골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

골수양 돌기 세포 (DCS)은 자주 타고난과 적응 면역 메커니즘과 감염에 대한 초기 반응 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 이들은 세포를 제시 가장 강력한 항원 때문에 DC가 점점 항원 특정 면역 반응의 유도를 연구하기위한 백신 벡터로 사용되고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 기증자 마우스 tibias과 대퇴골을 수확 골수을 처리하고 체외에서 DC가을 차별에 대한 절차를 설명합니다. 자극을 다음과 DC가 변화의 특성 : DC가 성숙은 CD4와 항원 프레 젠 테이션과 상호 작용 +와 CD8 + T 세포 수있는 반면 미숙 돌기 세포는 강력한 phagocytes 있습니다. 기능 활동이 변화는 세포 표면 마커 및 시토킨 생산의 upregulation과 일치. 많은 대리인은 크린 시토킨 및 수신자와 같은 수용체 리간드를 포함하여 성숙 DC가,하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 CPG 또는 모의 치료 하룻밤 자극을 다음과 같은 두 개의 공동 stimulatory 분자, CD86과 CD40, 그리고 시토킨, IL - 12의 표현의 흐름 cytometric 비교 보여줍니다. 차별화 후, DC가가 더욱 백신 벡터로 사용하기 위해 조작하거나 체외에 의해 항원 특정 면역 반응을 생성하는 펩티드 또는 단백질을 사용하여 pulsing, 또는 재조합 바이러스 벡터를 사용하여 transduced.

Protocol

이 프로토콜은 루츠 외에서 맞게되었습니다 1.

수확 및 골수 처리

  1. 발목 부분의 경골과 대퇴골의 절연 :이 기증자의 마우스를 안락사와 70 % 에탄올로 다리를 스프레이. 무딘 집게로 단단히 최초의 발목을 파악하고 피부와 발목 부분의 경골을 폭로 기본 근육을 떼어 버리기 시작합니다. 뼈에 손상을 방지하려면, 무릎 관절을 그대로두고, 발목 부분의 경골에 천천히 및 병렬 컷.

    대퇴골을 청소하려면, 무딘 포셉과 욕심에 의해 무릎 관절을 고정. 날카로운 가위와 곡선 포셉 한 쌍의으로 근육을 떨어져 청소하십시오. 엉덩이 관절이 노출되고 가위는 대퇴골의 머리와 엉덩이 관절 사이에 위치 수있을 때까지 위쪽으로 계속합니다. 인산염에 대퇴골과 고관절 관절과 장소 사이에 절단하여 뼈를 제거하면 얼음 호수 (PBS)를 버퍼.
  2. 골수의 제거 : 가위와 곡선 집게를 사용하여 뼈에서 청소 남은 근육. 각 뼈의 epiphyses를 차단하고 중앙 구멍을 찾습니다. PBS로 로드된 10mL 주사기 및 25G0.5 "바늘을 사용하지 않는 조직 코팅 페트리 접시에 골수를 플러시.
  3. 골수의 처리 사항 : (모션 근근이 살아가고 아니라를 위아래 사용) 단일 세포 현탁액에 골수를 떼어 놓다에 1mL 주사기의 플런저의 고무 엔드를 사용합니다. 원뿔 팰컨 튜브의 골수를 수집하고, PBS로 잔여 골수를 씻어.

돌기 세포의 문화

  1. hemocytometer에서 DC 언론과 카운트의 DC 엽 성의 전구 물질에 Resuspend 세포 (그림 1). 당신은 다양한 크기의 세포를 볼 수 있으며, DC의 엽 성의 전구 물질은 가장 크고 밝은 있습니다. Differentially 이러한 세포를 계산합니다. 이 대퇴골과 야생 타입 C57Bl / 6 마우스 (이전 6~8주)의 두 tibias에서, 당신은 25-40 X 10 6 총 직류 엽 성의 전구 물질 사이에 기대한다.



    그림 1

  2. 2 X 10 5 엽 성의 전구 물질의 DC / 40 NG / ML 재조합 murine GM - CSF와 보충 DC 미디어 ML의 밀도에 문화 세포. 비 - 조직 - 코팅 폴리스티렌 배양 접시에서 플레이트 세포.

미디어 (3 일) 추가

미디어를 새로 고치려면, 40 NG / ML GM - CSF와 보충 신선한 미디어의 총 볼륨의 절반을 추가합니다.

하나 미디어의 세번째 (6 일)과 성숙을 교체

미디어를 새로 고치려면 신중하게 미디어의 총 볼륨의 3 분의 1을 제거하고 문화 6 일 40 NG / ML GM - CSF와 보충 신선한 DC 미디어와 함께 볼륨을 교체하십시오.

원하는 경우, 돌기 세포는 크린 시토킨 또는 수신자 같은 수용체의 리간드를 사용하여 성숙을 위해 자극 수 있습니다. 동영상에서 DC가 5 NG / ML CPG와 하룻밤 자극에 의​​해 성숙되었다.

돌기 세포의 수확

DC 문화는 (그림 2) 완료됩니다. 세포 현탁액에서 느슨하게 번호판을 준수 둘 것입니다. 준수 세포는 조직 문화 스크레이퍼와 함께 요리 근근이 살아가고하고 PBS로 rinsing하여 제거할 수 있습니다. 세포의 총수는 주일 동안 문화와 차별화 기간 동안 5-8 배 증가합니다, 따라서 1-1.6 X 10 6 세포 / ML을 수확 예정입니다.

그림 2

그림 2

시약

  1. DC 미디어
    1. 와 보충 RPMI - 1640 미디어 :
    2. 10% 태아 소 혈청
    3. 100 IU / ML 페니실린
    4. 100 μg / ML 스트렙토 마이신
    5. 1퍼센트 L - 글루타민
    6. 0.1 % 2 - 메르 캅 토 에탄올
    7. 1X 아닌 필수 아미노산
    8. 1X 나트륨 pyruvate
  2. GM - CSF 재조합 murine
    1. rmGM - CSF (Peprotech 병원, 뉴저지, 카탈로그 번호. 315-03)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DC가이 타고난과 적응 면역의 상호 작용 연구에 유용하며, 백신 벡터로 고용하실 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 체외에서 골수를 분리하고 골수양 돌기 세포를 구별하는 단계를 증명하고있다. 문화 시대에 따라, 이들 세포는 미세 모두 자기편으로 자주 dendrites을 가지고 세포, 및 비 점착 성의 원형 세포를 시각하실 수 있습니다. DC가가 더욱 항원과 pulsing에 의해 항원 프레 젠 테이션에 대한 조작이나 크린 시토킨 및 / 또는 수신자 같은 수용체 리간드를 (검토, 길보아 2008 (2) 참조)를 사용 시토킨 생산 및 costimulatory 분자 upregulation 위해 자극 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

JB는 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC)에서 studentships에 의해 지원됩니다. 이 프로젝트에 대한 지원은 그랜트가 걸레 - 67066, 건강 연구의 캐나다 연구소에 의해 제공되었습니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics