通过2',7'-二氯二氢氟辛二乙酸染色检测粘附细胞中的总活性氧物种

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Biochemistry

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Summary

在这里,我们提出了一个协议,使用2',7'-二氯二氢氟辛二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞活性氧物种(ROS)。2',7'-二氯二氢氟酸酯(DCFH-DA)。该方法使用荧光显微镜可视化粘附细胞中的细胞ROS定位,并用荧光板读取器量化ROS强度。该协议简单、高效且经济高效。

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Kim, H., Xue, X. Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining. J. Vis. Exp. (160), e60682, doi:10.3791/60682 (2020).

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Abstract

氧化应激是生理和病理条件下的一个重要事件。在这项研究中,我们演示了如何通过使用2',7'-二氯二氢氟酸二乙酸(DCFH-DA)染色结在结肠直肠癌细胞系中测量总活性氧种类(ROS)来量化氧化应激。该协议描述了详细的步骤,包括制备DCFH-DA溶液、使用DCFH-DA溶液孵育细胞以及测量标准化强度。DCFH-DA 染色是检测细胞中 ROS 的一种简单且经济高效的方法。它可用于测量化学处理或基因修饰后产生的ROS。因此,它对于确定细胞氧化应力对环境压力的确定非常有用,为机械学研究提供了线索。

Introduction

细胞代谢产生的三种具有生理意义的主要活性氧种(ROS)是超氧化物类动物、羟基和过氧化氢1。在低浓度时,它们参与生理细胞过程,但在高浓度时,它们对细胞信号通路1有不利影响。我们的身体已经开发了抗氧化系统,这是有效的对抗过量的ROS。然而,当ROS压倒我们身体的排毒能力时,可能会出现氧化应激,这会导致许多病理状况,包括炎症、癌症和神经退行性疾病22,3,4。3,4该方法的目的是使用2',7'-二氯二氢氟酸二乙酸(DCFH-DA)染色来确定粘附细胞中的总细胞ROS。其原理是DCFH-DA氧化为2'-7'二氯氟素(DCF)已被广泛用于总ROS检测,包括羟基基(+OH)和二氧化氮(#NO2)。从机械上讲,DCFH-DA被细胞所占用,细胞酯酶从乙酰组脱落,导致DCFH。ROS对DCFH的氧化将分子转化为DCF,DCF在485nm的激发波长和530nm的发射波长下发出绿色荧光。与用流细胞测定和其他替代方法5检测荧光相比,该方法采用荧光显微镜和板读取器的优点是产生清晰可见的荧光图像,易于执行、高效且经济高效。该方法已广泛用于检测细胞ROS,用于研究各种条件66,7,8。7,8该协议用于检测粘附细胞中的总 ROS。使用此方法检测悬浮细胞中的 ROS 可能需要一些修改。

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Protocol

1. 细胞播种

  1. 种子 2 x 105 HCT116 结肠直肠癌细胞每孔在 24 孔板中,并在 Dulbecco 的改良鹰介质 (DMEM) 中保持细胞在 37°C 过夜。
  2. 用或不使用含有介质的100μM硫酸铁(FS)或含有介质的10μM多索鲁比辛(DOX)更换培养介质,孵育24小时。

2. 准备DCFH-DA解决方案

  1. 将4.85毫克的DCFH-DA溶解在1 mL二甲基硫氧化物(DMSO)中,以制作10mM库存溶液。
  2. 在将预加热 DMEM 稀释库存溶液到 10 μM 工作溶液中,然后再将其添加到井中。
  3. 涡旋工作溶液为10s。

3. DCFH-DA 染色

  1. 取出含有介质的药物,用DMEM洗涤一次。
  2. 将 500 μL 的 DCFH-DA 工作溶液添加到每个井中,并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  3. 卸下 DCFH-DA 工作解决方案。使用 DMEM 洗涤一次,用 1x 磷缓冲盐水 (PBS) 进行 2 倍清洗。
  4. 在每个井中加入 500 μL 的 1x PBS。

4. 成像采集和强度测量

  1. 使用荧光显微镜上的绿色荧光蛋白 (GFP) 通道为每个井拍摄具有代表性的荧光图像。
  2. 拍摄图像后,取出PBS,并将200μL的放射性免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液添加到每个井中。
  3. 在冰上孵育5分钟,然后将细胞水合液收集到1.5mL管中。
  4. 在 21,130 x g下离心 10 分钟,在 4 °C 下。
  5. 将100 μL的上清液转移到黑色96孔板,并使用荧光微板读取器测量荧光强度,其激发波长为485nm,发射波长为530nm。
  6. 将1μL的上清液转移到含有100μL的1倍蛋白测定溶液的透明96孔板,用布拉德福德测定9测量蛋白质浓度。
  7. 使荧光强度与蛋白质浓度正常化。

