Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

Biology

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Summary

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

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Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

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Abstract

Células dendríticas mieloides (DC) se utilizan con frecuencia para estudiar las interacciones entre los mecanismos de inmunidad innata y adaptativa y la respuesta temprana a la infección. Debido a que estos son los antígenos más potentes células presentadoras de los países en desarrollo se están utilizando cada vez más como un vector de la vacuna para estudiar la inducción de antígenos específicos de la respuesta inmune. En este vídeo, que muestran el procedimiento para la recolección de la tibia y el fémur de un ratón de los donantes, el procesamiento de la médula ósea y la diferenciación de los países en desarrollo in vitro. Las propiedades de cambio los países en desarrollo después de la estimulación: las células dendríticas inmaduras son fagocitos potentes, mientras que los países en desarrollo maduros son capaces de presentación del antígeno y la interacción con CD4 + y CD8 + T. Este cambio en la actividad funcional se corresponde con la regulación al alza de los marcadores de superficie celular y la producción de citoquinas. Muchos de estos agentes puede ser usado para los países en desarrollo maduro, incluyendo citoquinas y peaje-como los ligandos del receptor. En este vídeo, que muestran las comparaciones de citometría de flujo de la expresión de dos moléculas co-estimulantes, CD86 y CD40, y la citoquina, la IL-12, tras la estimulación durante la noche con el tratamiento con CpG o simuladas. Después de la diferenciación, países en desarrollo puede ser manipulado para su uso como vector de la vacuna o para generar antígenos específicos de la respuesta inmune in vitro de pulso con péptidos o proteínas, o transducidas con vectores virales recombinantes.

Protocol

Este protocolo ha sido adaptado de Lutz et al 1.

Cosecha y el procesamiento de la médula ósea

  1. El aislamiento de la tibia y el fémur: la eutanasia de los donantes del ratón y el spray de las piernas con el 70% de etanol. Sujete el tobillo primera firmemente con unas pinzas romas y empezar a cortar la piel y la musculatura subyacente para exponer la tibia. Para evitar daños en el hueso, corte lento y paralelo a la tibia, dejando intacta la articulación de la rodilla.

    Para limpiar el fémur, inmovilizar la articulación de la rodilla sujetándolo con unas pinzas romas. Limpie la musculatura con un par de tijeras afiladas y pinzas curvas. Continuar hacia arriba hasta la articulación de la cadera se expone y las tijeras se puede colocar entre la cabeza del fémur y la articulación de la cadera. Quitar los huesos por conjuntos de corte entre el fémur y la cadera y el lugar en tampón fosfato salino (PBS) en el hielo.
  2. Extracción de médula ósea: Limpiar la musculatura restante de los huesos con tijeras y pinzas curvas. Cortar las epífisis de cada hueso y localizar la cavidad central. Con una jeringa de 10 ml cargada con PBS y una aguja 25G0.5 ", al ras de la médula ósea en un plato recubierto de tejido de Petri.
  3. Procesamiento de médula ósea: Use la punta de goma del émbolo de una jeringa de 1 ml de disociar la médula ósea a una suspensión de una sola célula (el uso de arriba hacia abajo, no raspar el movimiento). Recoger la médula ósea en un tubo cónico de halcón, y aclarar la médula ósea residual con PBS.

Cultivo de células dendríticas

  1. Resuspender las células en los medios de comunicación de CC y precursores contar DC en un hemocitómetro (Figura 1). Usted verá las células de diferentes tamaños, los precursores de DC son los más grandes y más brillantes. Diferencialmente contar sólo estas células. A partir de dos fémures y dos tibias de un tipo salvaje C57Bl / 6 ratones (6-8 semanas), usted debe esperar entre 25 a 40 x 10 6 precursores DC total.



    Figura 1

  2. Las células de cultivo a una densidad de 2 x 10 5 precursores DC / mL en los medios de comunicación DC complementado con 40 ng / ml recombinante murino GM-CSF. Células de la placa de no tejidos recubiertos con placas de poliestireno de Petri.

Añadir los medios de comunicación (día 3)

Para actualizar los medios de comunicación, agregar la mitad del volumen total de medio fresco suplementado con 40 ng / ml de GM-CSF.

Vuelva a colocar una tercera parte de los medios de comunicación (día 6) y la maduración

Para actualizar los medios de comunicación, retire con cuidado la tercera parte del volumen total de los medios de comunicación y sustituir este volumen con nuevos medios de comunicación DC complementado con 40 ng / ml de GM-CSF en el día 6 de la cultura.

Si lo desea, las células dendríticas pueden ser estimuladas para la maduración con citoquinas o peaje-como los ligandos del receptor. En el video, los países en desarrollo fueron madurados por la estimulación durante la noche con 5 ng / mL CpG.

La cosecha de las células dendríticas

DC la cultura es completa (Figura 2). Las células serán tanto en la suspensión y libremente adherido a la placa. Células adheridas se puede quitar raspando el plato con un raspador de cultivo de tejidos y lavar con PBS. El número total de células aumentará 8.5 veces durante el cultivo de una semana y el período de diferenciación, por lo tanto, esperamos cosechar 1-1,6 x 10 6 células / ml.

Figura 2

Figura 2

Reactivos

  1. DC los medios de comunicación
    1. RPMI-1640 suplementado con:
    2. 10% de suero fetal bovino
    3. 100 UI / ml de penicilina
    4. 100 mg / ml de estreptomicina
    5. 1% de L-glutamina
    6. 0,1% 2-mercaptoetanol
    7. 1X no aminoácidos esenciales
    8. 1X sodio piruvato
  2. Recombinante murino GM-CSF
    1. rmgm-CSF (Peprotech inc, New Jersey, no hay ningún catálogo. 315-03)

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Discussion

Los países en desarrollo son útiles para estudios de interacciones inmune innato y adaptativo, y puede ser empleado como un vector de la vacuna. En este video, que han demostrado los pasos para aislar la médula ósea y diferenciar células dendríticas mieloides in vitro. Tras el período de cultivo, estas células se pueden visualizar al microscopio las células tanto como adherentes, que a menudo poseen las dendritas, y las células no adherentes y vuelta. Los países en desarrollo puede ser manipulado para la presentación de antígenos por pulsación con el antígeno o estimular la producción de citoquinas y la sobrerregulación molécula coestimuladora con citoquinas y / o peaje-como los ligandos del receptor (para una revisión, ver Gilboa, 2008 (2)).

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Acknowledgements

JB es apoyado por becas de de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC). Apoyo a este proyecto ha sido proporcionada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, Grant MOP-67066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

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