Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies insgesamt in anhaftenden Zellen durch 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat-Färbung

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Biochemistry

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Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der gesamten ulzellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) vor. Diese Methode kann die zelluläre ROS-Lokalisierung in anhaftenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren und die ROS-Intensität mit einem Fluoreszenzplattenleser quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig.

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Kim, H., Xue, X. Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining. J. Vis. Exp. (160), e60682, doi:10.3791/60682 (2020).

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Abstract

Oxidativer Stress ist ein wichtiges Ereignis sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen. In dieser Studie zeigen wir, wie oxidativer Stress quantifiziert werden kann, indem wir die gesamte reaktive Sauerstoffspezies (ROS) am Beispiel von 2',7'-dichlorohydrofluorescein-Diacetat (DCFH-DA) in Darmkrebszelllinien messen. Dieses Protokoll beschreibt detaillierte Schritte, einschließlich der Vorbereitung der DCFH-DA-Lösung, der Inkubation von Zellen mit DCFH-DA-Lösung und der Messung der normalisierten Intensität. DCFH-DA Färbung ist eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, ROS in Zellen zu erkennen. Es kann verwendet werden, um die ROS-Generation nach chemischer Behandlung oder genetischen Modifikationen zu messen. Daher ist es nützlich, um zellulären oxidativen Stress auf Umweltstress zu bestimmen, und liefert Hinweise auf mechanistische Studien.

Introduction

Drei wichtige reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die durch den Zellstoffwechsel produziert werden, die von physiologischer Bedeutung sind Superoxid-Anion, Hydroxylradikal und Wasserstoffperoxid1. Bei niedrigen Konzentrationen nehmen sie an physiologischen Zellprozessen teil, haben aber bei hohen Konzentrationen nachteilige Auswirkungen auf die Zellsignalwege1. Unser Körper hat antioxidative Systeme entwickelt, die gegen übermäßige ROS wirksam sind. Jedoch, oxidativer Stress kann auftreten, wenn ROS überwältigen die entgiftende Fähigkeit unseres Körpers, die zu vielen pathologischen Bedingungen beiträgt, einschließlich Entzündungen, Krebs, und neurodegenerative Erkrankungen2,3,4. Der Zweck dieser Methode ist es, die gesamte zelluläre ROS in anhaftenden Zellen mit 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) Färbung zu bestimmen. Die Begründung ist, dass die Oxidation von DCFH-DA zu 2'-7'dichlorfluorescein (DCF) ausgiebig für den gesamten ROS-Nachweis einschließlich Hydroxylradikalen (•OH) und Stickstoffdioxid (•NO2)verwendet wurde. Mechanistisch wird DCFH-DA von Zellen aufgenommen, bei denen die zelluläre Esterase die Acetylgruppen abspaltet, was zu DCFH führt. Die Oxidation von DCFH durch ROS wandelt das Molekül in DCF um, das grüne Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm aussendet. Im Vergleich zum Nachweis der Fluoreszenz mit Durchflusszytometrie und anderen alternativen Methoden5ist es den Vorteilen dieser Methode mit einem Fluoreszenzmikroskop und einem Plattenleser, dass es deutlich sichtbare Fluoreszenzbilder erzeugt und einfach durchzuführen, effizient und kostengünstig ist. Diese Methode wurde weit verbreitet verwendet, um zelluläre ROS für die Untersuchung verschiedener Bedingungen zu erkennen6,7,8. Dieses Protokoll wird zum Erkennen von gesamtros in anhaftenden Zellen verwendet. Die Verwendung dieser Methode zum Erkennen von ROS in Suspensionszellen kann einige Änderungen erfordern.

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Protocol

1. Zellsaat

  1. Samen 2 x 105 HCT116 Darmkrebszellen pro Brunnen in einer 24-Well-Platte und halten die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) über Nacht bei 37 °C.
  2. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch oder ohne 100 M Eisensulfat (FS) oder 10 M Doxorubicin (DOX), das Medium enthält und 24 h inkubieren donisch ist.