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Representative Results

HCT116结肠直肠癌细胞用100μM FS或10μM DOX治疗,诱导氧化应激7。如图1所示,FS 和 DOX 都按预期增加绿色荧光。为了量化相对强度变化,细胞在拍摄图像后被分化,并与蛋白质浓度进行规范化。HCT116细胞中的FS或DOX显著提高了定量荧光强度。

Figure 1
图1:铁治疗增加结肠直肠癌细胞的ROS。荧光显微镜拍摄的具有代表性的荧光图像,荧光微孔板读取器在未经处理控制(Ctrl)后,在HCT116细胞中为2',7'-二氯二氢氟酸(DCFH-DA)染色进行强度定量, (A) 100 μM 硫酸铁硫酸铁 (FS) 或 (B)10 μM 多可鲁霉素 (DOX) 处理 24 h。 刻度柱 = 400 μm. = = p < 0.05;= p < 0.001。请点击此处查看此图形的较大版本。

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Discussion

此处描述的实验协议易于重现,可测量细胞总 ROS。关键步骤包括使 DCFH-DA 解决方案新鲜,避免光线照射,最大限度地减少细胞状态干扰和大量 PBS 清洗,然后再拍摄图像。为准备DCFH-DA工作解决方案,在加入24井板之前,应将库存溶液添加到预热的DMEM中。原因是,产生高背景荧光或轻暴露的旧解决方案将导致光漂白。大多数研究使用1xPBS或1x汉克斯的平衡盐溶液(HBSS)稀释DCFH-DA,并将其用作反应缓冲液10。然而,当使用HCT116和RKO时,稀释DCFH-DA库存溶液与PBS和胎儿牛血清自由DMEM产生高背景信号,即使在未经治疗的细胞。这可能是由于细胞状态紊乱。此外,DCFH-DA 工作解决方案应沿着井壁缓慢添加。与未受干扰的附近区域相比,细胞状态的干扰会产生高荧光信号。在拍摄图像之前,使用PBS至少洗涤两次,以减少含有DMEM的苯酚的自动荧光也是至关重要的。无酚DMEM可能是一个更好的选择,但我们在这里表明,PBS洗涤足以尽量减少自动荧光。如图1所示,即使在未经处理的控制组中,两组不同的实验也可能导致不同的代表性图像。为了控制实验变异,我们建议使用稀释的 DCFH-DA 工作溶液(如协议中)处理细胞,而不是直接将库存溶液添加到细胞上。此外,图像应在具有类似细胞密度和相同曝光时间的字段中拍摄。最后,同时对所有比较组执行实验非常重要。

由于 ROS 的重要性,还开发了特定的 ROS 检测,除了总 ROS 检测之外。例如,超氧化物的细胞生产可以通过二氢二氧化钠检测,二氧化时导致在2个位置形成2氢氧化硅酸酯的羟解。当2氢氧石钠穿行进入细胞DNA时,可以观察到激发和发射波长分别为535nm和635nm的红色荧光。线粒体超氧化物可以通过MitoSOX试剂进行可视化,该试剂是二氢二甲苯的阳离子衍生物,可进入活细胞,并特别针对线粒体。产生红色荧光的线虫氧化产物可以穿行成线粒体DNA。化学选择性荧光石孢曲霉素过氧化物探针是为H2O2检测11开发的。此外,12日还报告了使用荧光光谱光度测定检测羟基基。

总之,在这里,我们描述了一个简单和优化的协议,用于使用具有成本效益的 DCFH-DA 染色检测细胞总 ROS。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了美国国家卫生研究院(K01DK114390)的部分支持,美国癌症学会的研究学者资助(RSG-18-050-01-NEC),一项研究试点项目赠款 新墨西哥大学环境卫生签名计划和超级基金(P42 ES025589),共享资源试点项目奖和UNM综合癌症中心研究项目支持试点项目奖(P30CA118100),以及新墨西哥大学医学院专门健康研究基金颁发的新研究员奖。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate Cayman Chemical, Ann Arbor, MI 20656
Doxorubicin hydrochloride TCI America, Portland, OR D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning, Corning, NY 45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate VWR, Radnor, PA 97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System Thermo Fisher Scientific Waltham, MA AMAFD1000 or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution Bio-Rad, Hercules, CA 5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devices, Radnor, PA 89429-532 or any other fluorescence microplate reader

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References

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