
  13. Ali quot 200 μL/rör och förvara vid-80 ° c. Gör en separat alikvot på 50 μL/injektionsflaska i titreringssyfte. Titrar bör vara inom intervallet 108– 109 transducing enheter (TUS)/ml.
  14. Lägg blekmedel i kulturen rätter och kasta dem.
    Obs: dessa transfekterade celler är den största säkerhetsproblem i protokollet eftersom alla lentivirala element uttrycks i cellerna.

2. generering av Benmärgshärledda DCs (BMDCs)

  1. Harvest förbenade och lårben från 4 till 5 Balb/c möss i en 50 ml sterilt Polypropenrör som innehåller kultur medium6.
  2. Överför förbenade och femurer till en 100 mm x 20 mm kultur rätt som innehåller odlingsmediet. Ta bort vävnader som muskler från förbenade och femurer med hjälp av dissekera sax och tång.
  3. Skär båda ändarna av förbenade och femurer för att exponera benmärgs hålan.
  4. Rita 10 mL odlingssubstrat i en 10 mL spruta fäst på en 30 G nål.
  5. Stick försiktigt in nålen i benmärgens hålighet och skölj benmärgen i ett rent 50 mL sterilt Polypropenrör. Upprepa denna procedur om det behövs, för att säkerställa att benmärgen har helt spolas ut.
  6. Pelleten benmärgscellerna genom centrifugering (400 x g) vid 2 – 8 ° c i 5 min. aspirera på supernatanten.
  7. Omsuspendera pelleten med 5 mL 1x röd blodcell lysbuffert.
  8. Inkubera cellerna i rumstemperatur i 4 – 5 minuter med enstaka skakningar.
  9. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 30 mL odlingssubstrat.
  10. Pelleten cellerna genom centrifugering (400 x g) vid 2 – 8 ° c i 5 min. Omsuspendera cellerna i 10 ml cm-10-R cell odlingssubstrat. Om det behövs, kan cellerna överföras genom en 40 μm cell sil för att ta bort skräp.
  11. Utför ett cellantal och justera cellerna till 1 x 106 celler/ml med hjälp av cm-10-R cellodlingsmedium.
  12. Tillsätt rekombinant murin granulocyt/makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF, slutlig koncentration = 100 U/mL) och murin interleukin-4 (IL-4, slutlig koncentration = 10 U/mL).
    Anmärkning: Stamlösningarna av GM-CSF och IL-4 lagras vid-80 ° c vid 100 000 U/mL (1000X) och 10 000 U/mL (1000X), respektive.
  13. Fördela cellerna i 6 väl kultur plattor på 4 mL/brunn och odla cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för 48 h.
  14. Ta bort nonadherent-celler med skonsam pipettering.
  15. Tillsätt färskt CM-10-R cell odlingssubstrat innehållande GM-CSF (100 U/mL) och IL-4 (10 U/mL). Odla cellerna för en annan 48 h.
  16. Skörda nonadherent celler (BMDCs) för transduktion av lenti-CYP-ALDH-viruset.

3. transduktion av DCs med lenti-CYP-ALDH-virus för att generera DC-CYP-ALDH-celler

  1. Förbered 1 x 106 DCS/well i en total volym på 0,5 ml av cm-10-R cellodlingsmedium innehållande 50 μl virus och 8 μg/ml Protamin i en 6 brunn kultur tallrik.
  2. Odla cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för 24 h.
  3. Byt ut mediet med färskt CM-10-R cellkulturmedium och odla cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för ytterligare 24 h. Vid denna tidpunkt kan enzymatiska aktiviteter av 1 α-hydroxylase och RALDH2 utvärderas (se steg 4). Om det behövs upprepar du steg 3.1 – 3.3 för en andra transduktion.
  4. Tillsätt lipopolysackarid (100 ng/mL) och odla cellerna i 24 timmar.
  5. Skörda cellerna (DC-CYP-ALDH-celler) för experiment.

4. utvärdering av den Överuttryckta 1α-hydroxylase och RALDH2 i DC-CYP-ALDH-celler

  1. Utvärdering av den överuttryckta 1α-hydroxylasen i DC-CYP-ALDH-celler
    1. Utsäde 1,0 x 106 DC-CYP-aldh celler/väl i 2 ml cm-10-R cellkulturmedium i 12 väl kultur tallrikar.
    2. Tillsätt 25 (OH) D till den slutliga koncentrationen av 2,5 μM. Inkubera DC-CYP-ALDH-cellerna i 24 timmar.
    3. Skörda supernatanterna och förvara vid-20 ° c.
    4. Test för 1,25 (OH)2D koncentrationer i supernatanterna med hjälp av en kommersiellt tillgänglig eller (RIA) (se tabell över material).
    5. Bestäm uttrycket av 1 α-hydroxylase i DC-CYP-ALDH-celler med fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) med en anti-CYP27B1 antikropp.
  2. Utvärdering av den överuttryckta RALDH2 i DC-CYP-ALDH-celler
    Anmärkning: uttrycket och aktiviteten av den överuttryckta RALDH2 bestäms med hjälp av en kommersiell aldehydehydrogenas (ALDH) Detection Kit (se tabell över material).
    1. Utsäde 1 mL av DC-CYP-ALDH eller kontrollceller (1 x 105 celler/ml i analysbuffert) i vardera av två 5 ml-rör (en märkt som "kontroll" och den andra märkt som "test").
    2. Tillsätt 10 μL dietylaminobenzaldehyd (DEAB) lösning (1,5 mM i 95% etanol) till var och en av kontroll rören och blanda omedelbart. DEAB är en RALDH2-hämmare.
    3. Tillsätt 5 μL aktivt RALDH-fluorescenssubstrat (300 μM) till kontroll-och provrör och blanda omedelbart.
    4. Inkubera rören för 45 min.
    5. Pelleten cellerna genom centrifugering vid 400 x g vid 2 – 8 ° c i 5 min. aspirera på supernatanterna.
    6. Rekonstituera cellerna i 200 μL analysbuffert.
    7. Håll cellerna på isen och gå vidare för analys av FACS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DC-CYP-ALDH-celler uttryckte signifikant ökad mängd 1 α-hydroxylas. För att avgöra om DC-CYP-ALDH-celler genererade från BMDCs uttryckte en signifikant ökad mängd 1 α-hydroxylas, var BMDCs omvandlades med lenti-CYP-aldh-viruset för att framställa benmärgshärledda DC-CYP-ALDH-celler (BMDC-CYP-ALDH-celler). Därefter undersöktes BMDC-CYP-ALDH-cellerna för uttrycket av 1 α-hydroxylas av FACS. Våra data visade att BMDC-CYP-ALDH-cellerna, jämfört med föräldrarnas BMDCs, uppvisade förbättrat uttryck för 1 α-hydroxylas (figur 1A). Vi bestämde också den enzymatiska aktiviteten hos 1 α-hydroxylase i BMDC-CYP-ALDH-cellerna. För att göra detta, 1,0 x 106 bmdc-CYP-aldh celler i 2 ml cm-10-R cell odlingssubstrat lades till 12 well kultur tallrikar. 25 (OH) D lades sedan till cellkulturen vid den slutliga koncentrationen av 2,5 μM. Cellerna var odlade vid 37 ° c och 5% Co2 för 24 h och samman supernatanterna skördades för mätning av 1,25 (OH)2D med hjälp av en eller (RIA). Våra data visade att 1,25 (OH)2D-koncentrationer i de kultursupernatanter som bmdc-CYP-cellerna (bmdcs sensorik med lenti-CYP-GFP-virus) och bmdc-CYP-aldh-cellerna var ungefär 20 x högre än hos bmdcs och bmdc-aldh-cellerna (bmdcs som omvandlades med lenti-aldh-virus) (figur 1B).

DC-CYP-ALDH-celler uttryckte signifikant ökad mängd RALDH2. För att avgöra om BMDC-CYP-ALDH-celler uttryckte en signifikant ökad mängd RALDH2, lades ett RALDH2 substrat in i cellkulturerna i närvaro eller frånvaro av RALDH2-hämmaren dietylaminobenzaldehyd (DEAB) (15 μM). Den fluorescerande produkt som behålls inne i cellerna analyserades av FACS. Våra data visade att medelvärdet för fluorescensintensitet (MFI) i BMDC-CYP-ALDH-cellerna var ungefär 6x högre än för föräldrarnas BMDCs, vilket tyder på att BMDC-CYP-ALDH-cellerna, jämfört med föräldrarnas BMDCs, uttryckte signifikant förbättrad RALDH2 enzymatisk aktivitet (figur 2A,B).

DC-CYP-ALDH celler förstärkt induktion av FoxP3+CCR9+ Gut-homing Treg celler in vitro-. För att undersöka om DC-CYP-aldh-celler kunde förstärka induktionen av Gut-homing-Treg-celler in vitro, omvandlades vi DC 2.4-celler (en benmärg-härledd DC-linje26,27,28,29), med lenti-CYP-aldh-virus och genererade DC 2.4-CYP-aldh-celler. Därefter, vi bestämde om DC 2.4-CYP-ALDH celler kunde öka induktion av Gut-homing Treg celler in vitro-. Följaktligen, naiva CD4+ T-celler renades från C57BL/6 möss. Renade naiva CD4+ T-celler vid 5 x 105 celler/väl var sedan coculodlas med antingen den förälder DC 2.4-celler (1 x 105 celler/brunn) eller DC 2.4-CYP-aldh celler (1 x 105 celler/brunn) i 24 väl odlings plattor i ett serumfritt medium i närvaro av en anti-CD3 monoklonal antikropp (5 μg/ml) och rekombinant human Il-2 (50 U/ml). Dessutom, 25 (OH) D och retinol vid olika koncentrationer lades också in i kulturerna. Cellerna inkuberades vid 37 ° c och 5% CO2. Fem dagar senare, cellerna analyserades av FACS för uttryck av FoxP3 och c-c Chemokine receptor typ 9 (CCR9). Våra data visade att i närvaro av substrat, DC 2,4-celler inte signifikant ändra överflödet av FoxP3+CCR9+ celler i CD4+ T cellpopulationer (figur 3A, B). Däremot, DC 2.4-CYP-ALDH celler avsevärt förbättrat överflödet av FoxP3+CCR9+ celler bland CD4+ T-celler. Dessutom, ju mer 25 (OH) D tillade, desto större förmåga DC 2.4-CYP-ALDH celler för att öka överflödet av FoxP3+CCR9+ celler bland CD4+ T-celler. Därför, vårt data stöd att DC-CYP-ALDH celler kan öka induktion av Gut-homing Treg celler in vitro-.

DC-CYP-ALDH-celler förstärkt induktion av FoxP3+CCR9+ Gut-homing Treg celler in vivo. För att avgöra om DC-CYP-aldh-celler kan öka induktionen av Gut-homing-Treg-celler in vivo, vi administrerade intraperitonealt en av följande celler i Balb/c möss: den förälder DC 2.4-celler, DC 2.4-CYP-celler (DC 2.4-celler sensorik med lenti-CYP-GFP-virus), och DC-2,4-CYP-aldh celler. Fyra dagar efter cell administrationen undersöktes mesenteriiska lymfkörtlar med FACS (figur 4A). Våra data visade att DC 2,4-CYP-ALDH-celler, jämfört med kontrollerna, signifikant ökade överflödet av FoxP3+CCR9+ celler bland CD3+ T celler (figur 4B, C). Baserat på dessa resultat, vi drar slutsatsen att DC-CYP-ALDH cell administration avsevärt förstärker induktion av FoxP3+CCR9+ T celler i perifera lymfoida vävnader.

Figure 1
Figur 1: DC-CYP-ALDH-celler uttryckte signifikant ökad mängd 1 α-hydroxylas. Abmdc-CYP-aldh-celler genererades och analyserades av FACS. En representativ FACS Plot visar uttrycket av 1 α-hydroxylase i föräldrarnas BMDCs och BMDC-CYP-ALDH celler (gated på levande celler). B) 1 α-hydroxylassubstrat (dvs. 25 (OH) D) sattes in i DC-kulturerna. 24 h senare, samman supernatanterna samlades och 1,25 (OH)2D koncentrationer mättes. Data visar koncentrationer på 1,25 (OH)2D i kulturerna i föräldrarnas BMDCs, BMDC-CYP-cellerna, BMDC-aldh-cellerna och BMDC-CYP-aldh-cellerna. * * p < 0,01. ANOVA-test. n = 4. Denna siffra är anpassad från Xu et al.6. Copyright 2019. Den amerikanska föreningen för immunolog, Inc. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: DC-CYP-ALDH-celler uttryckte signifikant ökad mängd RALDH2. Abmdc-CYP-aldh-celler genererades och analyserades enligt beskrivningen i protokollet. Representativa överlagda FACS tomter visar BODIPY aminoacetat fluorescens i BMDCs och BMDC-CYP-ALDH celler i närvaro (+ DEAB) eller frånvaro (-DEAB) av RALHD2 inhibitor dietylaminobenzaldehyde (DEAB). B) genomsnittliga fluorescensintensitet (MFI) av bodipy Aminoacetat i BMDCs och BMDC-CYP-aldh-cellerna i frånvaro av DEAB. * p < 0,05; t-test; n = 4. Denna siffra är anpassad från Xu et al.6. Copyright 2019. Den amerikanska föreningen för immunolog, Inc. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: DC-CYP-ALDH-celler förstärkt induktion av FoxP3+CCR9+ Gut-homing Treg celler in vitro-. (A) CD4+ naiva T-celler isolerades från C57BL/6 mus spleens. CD4+ T-celler aktiverades sedan i kulturer av en anti-CD3 MAB (5 μg/ml) i närvaro av antingen den förälder DC 2.4-celler eller DC 2.4-CYP-aldh celler. Dessutom var kulturerna tillsatta med de indikerade koncentrationerna av 25 (OH) D och retinol. Fem dagar senare, cellerna samlades in och analyseras av FACS för uttryck av FoxP3 och CCR9 i CD3+CD4+ T cellpopulation. Representativa FACS tomter visar uttrycken för FoxP3 och CCR9 i CD3+CD4+ T cellpopulationer. (B) kumulativa data från (a). * p < 0,05; ANOVA-test. n = 4. Denna siffra är anpassad från Xu et al.6. Copyright 2019. Den amerikanska föreningen för immunolog, Inc. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: DC-CYP-ALDH-celler förstärkt induktion av FoxP3+CCR9+ Gut-homing Treg celler in vivo. (A) Balb/c-möss intraperitonealt (i.p.) fick en av följande DC-överföringar (överföring): ingen DC-överföring (ingen överföring), föräldra-DC 2.4-celler, DC 2.4-CYP-celler och DC 2.4-CYP-aldh-celler. Fyra dagar senare analyserades mesenteriska lymfkörtlar (MLNs) av FACS. (B) representativa FACS tomter visar uttrycken för FOXP3 och CCR9 i CD3+ T cellpopulation. (C) kumulativa data från (B) visar andelen FoxP3+CCR9+ celler i CD3+ T cellpopulation. Celler var gated på CD3+ T celler för alla analyser. De presenterade uppgifterna är i tillämpliga fall medel ± SEM. * p < 0,05. ANOVA-test. n = 4 – 6. Denna siffra är anpassad från Xu et al.6. Copyright 2019. Den amerikanska föreningen för immunolog, Inc. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna artikel beskriver vi användningen av DC-CYP-ALDH celler, för att öka induktion av Gut-homing Treg celler i perifera lymfoida vävnader. Våra data har visat att DC-CYP-ALDH-cellerna kan syntetisera lokalt höga koncentrationer de Novo på både 1,25 (OH)2D och ra in vitro i närvaro av motsvarande substrat (dvs. 25 [Oh] D respektive retinol). Eftersom tillräckliga blodkoncentrationer av 25 (OH) D och retinol lätt kan uppnås genom vitamin D och en kompletteringar respektive hos patienter som har brister30,31, vi resonerar att DC-CYP-aldh celler kan öka induktion av Gut-homing Treg celler i perifera lymfoida vävnader när normala blodkoncentrationer av 25 (OH) D och retinol är närvarande. För att stödja detta resonemang, visar våra data att i normala friska djur som inte har vitamin D och vitamin A brister, DC-CYP-ALDH celler öka induktion av Treg celler som uttrycker både reglerande molekyler (dvs., FoxP3 och IL-10) och en Gut-homing receptor (dvs., CCR9). Därför kan denna teknik användas för ytterligare utredning av Gut-homing Treg celler för behandling av IBD.