2. Vorbereitung der DCFH-DA-Lösung

  1. 4,85 mg DCFH-DA in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen, um eine 10 mM Stammlösung herzustellen.
  2. Verdünnen Sie die Lagerlösung mit vorgewärmtem DMEM in eine Arbeitslösung von 10 M, bevor Sie sie in die Brunnen einfügt.
  3. Vortex die Arbeitslösung für 10 s.

3. DCFH-DA Färbung

  1. Entfernen Sie das Medikament, das Medium enthält, und waschen Sie es einmal mit DMEM.
  2. Fügen Sie in jedem Bohrgut 500 l der DCFH-DA-Arbeitslösung hinzu und brüten Sie 30 min bei 37 °C.
  3. Entfernen Sie die DCFH-DA-Arbeitslösung. Einmal mit DMEM und 2x mit 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen.
  4. Fügen Sie jedem Brunnen 500 l 1x PBS hinzu.

4. Bildgebungserfassung und Intensitätsmessung

  1. Nehmen Sie repräsentative fluoreszierende Bilder für jeden Brunnen mit dem grünen Fluoreszenzproteinkanal (GFP) auf einem Fluoreszenzmikroskop.
  2. Nach der Aufnahme von Bildern entfernen Sie PBS und fügen Sie jedem Brunnen 200 L (RIPA)-Puffer (Radioimmunoprecipitation Assay) hinzu.
  3. 5 min auf Eis bebrüten, dann Zelllysat in 1,5 ml-Röhren sammeln.
  4. Zentrifuge bei 21.130 x g für 10 min bei 4 °C.
  5. Übertragen Sie 100 l des Überstandes auf eine schwarze 96-Wellplatte und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit hilfe einer Fluoreszenz eines Mikroplattenlesers bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm.
  6. Übertragen Sie 1 l des Überstandes auf eine klare 96-Well-Platte, die 100 l 1x Protein-Assay-Lösung enthält, um die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay9zu messen.
  7. Normalisieren Sie Fluoreszenzintensitäten mit Proteinkonzentrationen.

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Representative Results

HCT116 Dickdarmkrebszellen wurden mit 100 -M FS oder 10 M DOX behandelt, um oxidativen Stress zu induzieren7. Wie in Abbildung 1dargestellt, wurde die grüne Fluoreszenz sowohl durch FS als auch durch DOX wie erwartet drastisch erhöht. Um die relative Intensitätsänderung zu quantifizieren, wurden die Zellen nach der Aufnahme von Bildern lysiert und mit Proteinkonzentrationen normalisiert. Die quantifizierte Fluoreszenzintensität wurde durch FS oder DOX in HCT116-Zellen signifikant erhöht.

Figure 1
Abbildung 1: Eisenbehandlung erhöht ROS in Darmkrebszellen. Repräsentative Fluoreszenzbilder, die von einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden, und Intensitätsquantifizierung durch einen Fluoreszenz-Mikroplattenleser für 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diacetat (DCFH-DA) Färbung in HCT116-Zellen nach unbehandelter Kontrolle (Ctrl), (A) 100 M Eisensulfat (FS) oder (B) 10 M Doxorubicin (DOX) Behandlung für 24 h. Skala bar = 400 'm. * = p < 0.05; = p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das hier beschriebene experimentelle Protokoll ist leicht reproduzierbar, um die zelluläre Gesamtmenge ROS zu messen. Zu den entscheidenden Schritten gehören die Frische der DCFH-DA-Lösung und die Vermeidung von Lichteinwirkung, die Minimierung von Zellstatusstörungen und umfangreiches PBS-Waschen direkt vor dem Aufnehmen von Bildern. Für die Herstellung der DCFH-DA-Arbeitslösung sollte die Lagerlösung direkt vor dem Hinzufügen in die 24-Well-Platte in vorgewärmtes DMEM aufgenommen werden. Der Grund dafür ist, dass alte Lösungen, die hohe Hintergrundfluoreszenz oder Lichtexposition erzeugen, zu Photobleichungen führen. Die meisten Studien verwenden 1x PBS oder 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), um DCFH-DA zu verdünnen und als Reaktionspuffer10zu verwenden. Bei der Verwendung von HCT116 und RKO erzeugte jedoch die Verdünnung der DCFH-DA-Stammlösung mit PBS und fetalem Rinderserumfreies DMEM auch in unbehandelten Zellen ein hohes Hintergrundsignal. Dies kann auf eine Störung des Zellstatus zurückzuführen sein. Darüber hinaus sollte die DCFH-DA-Arbeitslösung langsam entlang der Brunnenwand hinzugefügt werden. Die Störung des Zellstatus erzeugt ein hohes Fluoreszenzsignal im Vergleich zum ungestörten nahe gelegenen Gebiet. Es ist auch wichtig, mindestens zweimal mit PBS zu waschen, bevor Bilder aufgenommen werden, um die Autofluoreszenz des Phenols zu reduzieren, das DMEM enthält. Phenolfreies DMEM mag eine bessere Wahl sein, aber wir zeigen hier, dass PBS-Waschen ausreichte, um die Autofluoreszenz zu minimieren. Wie in Abbildung 1dargestellt, können auch in unbehandelten Kontrollgruppen zwei verschiedene Versuchschargen zu unterschiedlichen repräsentativen Bildern führen. Um experimentelle Variationen zu kontrollieren, empfehlen wir, Zellen mit verdünnter DCFH-DA-Arbeitslösung (wie im Protokoll) zu behandeln, anstatt die Stammlösung direkt auf die Zellen zu setzen. Außerdem sollten Bilder in Feldern mit ähnlicher Zelldichte und der gleichen Belichtungszeit aufgenommen werden. Schließlich ist es wichtig, Experimente an allen Vergleichsgruppen gleichzeitig durchzuführen.

Aufgrund der Bedeutung von ROS wurde zusätzlich zur gesamten ROS-Erkennung auch eine spezifische ROS-Erkennung entwickelt. Zum Beispiel kann die zelluläre Produktion von Superoxid durch Dihydroethidium nachgewiesen werden, was bei oxidationsweise zu einer Hydroxylierung an der 2-Position zu 2-Hydroxyethidium führt. Als 2-Hydroxyethidium intercaliert in zelluläre DNA, rote Fluoreszenz mit Anregung und Emissionswellenlängen von 535 nm bzw. 635 nm, kann beobachtet werden. Mitochondriales Superoxid kann mit dem MitoSOX-Reagenz visualisiert werden, einem kationischen Derivat von Dihydroethidium, das in lebende Zellen gelangt und speziell auf Mitochondrien abzielt. Das Oxidationsprodukt von Mitosox, das rote Fluoreszenz erzeugt, kann in mitochondriale DNA interkaliert werden. Für den H2O2-Nachweis 11wurde eine chemoselektive fluoreszierende Naphthylimidperoxidsonde entwickelt. Darüber hinaus wurde der Nachweis von Hydroxylradikalen mittels Fluoreszenzspektrophotometrie ebenfalls gemeldet12.

Zusammenfassend haben wir hier ein einfaches und optimiertes Protokoll zur Erkennung der zellulären Gesamt-ROS mit kostengünstiger DCFH-DA-Färbung beschrieben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (K01DK114390), einem Forschungsstipendiatenstipendium der American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), einem Forschungsprojekt-Stipendium von University of New Mexico Environmental Health Signature Program and Superfund (P42 ES025589), ein Shared Resources Pilot Project Award und ein Research Program Support Pilot Project Award von UNM comprehensive cancer center (P30CA118100) , und einen neuen Forschungsprüferpreis der Dedicated Health Research Funds an der University of New Mexico School of Medicine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate Cayman Chemical, Ann Arbor, MI 20656
Doxorubicin hydrochloride TCI America, Portland, OR D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning, Corning, NY 45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate VWR, Radnor, PA 97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System Thermo Fisher Scientific Waltham, MA AMAFD1000 or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution Bio-Rad, Hercules, CA 5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devices, Radnor, PA 89429-532 or any other fluorescence microplate reader

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References

  1. Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5, (1), 9-19 (2012).
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