अस्थि मज्जा व्यापारियों से माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं की संस्कृति

Biology

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Summary

इस वीडियो में माउस अस्थि मज्जा से माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं फर्क करने के लिए प्रक्रिया को दर्शाता है. माउस टिबिअ और जांध की हड्डी, और अस्थि मज्जा के प्रसंस्करण के अलगाव का प्रदर्शन कर रहे हैं. पहले और बाद में भेदभाव सेल आकारिकी का प्रदर्शन, चित्र, और आंकड़े सेल phenotype और आईएल -12 उत्पादन निम्नलिखित CPG का उपयोग परिपक्वता चित्रण दिखाए जाते हैं.

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Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

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Abstract

माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) अक्सर जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा तंत्र और संक्रमण के लिए जल्दी प्रतिक्रिया के बीच संबंधों का अध्ययन किया जाता है. क्योंकि इन सबसे शक्तिशाली प्रतिजन कोशिकाओं पेश हैं, DCs तेजी से किया जा रहा है एक टीका वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया प्रतिजन विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रेरण का अध्ययन. इस वीडियो में, हम एक दाता माउस से tibias और femurs कटाई, अस्थि मज्जा प्रसंस्करण और इन विट्रो में फर्क DCs के लिए प्रक्रिया प्रदर्शित करता है. उत्तेजना निम्नलिखित DCs परिवर्तन के गुण: अपरिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं शक्तिशाली phagocytes हैं, जबकि परिपक्व DCs प्रतिजन प्रस्तुति के साथ बातचीत और CD4 + CD8 + टी कोशिकाओं में सक्षम हैं. कार्यात्मक गतिविधि में यह परिवर्तन कोशिका की सतह मार्करों और cytokine उत्पादन की upregulation के साथ मेल खाती है. कई एजेंटों साइटोकिन्स और टोल की तरह रिसेप्टर ligands सहित परिपक्व DCs करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस वीडियो में, हम दो सह - stimulatory अणुओं, CD86 और CD40, और साइटोकाइन, आईएल -12 की अभिव्यक्ति के प्रवाह cytometric तुलना दिखाना CPG या नकली उपचार के साथ रात में उत्तेजना के बाद. भेदभाव के बाद, DCs आगे एक टीका वेक्टर के रूप में किया जा सकता है उपयोग के लिए चालाकी से या इन विट्रो में द्वारा प्रतिजन विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न पेप्टाइड्स या प्रोटीन का उपयोग स्पंदन, या पुनः संयोजक वायरल vectors का उपयोग कर transduced.

Protocol

इस प्रोटोकॉल Lutz एट अल से अनुकूलित किया गया है 1.

हार्वेस्ट और अस्थि मज्जा का प्रसंस्करण

  1. टिबिअ और जांध की हड्डी के अलगाव: दाता माउस euthanize और 70% इथेनॉल के साथ पैर स्प्रे. पहली टखने की मजबूती और कुंद संदंश के साथ समझ को दूर त्वचा और टिबिया बेनकाब करने के लिए अंतर्निहित मांसलता में कटौती शुरू. हड्डी को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए, टिबिअ के लिए धीरे धीरे और समानांतर में कटौती, घुटने संयुक्त बरकरार जा.

    फीमर साफ करने के लिए, कुंद संदंश के साथ लोभी द्वारा संयुक्त घुटने स्थिर है. दूर तेज कैंची और घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के साथ मांसलता साफ़. ऊपर की ओर जारी रखें जब तक कूल्हे संयुक्त उजागर और कैंची फीमर के सिर और कूल्हे संयुक्त के बीच रखा जा सकता है है. फॉस्फेट में जांध की हड्डी और कूल्हे और संयुक्त जगह के बीच काटने से हड्डियों निकालें बर्फ पर खारा (पीबीएस) buffered.
  2. अस्थि मज्जा का हटाया: कैंची और घुमावदार संदंश का उपयोग हड्डियों से साफ़ शेष मांसलता . प्रत्येक हड्डी के epiphyses कट और केंद्र गुहा का पता लगाने. एक 10ml पीबीएस के साथ भरी हुई सिरिंज और एक 25G0.5 "सुई का उपयोग, एक गैर - ऊतक लेपित पेट्री डिश में अस्थि मज्जा फ्लश.
  3. अस्थि मज्जा का प्रसंस्करण: एक 1ml सिरिंज से सवार की रबर अंत का उपयोग करने के लिए एक एकल कोशिका निलंबन में अस्थि मज्जा को अलग कर देना (एक का उपयोग ऊपर और नीचे, scraping गति नहीं). एक शंक्वाकार बाज़ ट्यूब में अस्थि मज्जा ले लीजिए, और पीबीएस के साथ अवशिष्ट अस्थि मज्जा कुल्ला.

वृक्ष के समान कोशिकाओं की संस्कृति

  1. Hemocytometer पर डीसी मीडिया और गिनती डीसी व्यापारियों में Resuspend कोशिकाओं (चित्रा 1). आप अलग आकार की कोशिकाओं को देखेंगे, डीसी व्यापारियों के सबसे बड़े और प्रतिभाशाली हैं. विभिन्न ही इन कोशिकाओं गिनती. दो femurs और एक जंगली प्रकार / C57BL 6 माउस (6-8 पुराने सप्ताह) के दो tibias से, आप 25-40 x 10 6 कुल डीसी व्यापारियों के बीच की उम्मीद करनी चाहिए .



    चित्रा 1

  2. 2 एक्स 10 5 डीसी व्यापारियों एमएल / डीसी मीडिया में 40 एनजी / एमएल रीकॉम्बीनैंट murine जीएम-CSF के साथ पूरक की एक घनत्व संस्कृति कोशिकाओं . गैर ऊतक लेपित polystyrene पेट्री प्लेटों में प्लेट कोशिकाओं.

मीडिया (3 दिन) जोड़ें

मीडिया ताज़ा करने के लिए, ताजा 40 एनजी / एमएल जीएम-CSF के साथ पूरक मीडिया की कुल मात्रा का आधा जोड़ें.

मीडिया के एक तिहाई (6 दिन) और परिपक्वता बदलें

मीडिया ताज़ा करने के लिए, ध्यान से मीडिया की कुल मात्रा का एक तिहाई को हटाने और ताजा डीसी संस्कृति के 6 दिन को 40 एनजी / एमएल जीएम-CSF के साथ पूरक मीडिया के साथ इस मात्रा की जगह.

अगर वांछित, वृक्ष के समान कोशिकाओं साइटोकिन्स या टोल की तरह रिसेप्टर ligands का उपयोग परिपक्वता के लिए प्रेरित किया जा सकता है. वीडियो में, DCs रातोंरात उत्तेजना से 5 एनजी / एमएल CPG के साथ परिपक्व थे.

वृक्ष के समान कोशिकाओं के हार्वेस्ट

डीसी संस्कृति (चित्रा 2) पूरा है. कक्ष दोनों निलंबन में और शिथिल थाली का पालन किया जाएगा. पालन ​​कोशिकाओं एक टिशू कल्चर खुरचनी के साथ पकवान और पीबीएस के साथ rinsing scraping द्वारा हटाया जा सकता है. सप्ताह लंबे संस्कृति और भेदभाव की अवधि के दौरान कोशिकाओं की कुल संख्या 5-8 गुना वृद्धि होगी, इसलिए 1-1.6 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल फसल की उम्मीद है.

चित्रा 2

चित्रा 2

अभिकर्मकों

  1. डीसी मीडिया
    1. RPMI 1640 मीडिया, के साथ पूरक:
    2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम
    3. 100 IU / एमएल पेनिसिलिन
    4. 100 / μg एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन
    5. 1 एल glutamine%
    6. 0.1% 2 - mercaptoethanol
    7. 1X गैर आवश्यक अमीनो एसिड
    8. 1X सोडियम पाइरूवेट
  2. पुनः संयोजक जीएम सी.एस.एफ. murine
    1. rmGM-CSF (Peprotech कांग्रेस, न्यू जर्सी, सूची नहीं 315-03.)

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Discussion

DCs सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली बातचीत के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं, और एक टीका वेक्टर के रूप में नियोजित किया जा सकता है. इस वीडियो में, हम अस्थि मज्जा को अलग और इन विट्रो में अंतर माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं के लिए कदम का प्रदर्शन किया है. संस्कृति की अवधि के बाद, इन कोशिकाओं microscopically visualized किया जा सकता है दोनों के रूप में पक्षपाती कोशिकाओं, जो अक्सर dendrites के अधिकारी और गैर पक्षपाती दौर कोशिकाओं. DCs आगे प्रतिजन के साथ स्पंदन के द्वारा किया जा सकता है प्रतिजन प्रस्तुति के लिए चालाकी से या cytokine उत्पादन और costimulatory अणु upregulation साइटोकिन्स और / या टोल की तरह रिसेप्टर ligands (समीक्षा के लिए, गिलबो, 2008 (2) देखें) का उपयोग कर के लिए प्रेरित.

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Acknowledgements

जेबी प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद () NSERC से studentships द्वारा समर्थित है. स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा के द्वारा इस परियोजना के लिए सहायता प्रदान की गई है, अनुदान एमओपी 67,066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

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