Ett kritiskt steg i detta protokoll är produktionen av lenti-CYP-ALDH-virus med höga titrar. Rekommenderade virus titrar bör vara 108– 109 TUS/ml. En hög titer av lenti-CYP-ALDH-viruset är nödvändigt för en hög transduktionseffektivitet i DCs.

Ett annat kritiskt steg i detta protokoll är transduktionseffektiviteten i DCs. Eftersom DC-CYP-ALDH-celler inte toleriseras in vitro i denna teknik, är det viktigt att transduktionshastigheten vara mer än 90% för att säkerställa att DC-CYP-ALDH-cellerna effektivt kan öka induktionen av Gut-homing Treg-celler in vivo. Dessutom kan DC-CYP-ALDH-cellerna renas ytterligare genom FACS före in vivo-administrering32.

En unik fördel med detta protokoll är att DC-CYP-ALDH-cellerna inte behöver toleriseras in vitro före in vivo-administrering. Det förväntas att DC-CYP-aldh-cellerna, som ett resultat av de kombinerade åtgärderna av 1,25 (OH)2D och ra, kommer att bibehållas i en tolerogen status in vivo eftersom både 1,25 (OH)2D och ra har visats tolerize DCS33,34. Därför räknar vi med att DC-CYP-ALDH-cellerna inte kommer att ha instabilitet i en proinflammatorisk in vivo-miljö.

För närvarande, vi har bara visat att DC-CYP-ALDH celler kan öka frekvensen (antal) av Gut-homing Treg celler i perifera lymfoida vävnader och tarmarna6. Följaktligen, reglerande funktion i tarmen som helhet förstärks eftersom procent av Treg celler i tarmen ökas. Figur 4 visar att jämfört med dem med kontroll behandlingar ökade intraperitoneal behandling med DC-CYP-aldh-celler signifikant andelen CCR9+FoxP3+ Treg-celler i de mesenteriska lymfkörtlarna, vilket innebär att fler Treg-celler i de mesenteriska lymfkörtlarna kan specifikt hem i Tarmvävnaden. Figur 4 visar vidare att de flesta FoxP3+ T-celler i mesenteriska lymfkörtlar är negativa för CCR9 och därför inte har Gut-homing kapacitet. Men om DC-CYP-ALDH-celler också kan förbättra reglerings funktionen för varje Treg-cell i sig (t. ex. förhöjda uttrycks nivåer i FoxP3 och/eller IL-10) krävs ytterligare utredning.

De reagenser och material som beskrivs här är endast för djurstudier. Emellertid, protokollet är tillämplig för humanstudier med hjälp av motsvarande mänskliga reagenser och material, förutom att DCs kommer att genereras från perifera blod monocyter hos människor. Det slutliga målet med detta protokoll är generering av kliniska grad DC-CYP-ALDH-celler för behandling av IBD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DRS. Xiaolei Tang och David J. Baylink är uppfinnarear av ett pågående patent i samband med denna studie.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av kontoret för biträdande försvarsministern för hälsofrågor genom peer reviewed medicinsk forskning program under Award No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Yttranden, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är de av författaren och inte nödvändigtvis stöds av försvarsdepartementet. Detta arbete stöddes också delvis av forsknings Innovationsbidrag från Institutionen för medicin vid Loma Linda University (681207-2967 [XT och GG], 681205-2967 [XT] och 325491 [DJB]).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes ThermoFisher Scientific Cat# 03-377-23
100 mm x 20 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430167
12-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-82
150 mm x 25 mm culture dishes Sigma-Aldrich Cat# CLS430559
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) Sigma-Aldrich Cat# H4014
293T cells ATCC CRL-3216
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
6-well culture plates ThermoFisher Scientific Cat# 07-200-83
ALDEFLUOR kit Stemcell Technologies Cat# 01700
Anti-CYP27B1 Abcam Cat# ab95047
BD FACSAria II BD Biosciences N/A
CaCl2 Sigma-Aldrich Cat# C1016
CM-10-D cell culture medium DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-10-R cell culture medium RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
CM-4-D cell culture medium DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430513
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL Sigma-Aldrich Cat# CLS430514
Dissecting scissor ThermoFisher Scientific Cat# 08-940
DMEM medium ThermoFisher Scientific Cat# 11960044
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific Cat# 16000044
Forceps ThermoFisher Scientific Cat# 22-327379
Gibco ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific Cat# A1049201
Glycerol Sigma-Aldrich Cat# G5516
Goat anti-rabbit IgG Abcam Cat# ab205718
HEPES Millipore Cat# 391340
Lenti-CYP-ALDH Custom-made 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.
L-glutamine ThermoFisher Scientific Cat#25030081
Lipopolysaccharide Sigma-Aldrich Cat# L3755
Murine GM-CSF Peprotech Cat# 315-03
Murine IL-4 Peprotech Cat# 214-14
Na2HPO4 Sigma-Aldrich Cat# NIST2186II
NaCl Sigma-Aldrich Cat# S9888
Needles ThermoFisher Scientific Cat# 14-841-02
Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
pCMVR8.74 Addgene Plasmid# 22036
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific Cat#15140148
Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
PMD2G Addgene Plasmid# 12259
Polypropylene tube, 15 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12500
Polypropylene tube, 50 mL ThermoFisher Scientific Cat# AM12502
Protamine sulfate Sigma-Aldrich Cat# P3369
Rabbit polycloncal IgG isotype control Abcam Cat# ab171870
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement Heartland Assays
RPMI 1640 medium, no glutamine ThermoFisher Scientific Cat# 21870076
Sodium pyruvat ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
Sorvall Legend XTR Centrifuge ThermoFisher Scientific Cat# 75004521
Sterile Cell strainers, 40 mm ThermoFisher Scientific Cat# 07-201-430
Sterile storage bottles, 500 mL ThermoFisher Scientific Cat# CLS431432

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361, (21), 2066-2078 (2009).
  2. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
  3. Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9, (4), 438-446 (2010).
  4. Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361, (11), 1081-1087 (2009).
  5. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65, (10), 1642-1664 (2016).
  6. Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202, (12), 3447-3457 (2019).
  7. Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16, (2), 90-101 (2016).
  8. Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
  9. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350, (6258), 334-339 (2015).
  10. Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199, (4), 1342-1352 (2017).
  11. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7, (315), (2015).
  12. Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153, (1), 23-30 (2014).
  13. Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease. Gastroenterology. 143, (5), 1201-1202 (2012).
  14. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, (14), 3921-3928 (2011).
  15. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, (3), 1061-1070 (2011).
  16. Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188, (11), 5276-5282 (2012).
  17. Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).
  18. Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21, (4), 527-538 (2004).
  19. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, (7161), 419-426 (2007).
  20. Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125, (2), 114-118 (2009).
  21. Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6, (16), 14123-14138 (2015).
  22. Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311, (5768), 1770-1773 (2006).
  23. Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
  24. Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23, (12), 2180-2188 (2017).
  25. Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153, (6), 1492-1495 (2017).
  26. Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
  27. Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158, (6), 2723-2730 (1997).
  28. Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84, (11), 1564-1570 (2001).
  29. Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. (2017).
  30. Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62, (2), 448-455 (2017).
  31. Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148, (12), 1968-1975 (2018).
  32. Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32, (11), 984-994 (2017).
  33. Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10, (5), 711-725 (2015).
  34. Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8, (2), 265-278 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics