Культура миелоидных дендритных клеток из костного мозга прекурсоров

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Это видео демонстрирует процедуру для дифференциации миелоидных дендритных клеток из костного мозга мыши. Выделение мышью голени и бедра, и обработки костного мозга продемонстрировано. Картинки демонстрируя морфологии клеток до и после дифференциации, и цифры изображением фенотип клетки и Ил-12 производства после созревания использованием CpG показаны.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Миелоидного дендритные клетки (ДК), часто используются для изучения взаимодействия врожденных и адаптивных иммунных механизмов и ранний ответ на инфекцию. Потому что это самый мощный антиген представляющих клеток, ЦОДов все чаще используются в качестве вакцины для изучения вектор индукции антиген-специфического иммунного ответа. В этом видео мы продемонстрируем процедуры для уборки большеберцовые кости и бедра от донора мыши, обработки костного мозга и дифференциации контроллеры домена в пробирке. Свойства изменение домена после стимуляции: незрелые дендритные клетки являются мощным фагоцитов, в то время как зрелые РС способны презентации антигена и взаимодействия с CD4 + и CD8 + Т-клеток. Это изменение функциональной активности соответствует регуляция клеточных поверхностных маркеров и продукции цитокинов. Многие агенты могут быть использованы для зрелой контроллеры домена, включая цитокины и звонок, как лиганды рецептора. В этом видео, мы демонстрируем проточной цитометрии сравнения выражения двух костимулирующих молекул CD86 и CD40, и цитокинов, IL-12, после стимуляции ночь с CpG или макет лечения. После дифференциации, контроллеры домена могут быть дополнительно манипулировать для использования в качестве вакцины вектора или генерировать антиген-специфического иммунного ответа в процессе искусственного пульсирующий использованием пептиды или белки, или трансдуцированных с использованием рекомбинантной вирусных векторов.

Protocol

Этот протокол был адаптирован с Lutz и др. 1.

Урожай и обработки костного мозга

  1. Выделение голени и бедра: усыпить доноров мыши и спрей ноги с 70% этанола. Возьмите первый лодыжки прочно с тупыми щипцами и начинают срезать кожи и подлежащих мышц подвергать голени. Во избежание повреждения костей, нарезать медленно и параллельно голени, оставляя коленного сустава без изменений.

    Для очистки бедра, иммобилизации коленного сустава, захватив с тупыми щипцами. Чистый от мускулатуры с парой острых ножниц и изогнутым пинцетом. Продолжите вверх до тазобедренного сустава подвергается и ножницы могут быть помещены между головкой бедра и тазобедренного сустава. Удалить кости, сокращая между бедренной кости и тазобедренного сустава и поместить в фосфатным буферным раствором (PBS), на льду.
  2. Удаление костного мозга: Чистота остальные мышцы от костей с помощью ножниц и изогнутым пинцетом. Отрежьте эпифизов каждой кости и найдите центр полости. Использование 10 мл шприц загружается с PBS и 25G0.5 "иглу, промыть костного мозга в не-ткань покрыта чашке Петри.
  3. Обработка костного мозга: используйте резиновые конце поршень из шприца 1 мл отделить костного мозга в одной клеточной суспензии (использование вверх и вниз, а не выскабливание движения). Сбор костного мозга в конической трубе сокол, и промойте остаточной костного мозга с PBS.

Культура дендритных клеток

  1. Ресуспендируют клеток в DC СМИ и подсчета DC прекурсоров на гемоцитометра (рис. 1). Вы увидите, клетки разных размеров; DC прекурсоров являются самыми крупными и яркими. Дифференциально рассчитывать только эти клетки. Из двух бедренных костей и два большеберцовые кости дикого типа C57Bl / 6 мыши (6-8 недель), вы должны ожидать от 25-40 х 10 6 общего прекурсоров постоянного тока.



    Рисунок 1

  2. Культуры клеток при плотности 2 х 10 5 прекурсоров DC / DC мл в среде с 40 нг / мл рекомбинантного мышиного GM-CSF. Пластина клеток в ткани, не покрытых пластинами полистирола Петри.

Добавить медиа (день 3)

Для обновления информации, добавить половину от общего объема свежей среде с 40 нг / мл GM-CSF.

Замените треть средств массовой информации (день 6) и созревание

Для обновления информации, тщательно удалить одну треть от общего объема средств массовой информации и заменить этот объем со свежими СМИ DC дополнена с 40 нг / мл GM-CSF на 6 день культуры.

При желании, дендритные клетки могут быть стимулированы для созревания использованием цитокинов или звонок, как лиганды рецептора. В видео, контроллеры домена были созрели ночным стимуляцию с 5 нг / мл CpG.

Урожай дендритных клеток

DC культуры является полным (рис. 2). Клетки будут и во взвешенном состоянии и свободно придерживаться пластины. Наклеивании клетки могут быть удалены путем соскабливания блюдо с скребок культуре ткани и промывки PBS. Общее число ячеек увеличится 5-8 раз в течение недельного культуры и дифференциации периода, следовательно, рассчитывать на урожай 1-1,6 х 10 6 клеток / мл.

Рисунок 2

Рисунок 2

Реагенты

  1. DC СМИ
    1. RPMI-1640 средств массовой информации, дополнен:
    2. 10% эмбриональной телячьей сыворотки
    3. 100 МЕ / мл пенициллина
    4. 100 мкг / мл стрептомицина
    5. 1% L-глутамина
    6. 0,1% 2-меркаптоэтанола
    7. 1X без незаменимых аминокислот
    8. 1X пирувата натрия
  2. Рекомбинантный мышиный GM-CSF
    1. rmGM-CSF (Peprotech Inc, Нью-Джерси, каталог нет. 315-03)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Контроллеры домена являются полезными для исследования врожденных и адаптивных иммунных взаимодействий, и может быть использован в качестве вакцины вектор. В этом видео, мы продемонстрировали шагов, чтобы изолировать костного мозга и дифференциации миелоидных дендритных клеток в пробирке. После периода культуры, эти клетки могут быть визуализированы микроскопически как в качестве приверженца клетки, которые часто обладают дендритов, и не прилипшие клетки раунде. РС может быть дополнительно обработан так, презентации антигена импульсными с антигеном или вынужденное для производства цитокинов и регуляция костимуляторных молекулы использованием цитокинов и / или платной-подобные рецепторы лигандов (см. обзор в Гильбоа, 2008 (2)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

JB поддерживается studentships с естественным наукам и инженерным исследованиям Совета (NSERC). Поддержка данного проекта была предоставлена ​​канадского института исследований в области здравоохранения, Грант СС-67066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics