בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2

JoVE Journal
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

שיטת החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) היא גישה מקורית לזיהוי כמותי של משתני חלבון MeCP2, המייצרת מדידות כמותית, מדויקת ומדוייקת ובעלת שגיאה בתוך ובין-שיטה נמוכה בטווח עבודה רחב. כאן, הפרוטוקול עבור MeCP2-ECLIA בפורמט 96-ושוב מתואר.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Steinkellner, H., Beribisky, A. V., Mausberg, P., Christodoulou, J., Scheiber-Mojdehkar, B., Huber, A., Sarne, V., Laccone, F. An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants. J. Vis. Exp. (159), e61054, doi:10.3791/61054 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ECLIA היא שיטה רב-תכליתית אשר מסוגל לכמת אנדוגני וכמויות חלבון רקומביננטי בפורמט 96. כדי להדגים את היעילות ECLIA, השימוש באותה שימוש כדי לנתח רמות פנימיות של MeCP2 ברקמת המוח של העכבר ואת ספיגת של תאת-MeCP2 בתוך העור האדם פיברופיצוצים. MeCP2-ECLIA מייצרת מדידות מדויקות ומובנות עם שגיאה נמוכה בתוך ובין-שיטת הספק. לסיכום, פיתחנו שיטה כמותית להערכת משתני חלבון MeCP2 שניתן לעשות בהם שימוש במסכי תפוקה גבוהה.

Introduction

הטיפול החיסוני האלקטרוכימי (ECLIA) מבוסס על תהליך העושה שהוא משתמש בתוויות המיועדות לפלוט לומיאוציה כאשר מגורה באמצעות אלקטרוכימית. זוהי טכניקה הישימה באופן כללי עבור גילוי כמותי של אנליטים ביולוגיים בתעשייה בסיסית ומחקר אקדמי, תעשיית המזון, כמו גם באבחון קליני1. בדרך כלל, 96 חד פעמי עם אלקטרודות לדיו פחמן משמש. אלקטרודות אלה משמשים כמוביל בשלב מוצק עבור שיטת החיסוני. נוגדן משני מצומת לתווית אלקטרוכימית וכאשר החשמל מוחל על המערכת, פליטת האור של התווית הכימית מופעלת. אולטרה נמוך במיוחד המטען מצמידים מכשיר (CCD) רשומות את עוצמת האור אשר פרופורציונלי באופן ישיר אנטיגן מאוגד לנוגדן לכידת וכתוצאה מכך את הכמת של המטרה של המדגם2. לעומת שיטת החיסוני הקשורה באנזימים (אליסה), ECLIA נחשבת ליתרון כפי שהוא מציע רגישות גבוהה יותר, מיוציציה, כמו גם אוטומציה טובה יותר ועקביות3.

כאן ניתחנו את החלבון כריכת מתיל-CpG 2 (MeCP2) רמות בדגימות של מקור אנושי מורמי, כמו גם גרסאות שונות של החלבון רקומביננטי באמצעות מערכת ECLIA שפותחה לאחרונה. MecP2 הוא מקושר X הגרעין חומצה מחייב חלבון ידוע לקיים אינטראקציה עם רצפי DNA ממתיל. החלבון הזה היה מעורב בוויסות. הביטוי הגנטי4,5 אובדן הפונקציה של מוטציות בגן אשר מקודד חלבון זה הם הפושעים העיקריים גורם Rett תסמונת (RTT), הפרעה חמורה התפתחותית הנוירולוגית6. עוד הפרעה MeCP2 הקשורות, תסמונת שכפול MeCP2 , גם מוביל סימפטומים נוירולוגיים שיכולים חופפים עם אלה של rtt7. בעיקר, הנקבות מושפעות בעיקר על ידי rtt בעוד הזכרים הם6נגועים בעיקר על ידי תסמונת MECP2 שכפול 6,7.

הפרעות אלה משויכות לרמות MeCP2 לא מספיקות או עודפות בהתאמה במערכת העצבים המרכזית (CN). מכאן, אפשרויות טיפול RTT המערבות הגדלת רמות MeCP2 ב-CN צריך למנוע את ההשפעות מזיקים הקשורים עם עודף של MeCP27. בשל עובדה זו, ככמת מאוד רגיש ומדויק של רמות החלבון MeCP2, כפי שסופקו על ידי מערכת ECLIA, היא חיונית לקידום RTT כמו גם MeCP2 מחקר תסמונת שכפול. המדידות המדויקות של רמות אנדודוגני ואקסודוגני MeCP2 מקווי התאים האנושיים ודגימות רקמות העכבר, כמו גם חלבון רקומביננטי המורכב של האדם MeCP2 isoform B (הידוע גם בשם isoform e1), ו מינימלי N-מסוף התמרה התחום HIV-תאת (תאת-MeCP2) כי יש8את הפוטנציאל לחצות את מוח הדם-מחסום 8,9 מוצגים בעבודה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור לרכישת ביופסיה לעור לצורכי מחקר התקבל מוועדת האתיקה של מחקר האדם בבית החולים לילדים בווסטמיד, אוסטרליה. הסכמה לניסויים בבעלי חיים הושגה מהמשרד הפדרלי האוסטרי של מדע, מחקר וכלכלה, אשר בוצעו בהתאם לתקנות בעלי חיים מקומיים לרווחת (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

הערה: העיקרון של מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1.

1. בחירת נוגדנים

  1. הערכת יחס אות לרעש עבור מגוון של נוגדנים MeCP2 שונים ולזהות את עוצמת האות הטובה ביותר ואת הספציפיות ביותר בתוך שילוב של MeCP2 נוגדן העכבר העיקרי (שיבוט Mec-168) ו הארנב polyclonal בטים MeCP2 נוגדן זיהוי (נעשה בהתאמה אישית). עבור הנוגדן המשני, השתמש בנוגדן ספציפי למערכת (טבלת חומרים), שהיה גם מאומת.
    הערה: טבלה 1 מעניקה סקירה של כל הנוגדנים האומתו במהלך פיתוח MECP2-eclia וטווחי הדילול שלהם נבדק.
פונקציה שם שיבוט דילול
ראשי עכבר, אנטי MeCP2 Mec-168 1:500 לאחד: 10000
ראשי עכבר, אנטי MeCP2 מיכל כהן 1:250-1:4000
ראשי עכבר, אנטי MeCP2 גברים-8 1:500-1:4000
ראשי עכבר, אנטי MeCP2 מיכל בייס 1:500-1:4000
ראשי ארנב, אנטי MeCP2 D4F3 1:500-1:4000
שני ארנב, אנטי MeCP2 פוליבטיים 1:2000-1:20000
שני ארנב, אנטי MeCP2 פוליבטיים 1:2000-1:20000
זיהוי SULFO-תג מתויג אנטי ארנב פוליבטיים 1:500-1:1000

שולחן 1-רשימת נוגדנים ומדלל עבודה משומשים.

  1. לחלופין, השתמש בכל זוג של MeCP2-נוגדנים הפועלים היטב עם אליסה המקובלת.

2. טיפול HDFs עם היתוך תאת-MeCP2 חלבון

הערה: תאת-MeCP2 היה recombinantly ביטא es, coli ומטוהר באמצעות טכניקות כרומוגרפיות סטנדרטיות כפי שתוארה בעבר8 ומאוחסן ב-80 ° c.

  1. צלחת 1 x 106 בתאי הגוף האנושי (hdf) תאים ב 100 מ"מ מנות ולגדול את התאים לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עד שהם מגיעים על 90% שליטה.
  2. תוציא בקבוקון אחד. מחלבון ההיתוך תאת-MeCP2 . להפשיר על קרח ולערבב בעדינות
  3. לדלל תאת-MeCP2 לריכוז הסופי של 500 nM ב 50 mL של מדיה תרבות HDF.
  4. להסיר את המדיה מתוך 100 מ"מ מנות ו-דגירה את התאים עם 500 ננומטר תאת-MeCP2 ב 37 ° צ' לתקופות דגירה שונות עד 24 h.
  5. הסר את הפתרון תאת-MeCP2 מהתאים. לשטוף את התאים 2x עם תמיסת מלח פוספט מחומם מראש של Dulbecco (DPBS).
  6. פנקו את התאים בעלי 2 מ ל של 0.05% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות ב 37 ° c10.
  7. הוסיפו 6 מ ל של מדיית תרבות HDF כדי להשבית את טריפסין ולאסוף את התאים בצינורות של 15 מ"ל.
  8. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים 2x עם DPBS קר קרח. לאחסן את הגלולה על הקרח ולהמשיך עם ההכנה לדוגמא.

3. הכנה לדוגמא

  1. ליטים HDF
    1. לקבוע את רמות החלבון הגבוה ביותר של MeCP2 באמצעות שיטת הקצירה לשבר הסלולר לתוך התאים הגרעיניים cytoplasmic והגרעין על פי סוזוקי et al.11. הגבל שבירה ליותר משישה דגימות לכל ניסוי.
  2. המוח העכבר ליסוטים
    1. הכינו 100 mL של כל לפירוק ההיפוטוניקה מגיב ומאגר החילוץ.
      1. עבור לפירוק ההיפוטוניקה מגיב, מערבבים היטב 10 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד ו 10 מ"מ אשלגן כלוריד.
      2. עבור מאגר החילוץ, מערבבים היטב 20 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד, 0.42 M נתרן כלוריד, 0.2 mM EDTA, ו -25% (v/v) גליצרול.
      3. כוונן את ה-pH של שני המאגרים ל-7.9.
      4. הוסף 1 מילימטר ממדי dithioitol (DTT) ו-1x מעכב פרוטאז קוקטייל שני מאגרים טרי. הירגע על הקרח לפני השימוש.
    2. להשעות 100 מ"ג של המוח הכללי של העכבר (זן: C57BL/6J, wildtype זכר ונקבה ו B 6.129 P2 (C)-Mecp2tm 1.1 bird/j, hemizygous זכר וheterozygous נקבה; גיל: 4-8 שבועות הישן) ב 1 מ ל של הקרח קר לפירוק ההיפוטון מגיב.
    3. המגון לסדר את המוח עם מקורר לפני כל זכוכית הומוגנידצר רקמות על ידי 15 משיכות של הומוגניצר A (רופף, עבור הרשאה גדולה) ו-B (הדוק, עבור הרשאה קטנה), בהתאמה.
    4. העבר את התאים המהומוגניים לצינור נקי וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. התעלם מהסופרנטנט (או שמור אותו כשבר cytoplasmatic לשימוש נוסף).
    5. השהה מחדש את הגלולה ב-140 μL של מאגר החילוץ לכל 100 מ"ג של חומר התחלתי. הניחו את הצינור בבלוק תרמותרמי מראש וערבבו בעדינות במשך 30 דקות ב -4 ° c.
    6. צנטריפוגה את הצינור ב 16,000 g עבור 10 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטאנט (כלומר, השבר הגרעיני) לצינור מקורר חדש ולחנות ב-80 ° c עד השימוש.
      הערה: ריכוז החלבון של lysates נגזר ממוח העכבר ו-HDFs ניתן להעריך על ידי שיטת החלבון BCA.

4. MeCP2-פרוטוקול ECLIA

  1. הכנת פתרון כביסה, חסימת פתרון מאגר ושיטת מדלל (יום 1)
    1. הוסף 500 μL של רצף של 20 אל 1 L של PBS כדי להכין 0.05% רצף 20 בפתרון PBS, לערבב במרץ ותווית כמו "פתרון כביסה".
      הערה: ודא שנעשה שימוש רק במאגר הכביסה המוכן לשימוש.
    2. הכנת פתרון חסימה של 3% חוסם A (טבלת חומרים) בתמיסת מלח מאגור פוספט (PBS). מערבבים על ידי ערבוב עדין, מסנן לעקר ולשמור אותם במקרר עד לשימוש עבור שבועיים לכל היותר.
    3. הוסף 5 מ ל של פתרון חסימה ל 10 מ ל של PBS כדי להכין את הפתרון שיטת הפעולה (1% חוסם A ב PBS).
  2. ציפוי לוחות מאגד גבוה
    1. קח את 96-היטב multi-מערך בודד במקום יחיד לאגד לוחית גבוהה.
      הערה: לוחיות האיגוד הגבוהות כוללים קיבולת מחייבת גדולה יותר ולכן טווח דינמי גדול יותר מלוחות סטנדרטיים עם משטחי הידרופובי.
    2. הפשרת העכבר מונוקובטיים anti-MeCP2 נוגדן על הקרח ולערבב 0.67 μL של הנוגדן עם 4 מ ל של PBS (1:6000 נוגדן דילול ב-PBS). מערבולת פתרון הנוגדן לערבב היטב ולתייג את הצינור כמו "פתרון ציפוי".
    3. בזהירות לוותר על 25 μL של פתרון ציפוי בפינה התחתונה של כל טוב באמצעות מצנפיאור רב-ערוצי; הדבר נקרא שיטת ציפוי הפתרון. הקש על צלחת ה-96 בעדינות על כל צד כדי לוודא שפתרון הציפוי מכסה את החלק התחתון של כל באר.
    4. אטום את הצלחת בנייר דבק והטה את הצלחת במקרר ב -4 ° c ללילה (12-16 שעות).
  3. חסימה (יום 2)
    1. הוציאו את הצלחת מהמקרר והסירו את נייר הכסף.
    2. הסר את הפתרון ציפוי נוגדן על ידי מצליף אותו לסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון ציפוי מן הבארות.
    3. הוסף 125 μL של פתרון חסימה לכל טוב. לאטום את הצלחת שוב ולמקם אותו על שייקר מיקרולוח מסלולית.
    4. מודטה את הצלחת עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול קבוע ב 800 סל ד.
  4. הכנות של תקנים ודוגמאות
    1. בזמן הדגירה, הכינו את תקני החלבון MeCP2 ו/או תאת-MeCP2 ודגימות שונות.
      הערה: מאגר לייליזה המשמש לדילול סטנדרטי חייב להיות זהה לזה שנעשה בו שימוש בדגימות שנותחו.
    2. להוציא בקבוקון אחד של MePC2 ו/או תאת-MeCP2 מלאי חלבון פתרון (250 μg/mL), המוח העכבר lysates ו HDF lysates מ-80 ° c. . להפשיר אותם על קרח
    3. דלל את פתרון המניה הסטנדרטית (MeCP2 ו/או תאת-MeCP2) בצינורות נקיים לפי טבלה 2.
    4. לדלל את הדגימות במאגר לפירוק כדלקמן: 1-20 μg של המוח העכבר ליפוסט לכל 25 μL של מאגר לפירוק, ו 0.25-1 μg של HDF ליפוסט 25 μL של מאגר לפירוק. הכן מספיק נפח של כל מדגם כדי לבצע ניתוח בטרילקאט.
רגיל ריכוז דילול
תקן 1 1,800 ng/mL 1.08 μL רגיל פתרון מניות + 148.92 μL לליזה מאגר
חדר סטנדרט 2 600 ng/mL 50 μL סטנדרטי 1 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 3 200 ng/mL 50 μL סטנדרטי 2 + 100 μL לליזה מאגר
חדר סטנדרט 4 66.67 ng/mL 50 μL סטנדרטי 3 + 100 μL לוליזיס מאגר
חדר סטנדרט 5 22.22 ng/mL 50 μL סטנדרטי 4 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 6 7.41 ng/mL 50 μL רגיל 5 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 7 2.47 ng/mL 50 μL רגיל 6 + 100 μL מאגר לוליזיס
רגיל 8 0.82 ng/mL 50 μL סטנדרטי 7 + 100 μL מאגר לוליזיס
חדר סטנדרט 9 0.27 ng/mL 50 μL סטנדרטית 8 + 100 μL לליזה מאגר
חדר סטנדרט 10 0 ng/mL מאגר הליזה 150 μL

טבלה 2: סדרות סטנדרטיות בין 0 ל-1,800 ng/mL.

  1. הוספת דגימות ופתרונות סטנדרטיים
    1. הסר את פתרון חסימת ידי מצליף אותו לסל הפסולת ולהקיש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את כל פתרון חסימת מבארות.
    2. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.
    3. הוסף 25 ul של תקנים ודגימות לפינה התחתונה של הבאר באמצעות צינור בודד בערוץ.
    4. חותם את הצלחת ו מודקת את הצלחת עבור 4 h בטמפרטורת החדר עם טלטול קבוע ב 800 סל ד.
  2. נוגדן זיהוי ללא תווית
    1. להפשיר את הארנב רב שבטיים anti-MeCP2 נוגדן על הקרח. לדלל את הנוגדן 1:6000 בתוך שיטת הפתרון.
    2. הסר את הסטנדרטים והדגימות על-ידי הצליף בו לסל הפסולת והקש על הצלחת על מגבת נייר.
    3. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.
    4. הוסף 25 μL של נוגדן זיהוי ללא תווית לכל טוב עם הצינורות הרב-ערוצי. חותם את הצלחת ו מודקת אותו עבור 1 h עם טלטול קבוע ב 800 rpm בטמפרטורת החדר.
  3. נוגדן ספציפי
    1. קחו את הנוגדן המשני המסוים (טבלת חומרים) מהמקרר והניחו אותו על הקרח. לדלל את הנוגדן 1:666.67 בתוך הפתרון בסדר ומערבבים בעדינות.
    2. להסיר את הנוגדן ללא תווית משנית על ידי מצליף אותו בסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר.
    3. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של הפתרון כביסה על ידי הוספת פתרון כביסה ומיד להסיר אותו.
    4. הוסף 25 μL של נוגדן ספציפי (טבלת חומרים) לכל טוב עם הצינורות הרב רב-ערוצי. חותם את הצלחת ואת הדגירה עבור 1 h עם טלטול קבוע ב 800 rpm בטמפרטורת החדר.
  4. קריאת הלוחית
    1. הסר את הנוגדן בחינם המגודרת (טבלה של חומרים) על ידי מצליף אותו בסל האשפה ולהקיש על צלחת על מגבת נייר.
    2. לשטוף את צלחת 3x עם 150 μL של פתרון כביסה.
    3. הוסף 150 μL של 1 x טריס מבוססי זהב לקרוא מאגר (טבלה של חומרים) עם החומרים המכילים triפרופיאמין כשותף מגיב עבור דור האור לצלחת. להימנע בועות אוויר על ידי שימוש הפוך טכניקות ליטוף.
    4. מניחים את הצלחת על פלטפורמת זיהוי אימונולוגיה (לוח חומרים) ולהתחיל את המדידה מיד. השתמש בהגדרות של 96-ובכן רכישת צלחת.
    5. ללכוד את האותות אלקטרוכימי על ידי מצלמת CCD מובנית במערכת זיהוי אלקטרוככימי (טבלת חומרים) ולהקליט את ספירות האות, אשר מתאים יחידות אור יחסית (rlu) והם יחסיים ישירות לעוצמת האור.
      הערה: על ידי גירוי אלקטרוכימי, התווית הרותניום המאוגדת לאלקטרודה הפחמן מקרינה אור מואר ב620 ננומטר. ניתוח נתונים באמצעות התוכנה המלווה במכשירים (טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עקרון מערכת ה-ECLIA מתואר באיור 1. עקומות סטנדרטיות לשתי משתני MeCP2 מוצגות באיור 2. הקוונפיקציה מדויקת היתה אפשרית מעל מגוון רחב של ריכוזים (1-1800 ng/mL). באיור 3, רמות MeCP2 של lysates נגזר ממוח העכבר ו-hdfs נותחו. MeCP2 ביטוי של lysates גרעינית המוח מ heterozygous, ומסוג wildtype עכברים הושוו באיור 3A, בעוד באיור 3A no MeCP2 חלבון זוהה ב-MeCP2 לקויה האדם בפיברוטים (c. 806delg) באמצעות eclia. ספיגת של תאת-MeCP2 על-ידי קו התאים MECP2-לקוי (c. 806delG) נחקר גם לאורך זמן (איור 4). לבסוף, דיוק בין ובין שיטת הזמן הוכח כמוצג בטבלה 3.

Figure 1
איור 1: תרשים הMeCP2 האלקטרוכימי של הפונקציה. . הדמות הזאת הותאמה מwww.meso-scale.com אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עקומת MeCP2 רגיל שנוצר מMeCP2 אנושי במידות מרובות. הגבול התחתון של הזיהוי (LLOD), המוגדר כ2.5 הסטיות הסטנדרטיות (SDs) מעל לריק, הוא 1.00 ng/mL. רקומביננטי אנושי MeCP2 (Abnova) ניתן לכמת באופן מדויק על פני מגוון מ 1.00 ng/mL (LLOD) כדי 1,800 ng/mL (הגבול העליון של זיהוי [ULOD]) עם R2 = 0.996. קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של n = 3. הדמות שונתה מ Steinkellner ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: רמות MeCP2 במוח העכבר ו-HDFs. (א) MeCP2 רמות חלבונים נמדדות במוח הגרעיני מheterozygous (אפור, הט) ועכברים סוג פראי הנקבה (שחור, wildtype) (n = 4) ו אחד MeCP2-הסתרה עכבר (rtt); (ב) תא לlysates מ MeCP2-לקויה קו תא הפיצוץ (c. 806delG) נגזר מחולה זכר עם האנצפלופתיה התינוק כמודל עבור תסמונת rtt נערכו כדי להעריך את רמות החלבון MeCP2 בבני אדם ושליטה בריאה (שחור). הנתונים המוצגים מתכוונים ± SD של בארות טרילקאט (n = 3). חלבון MeCP2 לא זוהה (מתחת לטווח הזיהוי) בקווים תא מוטציה על ידי immunofluorescence או באמצעות ECLIA, עוד להוכיח כי היא מערכת רגישה מאוד עבור לימודי ספיגה נוספת עם החלבונים תאת-fusion. דמות זו השתנתה מ Steinkellner ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ספיגה תלוי זמן של תאת-MeCP2. רמות MeCP2 של שברים גרעיניים ב c. 806delG HDFs טופלו עם 500 ננומטר רקומביננטי תאת-MeCP2 היתוך חלבון. הניתוח בוצע עם ה-MeCP2-ECLIA. בנקודות הזמן שנקבעו, התאים נשטפו עם DPBS ו מודב עם 0.05% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות כדי לחסל מMeCP2-כרוך הקשורות-תאת-מוגבל. טריסינזציה נעצרה על ידי הוספת מדיה עם נסיוב. ההשעיה התא הcentrifuged ב 500 x g עבור 5 דקות. לאחר שטיפת תא הגלולה 2x עם DPBS קר קרח, המדגם היה מוכן לחילוץ של שבר גרעיני כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול. דמות זו השתנתה מ Steinkellner ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שיטת הפנים אינטר-שיטת המשך
ng MeCP2 לכל חלבון mL ng MeCP2 לכל חלבון mL
ובכן 1 ובכן 2 ובכן 3 תכוון SDa SEMb % CVc תכוון SDa SEMb % CVc
פיברותקיעות 6.42 6.30 6.45 6.39 0.08 0.05 1.24 6.61 0.64 0.37 9.71
המוח העכבר ליפוסט 9.92 10.16 10.36 10.14 0.22 0.13 2.17 11.22 0.94 0.54 8.33
מהווה סטיית תקן, bממוצע שגיאות בתקן, מקדם cשל וריאציה

שולחן 3: קביעת דיוק בין שיטת הזמן בשלושה ימים רצופים של HDF ו-wildtype של המוח העכבר. לכל טוב 1-10 μg חלבון של התאים ליפוסט הוחל. מהווה SD, סטיית תקן; ב SEM, ממוצע שגיאות סטנדרטי; ג קורות חיים, מקדם וריאציה. שולחן זה שונה מ Steinkellner ואח '8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי למדוד MeCP2 אנדודוגני, רקומביננטי MeCP2 ו-תאת-MeCP2 רמות, הצלחת 96-באר ECLIA פותחה. זה הוכח כי אובדן של פונקציית חלבון MeCP2 מוביל לתסמונת RTT6, עבור איזה טיפול מוגבל כעת ניהול סימפטום ופיזיותרפיה. אחד שדרת טיפול מבטיח הוא טיפול החלפת חלבון כביכול, שם רמות MeCP2 יכול להיות טיטרציה עד הריכוז הדרוש שלהם12,13,14,15. הפוטנציאל של החלבונים תאת-fusion לחצות את מכשול המוח בדם הוכיחה להצליח במהלך שני העשורים האחרונים12,13,14,15. ככזה, שיטה זו עבור משלוח MeCP2 עשוי להיות שימושי בהקשר של הממשל טיפול בחלבון החלפת. כדי להעריך את הפוטנציאל של החלבונים תאת-fusion וטיפולים אחרים כדי לשחזר את רמות החלבון MeCP2, פיתוח מערכת יעילה ובמחיר נוח שיכול לכמת אותם הוא בעל חשיבות עליונה. היכולת המתוארת בעבודה זו, ה-ECLIA, מסוגלת לקבוע רמות של MeCP2 באופן מדויק ועקבי, עם ערכים נוחים ובעלי שיטת הפנים (שולחן 3).

עבור פרוטוקול MeCP2-ECLIA הבא, המוח העכבר ו-HDFs המועסקים כתאי העניין. עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם כל סוגי התאים האחרים של מוצא אנושי ומורטין לפחות. יתר על כן, HDFs טופלו ב-תאת-MePC2 חלבון היתוך כדי להראות את היכולת של הטיפול הזה כדי למדוד משתנים חלבון MeCP2 שונים. במהלך הכנת המדגם, הימנעות או מזעור סוכני הפחתת מאגר הליזה כגון DTT או β-mercaptoethanol, הוא חיוני כדי לשמור על יעילות הטכניקה. שלבים קריטיים נוספים בשיטה זו כרוכים ציפוי צלחת עם נוגדן anti-MeCP2 העכבר, חסימת צלחת, ובנוסף לדוגמה, ואחריו 4 הדגירה של הארנב עם נוגדן אנטי MeCP2. הדגירה הבאה עם נוגדן משני ספציפי (טבלה של חומרים) ותוספת של ריאגנטים הדרושים התגובה לאור להתרחש, מהווים את הצעדים החשובים האחרונים של הליך זה.

כדי לייעל את ביצועי ECLIA, ניתן לבצע את השלבים הבאים. הפלט המירבי עבור האות לצורך שיטת הפעולה לא יעלה על 1,000,000 ספירות. כדי למנוע מהנוזל להתפשט מעבר לאלקטרודה, ניתן להשתמש בטכניקה שנקראת ציפוי ספוט כדי להחדיר את פתרון הציפוי לתוך הבאר. טכניקה זו דורשת ליטוף בדיוק גבוה או שימוש ברובוט פיפטה. בנוסף, בדיקות ריכוזי נוגדנים שונים יכול להיות שימושי הן להגביר את היכולת להגדיל ולהפחית את אות הרקע. כדי לטפל באפשרות האחרונה, חוסמי שונים (כגון MSD, חוסם D-M) יכולים לשמש גם לריכוז סופי של 0.1%. כדי לייעל את איכות האות, בדיקות זמני דגירה שונים (טלטול על 300 סל ד או מעל) מומלץ. לבסוף, כדי להגביר את ההתאוששות ודילול יניאריות באמצעי אחסון ספציפיים כגון סרום, פלזמה, שתן או נוזל שדרתי, מספר מדלל יכול להיבדק.

למחצה כמותית מערבית MeCP2-אליסה זמין מסחרית משמשים בדרך כלל כדי ללמוד רמות החלבון MeCP2. עקרון העבודה מאחורי ה-אליסה דומה לזה של ה-ECLIA שלנו עם ההבדל הבולט ביותר הוא מצב איתור. בהשוואה לשיטות אלה, MeCP2-ECLIA היא מהירה ונוחה יותר. ECLIA שימש לצורך שיטת מסוג wildtype, heterozygous ו Mecp2-הסתרה דגימות מוח העכבר (איור 3A), עם ממצאים לעומת Mecp2 כמויות מאותם דגימות שהתקבלו על ידי בלוק המערבי (נתונים לא מוצגים). הבדל מסומן נצפתה ברמות MeCP2 של הנשי מסוג wildtype heterozygous המוח דגימות שנמדדו על ידי ECLIA אשר לא זוהה משמעותי מבחינה סטטיסטית על ידי אבן החשופה המערבי. הדיוק הזה של שיטת ECLIA גבוהה יכול להיות חשוב בחיפוש אחר תרכובות הרומן שיכולות לרומם את רמות החלבון MeCP2.

בנוסף, MeCP2-ECLIA הוא יקר פחות מעמיתו MeCP2-אליסה שלה, בשל טווח דינמי גבוה שלה מ 1 ng/mL כדי 1,800 ng/mL (R2 = 0.996), ניתן להשתמש עם דגימות המכילות MeCP2 כמויות נמוכות. בהשוואה לכל ערכות ה-דיאגנוסטיקה המסחריות הזמינות, ה-ECLIA מבצעת אותן באופן משמעותי. ה-ECLIA הינה בעלת טווח דינמי חיובי יותר מ-1-1800 ng/mL בהשוואה לעמיתיהם ה0.312 של אליסה, שנמצאו להיות בעלי 20 ng/mL (העכבר, חברת ענן-שיבוט) ו-0.156-10 ng/mL (חברת האדם, ענן-שיבוט). בשל היעדר הגדרה מפורשת של מגבלה נמוכה יותר של גילוי, ההשוואה הישירה בין שתי הסיבות הללו אינה אפשרית למטרת עבודה זו.

לסיכום, זה הוכח כי MeCP2-ECLIA יכול לקבוע במדויק MeCP2 כמויות vivo ו מבחנה. בעוד מMeCP2 שינג רמות חלבונים בנוירונים של מטופלים rtt הוא אכן שדרת טיפול מבטיח, נוכחות של MeCP2 מוגזמת עלול גם לגרום לתסמינים נוירולוגיים חמורים, הקשורים לתסמונת השכפול MeCP216,17,18. ככזה, שיטה זו יכולה להיות בעלת חשיבות שלמה במיטוב כמות הMeCP2 שהוצגה באופן שווה במהלך טיפול בתחליפי חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לד ר בריג סער לתמיכתה בכלי ECLIA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D9779 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad Laboratories Inc. 500-0006 Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit Meso Scale Diagnostics R32AB-1 Antibody
Discovery workbench 4.0 Meso Scale Discovery Software
DMEM (1X) gibco by Life Technologies 41966-029 Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile) Sigma-Aldrich D8537-500ML Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA Sigma-Aldrich EDS Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F9665 Sample preperation
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant Meso Scale Diagnostics R92TG MeCP2 ECLIA protocol
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D8938 Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) GFL 3014 MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) Sigma-Aldrich M2670 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) Abnova Corporation H00004204-P01 Cell treatment
Microseal B seal Bio-Rad Laboratories Inc. MSB1001 for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin Sigma-Aldrich M6818-100UL; RRID:AB_262075 Antibody, Coating solution
MSD Blocker A Meso Scale Diagnostics R93BA-4 Blocker
MSD SECTOR Imager 2400 Meso Scale Diagnostics I30AA-0 MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate Meso Scale Diagnostics L15XB-3/L11BX-3 MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin gibco by Life Technologies 15140122 Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit Eurogentec S.A. custom-designed Antibody
Potassium chloride (KCl) Merck KGaA 1049361000 Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) Sigma-Aldrich SAB1404063; RRID:AB_10737296 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) Sigma-Aldrich WH0004204M1; RRID:AB_1842411 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) Sigma-Aldrich M6818; RRID:AB_262075 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) Sigma-Aldrich M7443; RRID:AB_477235 Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) Cell Signaling Technology 3456S; RRID:AB_2143849 Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X) Sigma-Aldrich 8340 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Eurogentec S.A. custom Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Merck 07-013 Antibody
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014 Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) Meso Scale Diagnostics W0015528S Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein in-house production Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X) gibco by Life Technologies 25200-056 Cell treatment
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416 Washing solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15, (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160, (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9, (1), 17 (2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320, (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16, (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39, (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9, (1), 7929 (2019).
  9. Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. Canada. CA2647125C (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19, (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285, (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4, (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27, (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2, (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13, (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (16), 6033-6038 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics