Derribo estable de genes que codifican proteínas de matriz extracelular en la línea celular de mioblaste C2C12 utilizando small-Hairpin (sh)RNA

Genetics

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Summary

Proporcionamos un protocolo para derribar genes que codifican las proteínas de matriz extracelular (ECM) en los mioblastos C2C12 utilizando ARN de horquilla pequeña (sh). Apuntando a ADAMTSL2 como ejemplo, describimos los métodos para la validación de la eficiencia de derribo en el ARNm, la proteína y el nivel celular durante la diferenciación de mioblasto c2C12 a miotubo.

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Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

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Abstract

Las proteínas de matriz extracelular (ECM) son cruciales para el desarrollo del músculo esquelético y la homeostasis. El derribo estable de genes que codifican proteínas ECM en mioblastos C2C12 se puede aplicar para estudiar el papel de estas proteínas en el desarrollo del músculo esquelético. Aquí, describimos un protocolo para agotar la proteína ECM ADAMTSL2 como ejemplo, utilizando ARN de horquilla pequeña (sh) en células C2C12. Tras la transfección de plásmidos de ARNS, las células estables se seleccionaron por lotes mediante puromicina. Además, describimos el mantenimiento de estas líneas celulares y el análisis fenotípico a través de la expresión de ARNm, la expresión de proteínas y la diferenciación C2C12. Las ventajas del método son la generación relativamente rápida de células de derribo C2C12 estables y la diferenciación confiable de células C2C12 en miotubos multinucleados tras el agotamiento del suero en el medio de cultivo celular. La diferenciación de las células C2C12 puede controlarse mediante microscopía de campo brillante y midiendo los niveles de expresión de los genes marcadores canónicos, como MyoD, miogenina o cadena pesada de miosina (MyHC), lo que indica la progresión de la diferenciación de mioblastos C2C12 en miotubos. En contraste con el derribo transitorio de genes con ARN de interferencia pequeña (si), los genes que se expresan más tarde durante la diferenciación C2C12 o durante la maduración del miotubo pueden ser dirigidos de manera más eficiente mediante la generación de células C2C12 que expresan establemente el ARNS. Las limitaciones del método son una variabilidad en las eficiencias de derribo, dependiendo del ARNS específico que se puede superar mediante el uso de estrategias de eliminación genética basadas en CRISPR/Cas9, así como los posibles efectos fuera del objetivo del ARNS que deben ser considerados.

Introduction

Las proteínas de matriz extracelular (ECM) proporcionan soporte estructural para todos los tejidos, median la comunicación celular y determinan el destino celular. La formación y remodelación dinámica de ECM es por lo tanto crítica para mantener la homeostasis tisular y órgano1,2. Variantes patológicas en varios genes que codifican proteínas ECM dan lugar a trastornos musculoesqueléticos con fenotipos que van desde distrofias musculares hasta pseudomouscular build3,4. Por ejemplo, las variantes patógenas en ADAMTSL2 causan la displasia geleóísica del trastorno musculoesquelético extremadamente rara, que presenta con la construcción pseudomuscular, es decir, un aumento aparente en la masa muscular esquelética5. Junto con los datos de expresión génica en ratón y humanos, esto sugiere un papel para ADAMTSL2 en el desarrollo del músculo esquelético o homeostasis6,7.

El protocolo que describimos aquí fue desarrollado para estudiar el mecanismo por el cual ADAMTSL2 modula el desarrollo del músculo esquelético y /o homeostasis en un entorno de cultivo celular. Hemos derribado establemente ADAMTSL2 en la línea de células de mioblasto Murine C2C12. C2C12 myoblasts y su diferenciación en miotubos es un modelo de cultivo celular bien descrito y ampliamente utilizado para la diferenciación muscular esquelética y la bioingeniería muscular esquelética8,9. Las células C2C12 pasan por distintos pasos de diferenciación después de la retirada del suero, lo que resulta en la formación de miotubos multinucleados después de 3 a 10 días en cultivo. Estos pasos de diferenciación se pueden controlar de forma fiable midiendo los niveles de ARNm de genes marcadores distintos, como MyoD, miogenina o cadena pesada de miosina (MyHC). Una ventaja de generar derribos genéticos estables en las células C2C12 es que los genes que se expresan en etapas posteriores de la diferenciación C2C12 pueden ser dirigidos de manera más eficiente, en comparación con el derribo transitorio logrado por el ARN de interferencia pequeña (si), que normalmente dura de 5 a 7 días después de la transfección, y está influenciado por la eficiencia de la transfección. Una segunda ventaja del protocolo como se describe aquí es la generación relativamente rápida de lotes de células de derribo C2C12 utilizando la selección de puromicina. Las alternativas, como el knockout genético mediado por CRISPR/Cas9 o el aislamiento de precursores primarios de células musculares esqueléticas de ratones humanos o con deficiencia de genes diana, son técnicamente más difíciles o requieren la disponibilidad de biopsias musculares del paciente o ratones con deficiencia de genes diana, respectivamente. Sin embargo, al igual que otros enfoques basados en el cultivo celular, existen limitaciones en el uso de células C2C12 como modelo para la diferenciación de células musculares esqueléticas, como la naturaleza bidimensional (2D) de la configuración del cultivo celular y la falta del microambiente in vivo que es fundamental para mantener las células precursoras del músculo esquelético indiferenciadas10.

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Protocol

1. Preparación del ADN del Plásmido shRNA de Escherichia coli

  1. Generación de colonias bacterianas clonales portadoras de los plásmidos del ARNH
    1. Obtener existencias de glicerol de E. coli que transporta plásmidos de ARNS Específicos del objetivo y un plásmido de control de fuentes comerciales (Tabla de Materiales).
      NOTA: Se utilizaron tres plásmidos de ARNs shRNA diferentes, dirigidos a diferentes regiones del ARNm de Adamtsl2 murin. Se seleccionó un shRNA para apuntar a la región no traducida de 3'(3'UTR) de Adamtsl2 para facilitar experimentos de rescate con plásmidos de expresión que codifican dominios de proteína ADAMTSL2 recombinantes de longitud completa o dominios de proteína ADAMTSL2 individuales. Además, se incluyó un plásmido de ARNs ShRNA revuelto como un control negativo. Los detalles de las secuencias de ARNH se proporcionan en la Figura 1A.
    2. Descongelar el stock de glicerol bacteriano shRNA a temperatura ambiente (RT). Transfiera 10 l de culata jeque de glicerol bacteriano a una placa de agar Luria-Bertani (LB) suplementada con 100 g/ml de ampicilina (LB-Amp).
      NOTA: Las placas LB-Amp se preparan mediante autoclave 1 L de medio LB (para 1 L: 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, ajustar el pH a 7.0) junto con 12 g de agar. Deje que el medio se enfríe a 50 oC y añada ampicilina (solución en stock: 50 mg/ml en agua estéril) a una concentración final de g/ml (agar LB-Amp). Vierta inmediatamente 20 ml de agar LB-Amp en una placa Petri de 10 cm y deje que el agar se solidifique antes de su uso. 1 L de agar LB-Amp es típicamente suficiente para verter alrededor de 40 platos Petri de 10 cm. Los platos de Petri que contienen agar LB-Amp son estables durante al menos un mes si se almacenan sellados a 4 oC en la oscuridad.
    3. Esparza las bacterias con la espátula estéril De Drygalski o cualquier otro método apropiado para lograr colonias bacterianas individuales. Incubar las placas bacterianas boca abajo durante la noche a 37 oC.
  2. Preparación de plásmido
    1. A la mañana siguiente, retire el plato de Petri con las colonias bacterianas individuales y guárdelo a 4 oC para evitar el crecimiento excesivo de las colonias bacterianas y la formación de colonias satelitales. Selle el plato Petri si se almacena durante la noche o durante más tiempo.
    2. Por la tarde, añadir 5 ml de medio LB-Amp en un tubo de cultivo bacteriano de polipropileno. Seleccione una sola colonia bacteriana del plato Petri cultivado durante la noche con una punta de pipeta e inocular el medio LB-Amp expulsando la punta de la pipeta en el tubo de cultivo bacteriano que contiene el medio LB-Amp.
    3. Incubar el cultivo bacteriano durante la noche en una coctelera a 250 rpm a 37 oC con la tapa libremente unida para permitir la aireación.
    4. Saque el tubo de cultivo bacteriano a la mañana siguiente y manténgase a 4 oC para evitar el crecimiento excesivo de bacterias. Por la tarde, resuspender las bacterias por vórtice y transferir 1 ml del cultivo bacteriano durante la noche en 50 ml de medio LB-Amp en un matraz cónico de 250 ml. Incubar durante la noche en una coctelera a 250 rpm a 37oC.
    5. A la mañana siguiente, transfiera las bacterias a un tubo de centrífuga desechable de 50 ml y a las bacterias centrífugas a 6.000 x g a RT durante 15 minutos.
      NOTA: Si el ADN del plásmido no se puede aislar inmediatamente, retire el medio LB-Amp después del paso de centrifugación y almacene el pellet de bacterias a -20 oC.
    6. Siga las instrucciones para el kit de preparación de plásmidos (escala midi) para extraer el ADN plásmido de las bacterias. Evalúe la calidad del ADN plásmido midiendo la relación A260/A280 utilizando un espectrofotómetro.
      NOTA: Una relación A260/A280 de >1.8 es deseable, lo que indica una alta pureza de la preparación del ADN plásmido. Una proporción más baja de A260/A280 sugiere contaminación con proteínas o eliminación insuficiente de reactivos de extracción. Es posible que se requieran pasos adicionales de purificación de plásmidos.

2. Cultivo y transfección de células C2C12 y selección de puromicina

  1. Cultivo celular C2C12
    1. Descongelar las células C2C12(Tabla de Materiales) rápidamente en un baño de agua de 37oC y verter células en un tubo de centrífuga desechable estéril de 15 ml que contiene 8 ml del medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) medio complementado con 100 unidades de penicilina y antibióticos estreptomicina (DMEM libre de suero) en un capó de cultivo celular. Células centrífugas durante 3 min a 160 x g a RT.
    2. Aspirar sobrenadante y resuspender el pellet celular en 10 ml de DMEM libre de suero complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (DMEM completo). Transfiera las células a platos de plástico tratados con cultivo de tejido de 10 cm. Incubar células en una incubadora humidificada a 37oC en una atmósfera deCO2 al 5%.
    3. Al día siguiente, sustituya el medio por un DMEM fresco y completo.
    4. Expanda las celdas C2C12 de paso bajo en platos de 3 x 4 10 cm. Cuando las células C2C12 alcancen una confluencia de 50 a 60%, aspire el medio y enjuague las células C2C12 con 10 ml de solución salina con búfer de fosfato (PBS).
    5. Añadir 1 mL de 0,25% de trippsina-EDTA e incubar durante 2 min en RT. Monitorear el desprendimiento celular bajo un microscopio y extender el tiempo de incubación si es necesario, hasta que la mayoría de las células estén separadas.
      NOTA: Tocar cuidadosamente el plato puede ayudar a desalojar las células.
    6. Cuando la mayoría de las células estén desprendidas, agregue 10 ml de DMEM completo al plato, pipetee el volumen varias veces y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga desechable estéril de 15 ml. Células centrífugas durante 3 min a 160 x g en RT. Aspirate sobrenadante y resuspenden el pellet celular en 2 ml de medio de congelación (10% dimetilsulfóxido [DMSO]/90% FBS).
    7. Transfiera dos alícuotas de 1 ml por plato de 10 cm en crioviales. Incubar en un recipiente de congelación celular lleno de isopropanol RT durante al menos 24 h en un congelador de -80 oC, lo que resulta en una tasa de congelación de aproximadamente -1 oC por minuto para evitar la formación de cristales de hielo. Almacenar las células para su uso a largo plazo en la fase de vapor de nitrógeno líquido.
      NOTA: El proveedor recomienda usar celdas C2C12 hasta el pasaje número 15. Las experiencias de los autores también mostraron que las células del número de paso más bajo mostraron una diferenciación más consistente y rápida en los miotubos. Es esencial mantener las células C2C12 a baja densidad celular (<50% de confluencia) para evitar la aparición prematura de la diferenciación. Las celdas C2C12 diferenciadas o diferenciadas no se pueden revertir al estado de mióblast original y deben descartarse.
  2. Preparación de células C2C12 para la transfección
    1. Cultivo de células C2C12 indiferenciadas en un plato de 10 cm hasta que alcanzan una confluencia de 50 a 60%. Aspirar el medio, enjuague las células C2C12 con 10 ml de PBS y agregue 1 ml de 0,25% de trippsina-EDTA. Incubar durante 2 minutos en RT, monitorear el desprendimiento celular bajo un microscopio, y extender el tiempo de incubación si es necesario, hasta que la mayoría de las células se separan.
      NOTA: Tocar cuidadosamente el plato puede ayudar a desalojar las células.
    2. Cuando la mayoría de las células estén desprendidas, agregue 10 ml de DMEM completo al plato y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga desechable estéril de 15 ml. Células centrífugas durante 3 min a 160 x g en RT. Aspirate sobrenadante y resuspende el pellet celular en 4 ml de DMEM completo.
    3. Combine 10 ml de suspensión celular con 10 ml de trippan azul en un tubo de reacción de 1,5 ml, mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo y golpee cuidadosamente el tubo de reacción, y transfiera las células a una diapositiva de conteo. Determine el número de celda/ml utilizando un contador de celdas automatizado.
    4. Diluir las células C2C12 a 50.000 células/ml y semilla 100.000 células (2 ml) por pozo en una placa de 6 pocillos para lograr una confluencia de aproximadamente 40-50% después de la incubación durante la noche. Incubar células en una incubadora humidificada a 37oC en una atmósfera deCO2 al 5%.
  3. Transfección de células C2C12 con el plásmido shRNA usando selección de polietilina (PEI) y puromicina
    1. Preparación de la solución de stock PEI
      1. Disolver 16 mg de PEI en 50 ml de agua destilada estéril (concentración de solución en stock: 0,32 mg/ml) en una botella de soporte de vidrio de 50 ml con tapa de tornillo. Incubar la solución a 65oC durante 1 h y vórtice vigorosamente varias veces durante el periodo de incubación para disolver completamente el PEI.
      2. Ajustar a pH 8 agregando 15 sde 1N HCl por 50 ml.
        ADVERTENCIA: HCl es corrosivo. HCl concentrado debe manipularse debajo de la campana de humos. Los investigadores deben usar el equipo de protección personal adecuado.
      3. Congele la solución PEI a -80 oC durante 1 h con una tapa holgada y descongele rápidamente a 37 oC en un baño de agua para mejorar aún más la solubilidad. Repita el ciclo de congelación y descongelación 3x.
      4. Almacene la solución de stock PEI en alícuotas de 0,5 ml para un uso único a -20 oC.
    2. Transfección de células C2C12
      1. Combinar 25,5 l (ADN de plásmido de 8,5 l/g) de la solución de material DE PEI con 100 ml de NaCl de 25 ml en un tubo de reacción de 1,5 ml e incubar durante 5 min a 37 oC. Combinar 3 g de ADN plásmido con 100 ml de NaCl de 25 mM e incubar durante 5 min a 37 oC.
      2. Combine todo el volumen del reactivo PEI diluido con el plásmido diluido y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 25 min a 37oC.
      3. Durante el tiempo de incubación, cambie el medio de las células C2C12 destinadas a la transfección a DMEM sin FBS ni antibióticos.
      4. Agregue la mezcla de transfección PEI/DNA a las células C2C12 gota a gota y mezcle constantemente moviendo cuidadosamente el plato de cultivo celular. Incubar en una incubadora humidificada a 37oC en una atmósfera deCO2 al 5%. Después de 6 h, cambie el medio para completar DMEM.
    3. Selección de puromicina
      1. 24 h después de la transfección, cambie el medio al medio de selección (DMEM completo más 5 g/ml de puromicina). Continuar la selección de puromicina hasta obtener células C2C12 resistentes a la puromicina, que normalmente toma de 10 a 14 días.
      2. Expanda las células resistentes a la puromicina C2C12 a baja densidad celular (<50-60% de confluencia), es decir, para mantener el estado indiferenciado y la crioconservación de 6 x 10 viales para futuros experimentos, como se describe en los pasos 2.1.4-2.1.7.
        NOTA: Mantener las células C2C12 resistentes a la puromicina en presencia de 5 g/ml de puromicina para el cultivo y la expansión celular de rutina. Sin embargo, la puromicina se omitió en los experimentos de diferenciación.

3. Análisis fenotípico de la diferenciación C2C12

NOTA: Los métodos descritos a continuación se pueden adaptar fácilmente para el análisis fenotípico general de la diferenciación mioblasto C2C12 en miotubos variando los anticuerpos específicos utilizados en la hincha occidental o las imprimaciones específicas del gen utilizadas en la polimerasa cuantitativa análisis de reacción en cadena (qPCR).

  1. Protocolo de diferenciación C2C12 y microscopía de campo brillante
    1. Semilla 150.000 células/pozo en una placa de 12 pocillos. Cultivo de células estables C2C12 resistentes a la puromicina en una placa de 12 pocillos en un medio de selección en una incubadora humidificada a 37oC en una atmósfera deCO2 al 5%. Cultivo de células C2C12 en DMEM completo hasta que alcancen una confluencia del 95%.
    2. Para inducir la diferenciación de las células C2C12, reemplace el DMEM completo por DMEM libre de suero (día 0 de diferenciación). Cambie el medio cada dos días y siga la formación de miotubos C2C12 utilizando un microscopio de campo brillante invertido con cámara.
      NOTA: Muchos protocolos utilizan un 2% de suero de caballo para diferenciar las células C2C12 en miotubos. En manos de los autores, la eliminación del suero tuvo un efecto similar. La insulina se describe como un aditivo al medio de cultivo celular para acelerar la diferenciación C2C12. Sin embargo, en el protocolo actual, las células C2C12 diferenciadas de forma fiable en miotubos dentro de los 3 o 5 días posteriores a la privación sérica y la adición de insulina se consideraron innecesarias.
  2. Inmunomancha de cadena pesada de miosina (MyHC) para visualizar miotubos
    1. Semilla 50.000 células C2C12 resistentes a la puromicina por cámara en un portaobjetos de cámara de 8 pozos en 500 l de DMEM completo. Células de cultivo hasta que alcanzan el 95% de confluencia en DMEM completo (alrededor de 24 h).
    2. Para inducir la diferenciación, cambie de DMEM completo a 500 l de DMEM libre de suero (día 0 de diferenciación). En los puntos de tiempo deseados, aspirar el medio y enjuagar las células 3veces con 0,5 ml de PBS.
      NOTA: Realice todos los pasos siguientes en RT.
    3. Fijar células con 0,2 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS durante 15 minutos.
      ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa. Tome las precauciones adecuadas y deseche la solución de paraformaldehído como residuopeligroso.
    4. Quench PFA con 0,2 ml de glicina de 0,5 M en PBS durante 5 min.
    5. Incubar células con 0,2 ml de tensioactivo/detergente no iónico al 0,1%(Tabla de materiales)en PBS durante 10 minutos para permeabilizar la membrana celular. Bloquear con 0,2 ml de albúmina sérica bovina al 5% en PBS durante 1 h. Enjuagar las células con 0,5 ml de PBS 3x durante 5 min cada una.
    6. Incubar células con 0,2 ml de anticuerpo MyHC (1:200 en PBS) durante 2 h. Enjuagar las células con 0,5 ml de PBS 3x durante 5 min cada una.
    7. Incubar células con 0,2 ml de anticuerpo secundario conjugado rojo conjugado de rramina de cabra-anti-ratón (1:200 en PBS). Enjuague las células con 0,5 ml de PBS 3x durante 5 min cada una.
    8. Después de retirar el PBS cuantitativamente, agregue una gota de medio de montaje que contenga 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) por cámara. Soporte de montaje de la cubierta y la cura de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Selle con esmalte de uñas.
    9. Observe las células C2C12 utilizando un microscopio de fluorescencia utilizando el conjunto de filtros adecuado.
  3. Evaluación de la eficiencia de derribo mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR)
    1. Cultivo c2C12 células en condiciones de diferenciación en 12 placas de pozo como se describe en la sección 3.1.
    2. En el punto de tiempo deseado, retire el medio de diferenciación, enjuague las células una vez con 1 ml de PBS y agregue 0,5 ml de reactivo de extracción de ARN(Tabla de materiales)por poca. Lise las células pipetando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo y transfiera el lisado celular a un tubo de reacción estéril de 1,5 ml. Aísle el ARN siguiendo cuidadosamente el protocolo del fabricante.
      ADVERTENCIA: El reactivo de extracción de ARN contiene fenol. Se debe utilizar bajo una campana de humo. Recoger los residuos del reactivo de extracción de ARN y eliminarlos como residuos peligrosos. Los investigadores deben usar el equipo de protección personal adecuado.
    3. Disolver el pellet final de ARN en 20 ml de agua tratada con pirofacarbonato dietílico (DEPC). Determinar la cantidad y calidad de la preparación del ARN utilizando un espectrofotómetro y determinar la relación A260/A280 como medida de calidad.
      NOTA: Un rendimiento típico de 1 pozo de una placa de 12 pocillos es de 5 a 7 g de ARN total con una relación A260/A280 de 1,8 x 2.
    4. Para digerir el ADN genómico co-purificado residual, diluir 1 g de ARN en un volumen total de 8 l de agua tratada con DEPC en un tubo de PCR. Añadir 1 l de tampón de reacción de 10x y 1 l de DNase I (1 unidad/L)(Tabla de materiales)e incubar durante 15 min a RT. Añadir 1 l de solución de parada (25 mM EDTA) e incubar a 70 oC durante 10 min.
    5. Para generar ADNc, combine 10 ml de ARN tratado con DNase con 10 l de mezcla maestra de transcriptasa inversa 2x, que contenga la transcriptasa inversa, imprimaciones aleatorias, mezcla dNTP de 4 mM (1 mM cada uno de dATP, dTTP, dGTP y dCTP), y búfer de reacción de transcriptasa inversa. Incubar la reacción en un termociclador utilizando el programa según lo recomendado por el fabricante. Diluir el ADNc con agua en una proporción de 1:5.
    6. Para preparar la reacción qRT-PCR, combine 5 ml de mezcla maestra qPCR verde SYBR con 0,5 ml de imprimaciones delanteras y inversas específicas del gen (stock: 10 m), respectivamente, y 2 l de agua tratada con DEPC por reacción. Reacción qPCR de pipeta en un pozo de una placa qRT-PCR de 96 pocillos y añadir 2 l de ADNC diluido. Configure tres réplicas técnicas para cada réplica biológica e incluya un gen de limpieza como Gapdh o Hprt1.
    7. Amplifique el producto PCR con un termociclador qRT-PCR utilizando el siguiente programa: 50 oC durante 2 min (activación de uracicia-ADN glicosilasa [UDG]), 95 oC para 2 min (activación de la polimerasa de ADN de doble bloqueo), 40 ciclos de 95 oC para 15 s, 60 oC para 30 s y 72 oC durante 1 min.
    8. Cuantifique los resultados de qRT-PCR utilizando el método DDCt que se normaliza a un gen de limpieza, como Gapdh o Hprt1.
  4. Evaluación de la eficiencia de derribo por la hincha occidental
    1. Semilla 300,000 células C2C12 resistentes a la puromicina por pozo en una placa de 6 pocillos para el análisis de manchas occidentales. Después de 24 h, cambie dMEM sin suero a sin suero para iniciar la diferenciación (día 0 de diferenciación).
    2. En el punto(s) de tiempo deseado, recoja dos 1 ml de medio acondicionado sin suero en un tubo de reacción de 1,5 ml y centrífuga durante 5 min a 500 x g en RT para eliminar las células separadas y los desechos celulares.
      NOTA: Este paso sólo es necesario si se investigan proteínas ECM u otras proteínas secretadas en un medio acondicionado. Si la proteína de interés se localiza en el citoplasma o está unida a la membrana, aspirar el medio de cultivo celular y proceder con los pasos de lisis celular (3.4.7-3.4.12). La lisis celular debe realizarse en paralelo a la precipitación proteica del medio acondicionado sin suero para minimizar la degradación proteolítica y otras consecuencias no deseadas del almacenamiento prolongado de la capa celular.
    3. Después de la centrifugación, transfiera 1 ml de medio acondicionado en un nuevo tubo de reacción de 1,5 ml y precipite proteínas añadiendo 0,391 ml de una mezcla de ácido tricloroacético (TCA) y tensioactivo/detergente no iónico. Brevemente vórtice la mezcla e incubar durante 10 minutos sobre hielo.
      NOTA: Preparar la mezcla de precipitación proteica directamente antes de su uso combinando 0,252 ml de 55% de TCA y 0,139 ml de surfactante/detergente no iónico al 1% de medio acondicionado y vórtice brevemente. La solución se vuelve turbia.
      ADVERTENCIA: TCA es corrosivo y debe manipularse adecuadamente.
    4. Pellet las proteínas precipitadas a >16,000 x g durante 10 min a 4 oC. Descarta el sobrenadante.
      ADVERTENCIA: El sobrenadante contiene TCA y debe recogerse por separado y eliminarse como material peligroso.
    5. Lavar el pellet proteico 3x con acetona helada y centrifugar cada vez a >16,000 x g durante 10 min a 4oC.
    6. Seca al aire el pellet proteico durante 3 x 4 minutos a RT y disuelve en 50 ml de 1x de poliacrilamida de gel de dodecylo sódico 1x, glonofeno y 0,004% de bromofenol azul, complementado con 5% de émertoetanol). Hervir la muestra durante 5 minutos a 95 oC y utilizar para la hincha occidental para detectar la proteína diana deseada mediante procedimientos estándar.
      ADVERTENCIA: El mercaptoetanol es oloroso y tóxico y debe manipularse en una campana de humo.
    7. Para proteínas intracelulares y unidas a membranas, enjuague la capa celular una vez con 2 ml de PBS.
    8. Agregue 1 ml de PBS y desaloje las células raspando del pozo usando un rascador de células. Recoger las células en un tubo de reacción de 1,5 ml y centrifugar a 3.420 x g durante 3 min a 4 oC. Lavar el pellet celular 3x con 1 ml de PBS y centrifugar a 3.420 x g durante 3 min a 4 oC cada vez.
    9. Para cargar las células, resuspenda el pellet celular en 0,2 ml de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM Descl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% desoxicolato de sodio, 2,5 mM de pirofosfato sódico, 1 mM de glicerofosfato y 1 mM de ortovanato sódico) complementado con 1 reactivo de cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA e incubar durante 30 minutos sobre hielo.
    10. Ultrasonidos para 15 s sobre hielo con un ajuste de potencia de salida de 10 a una frecuencia de funcionamiento de 23 kHz.
    11. Retirar los restos celulares por centrifugación a 13.680 x g durante 20 min a 4oC. Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de reacción de 1,5 ml y determinar la concentración de proteína utilizando un ensayo comercial de Bradford o cualquier otro método adecuado.
    12. Para cada muestra, combine 100 g de proteína con 5 tampón de muestra SDS-PAGE en un volumen total de 60 ml y hierva durante 5 min a 95 oC. Analice las muestras mediante procedimientos de hinchamiento occidentalestándar para la presencia de la proteína diana deseada.

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Representative Results

La selección de C2C12 resistente a la puromicina se puede lograr en 10 a 14 días después de la transfección debido a la eliminación eficiente de células no resistentes, es decir, células no transinfectadas(Figura 1B). Por lo general, más del 80% de las células se separan de la placa de cultivo celular y estas células se eliminan durante el mantenimiento celular de rutina. Las células C2C12 resistentes a la puromicina que expresan el shRNA de control (revuelto) conservan la morfología celular alargada en forma de husillo a baja densidad celular y la capacidad de diferenciarse en miotubos. La diferenciación C2C12 tras la retirada del suero puede controlarse mediante microscopía de campo brillante e inmunomanchación para la cadena pesada de miosonda (MyHC) (Figura 2). Los miotubos myHC positivos se observan entre 3 y 5 días después del inicio de la diferenciación. Los miotubos son multinucleados como lo demuestra la presencia de más de un núcleo DAPI positivo dentro de los límites celulares positivos de MyHC. La Figura 3A muestra imágenes de campo brillante de células C2C12 estables cultivadas en DMEM completo. La eficiencia de derribo que se presenta aquí oscila entre el 40 y el 60 %(Figura 3B). Dado que el ARNm fue cosechado en el estado proliferativo donde se expresa poco Adamtsl2, la eficiencia de derribo parece baja, pero se espera que la eficiencia de derribo sea mayor en los puntos de tiempo posteriores durante la diferenciación C2C12, donde Adamtsl2 endógeno es inducido y por lo tanto expresado en niveles mucho más altos. El análisis de la mancha occidental confirmó el derribo exitoso de ADAMTSL2 en el lisato celular obtenido de células C2C12 que expresan establemente el ARNS 3086 en comparación con el shRNA de control(Figura 3C).

Figure 1
Figura 1: Selección de células Estables C2C12 después de la transfección con ADN plásmido codificante shRNA. (A) Tabla que muestra la región de destino (CDS, secuencia de codificación; 3'-UTR, 3'-no traducida región), clone ID (en adelante denominado 1977, 3086, y 972), y la secuencia de los shRNA utilizados para apuntar a Adamtsl2. (B) Los paneles muestran la selección de células C2C12 transtornecadas con el shRNA de control y los tres shRNAs de Adamtsl2. Las células C2C12 fueron transfectó con los plásmidos del ARNH y la puromicina se añadió al medio después de 24 h. Las células sensibles a la puromicina aparecen redondas y finalmente se desprenden durante el mantenimiento del cultivo celular de rutina (flechas rojas). Por el contrario, las células resistentes a la puromicina que albergan los plásmidos shRNA integrados aparecen en forma de husillo, ligeramente alargadas, unidas y viables (flechas azules). Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diferenciación de mioblasto a miotubo C2C12. Las imágenes de campo brillantes de células diferenciadoras C2C12 muestran una apariencia densa de adoquines de las células al comienzo de la diferenciación (día 0-1) y se observaron miotubos multinucleados después del día 5 (fila superior). La inmunomancha de células C2C12 diferenciadoras con cadena pesada de miosina (MyHC, rojo), que es un marcador para los miotubos, se induce en el día 3 de diferenciación (panel medio). Los núcleos se teñían con DAPI y la imagen fusionada se muestra en los paneles inferiores. Barras de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Validación del derribo estable en células C2C12 proliferantes. (A) Imágenes de campo brillantes de células estables C2C12 cultivadas en DMEM completo. Barras de escala a 300 m.(B) análisis qRT-PCR de la expresión de arnm Adamtsl2 en células C2C12 estables. Los valores de Ct se normalizaron al gen de limpieza Hprt1. el ARNm se extrae antes del inicio de la diferenciación. Las barras de error representan la desviación estándar. (C) Análisis de manchas occidentales que muestran una proteína ADAMTSL2 reducida en la fracción de lisato celular/ECM de células C2C12 que expresan establemente el ARNS 3086. AdamTSL2 endógeno se detectó utilizando un anticuerpo de péptido policlonal hecho a medida (disponible bajo petición). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí se describe un protocolo para el derribo estable de proteínas ECM en mioblastos C2C12 y para el análisis fenotípico de la diferenciación de mioblastos C2C12 en miotubos. Varios factores determinan el resultado del experimento y deben ser considerados cuidadosamente. Mantener las células C2C12 en la fase de proliferación es un paso crítico para mantener las células C2C12 en el estado del precursor del mioblasto. Conservar la capacidad de las células C2C12 para diferenciarse consistentemente en miotubos depende de i) el número de paso de las células, ii) la densidad de las células cultivadas durante el mantenimiento de rutina, y iii) la disponibilidad de nutrientes, lo que requiere una reposición frecuente y regular del medio de cultivo celular11,12,13. Debido a algunos mecanismos desconocidos, las células c2C12 de mayor número de paso también pierden el potencial de fusión mioblástica adicional11. Las instrucciones del proveedor de las células C2C12 sugieren mantener estas células hasta el pasaje número 15. A partir de entonces, el potencial de diferenciación puede reducirse y los experimentos con estas células pueden resultar en una formación de miotubos menos consistente. Por otro lado, la densidad celular durante el mantenimiento puede resultar en efectos similares9. Alcanzar las densidades celulares C2C12 confluentes durante el cultivo celular de rutina promueve el inicio de la diferenciación de mioblastoS C2C12 y, por lo tanto, puede influir negativamente en el potencial de diferenciación de la población celular. Por lo tanto, es de importancia crítica evitar que las células C2C12 alcancen altas densidades celulares durante el mantenimiento rutinario de células C2C12. Esto se puede lograr mediante el subcultivo de células C2C12 a densidades celulares bajas (<50-60% de confluencia). La inanición sérica se utiliza para inducir la diferenciación celular C2C12 en los miotubos. Por lo tanto, mantener las células durante más tiempo sin reponer el medio agota gravemente los niveles de nutrientes y suero. Reponer con suero fresco que contenga un medio al menos cada dos días puede prevenir la aparición de una diferenciación prematura no deseada debido a la privación de nutrientes y suero.

La diferenciación C2C12 suele ser inducida por la inanición sérica. El porcentaje de suero utilizado para inducir la diferenciación C2C12 puede influir en gran medida en los resultados, específicamente el tiempo que se tarda en formar MyHC miotubos positivos14,15. Varios protocolos muestran una inducción exitosa de la diferenciación bajo varias concentraciones séricas. Se ha notificado el uso de 2-10% de FBS o suero de caballo y privación sérica completa y todas las condiciones dan lugar a la formación de miotubos C2C12. El porcentaje sérico o el cambio en el lote sérico pueden alterar significativamente los marcadores para la diferenciación. Además, la fuente del suero puede afectar al resultado experimental, ya que el país de origen puede o no permitir ciertos aditivos durante la producción de suero bovino8. El nivel sérico podría ajustarse para alcanzar la tasa de diferenciación de acuerdo con requisitos experimentales específicos. La insulina se puede añadir al medio de cultivo de las células C2C12 para acelerar la diferenciación y la formación de miotubos16.

La capacidad de suministrar plásmidos que codifican shRNA o proteínas recombinantes en células C2C12 a través de la transfección es una característica atractiva de las células C2C12. Varios reactivos comerciales de transfección basados en liposomas se han utilizado previamente para suministrar ADN plásmido en células C2C12 con eficiencias de transfección reportadas variables17,18,19,20,21. PEI también muestra una eficiencia de transfección razonable y es una alternativa rentable a los reactivos de transfección basados en liposomas. Una comparación entre la transfección con un reactivo de transfección a base de liposomas comerciales y PEI no mostró ningún cambio considerable en la eficiencia de la transfección y se encontró una eficiencia ligeramente mayor con PEI22. En nuestras manos, la eficiencia de transfección con PEI fue suficiente para generar células Estables resistentes a la puromicina C2C12. Sin embargo, un paso crítico en este protocolo es mantener el tiempo de incubación del reactivo de transfección corto. Como se mencionó anteriormente, las células C2C12 son sensibles a la abstinencia sérica y la exposición prolongada a condiciones séricas bajas durante la transfección puede favorecer la diferenciación celular C2C12. Dado que la transfección se realiza en ausencia de suero, el tiempo de incubación después de la transfección se mantuvo corto para reabastecer rápidamente el medio que contiene suero para evitar la diferenciación prematura. La puromicina se añadió al medio de cultivo 24 h después de la transfección para iniciar la selección de células C2C12 resistentes a la puromicina. Los métodos para introducir ADN plásmido en miotubos diferenciados incluyen transfección (hasta 85% de eficiencia reportada), electroporación o un enfoque bioptico23,24,25. Alternativamente, las células estables C2C12 que albergan un plásmido de ARNS ShRNA inducible podrían generarse para derribar genes en etapas posteriores de diferenciación de miotubos o durante la maduración del miotubo26.

El método descrito aquí dio lugar a un derribo estable de ADAMTSL2 en células C2C12 donde ahora se puede determinar su función durante la diferenciación en miotubos. La generación de células de derribo estables puede ser especialmente importante para estudiar la función de las proteínas que se inducen durante la formación o maduración del miotubo. La transfección transitoria con siRNA, por ejemplo, no sería suficiente para derribar estos genes de manera eficiente, ya que el efecto de derribo transitorio de siRNA puede destetar después de 5 a 7 días. Alternativamente, el nocaut de una proteína ECM con CRISPR/Cas9 es técnicamente más difícil y los clones individuales necesitan ser seleccionados y secuenciados para asegurar el knockout del gen deseado. Sin embargo, la línea evolutiva de los reactivos puede hacer de CRISPR/Cas9 el método de elección para los experimentos con pérdida de funciones en el futuro.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

D.H. cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel, NIAMS, número de subvención AR070748) y fondos semilla del Departamento de Ortopedia de Leni & Peter W. Monte Sinaí.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

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References

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