Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Biology

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Summary

Cette vidéo montre la procédure pour différencier les cellules dendritiques myéloïdes de la moelle osseuse de souris. Isolement du tibia et du fémur de souris, et le traitement de la moelle osseuse sont démontrés. Photos montrant la morphologie des cellules avant et après différenciation, et les chiffres illustrant phénotype cellulaire et la maturation de production d'IL-12 suivantes à l'aide CpG sont affichés.

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Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

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Abstract

Myéloïde des cellules dendritiques (CD) sont fréquemment utilisés pour étudier les interactions entre innée et adaptative des mécanismes immunitaires et la réponse précoce à l'infection. Parce que ce sont les antigènes les plus puissants des cellules présentatrices, les PED sont de plus en plus utilisé comme un vecteur de vaccin à l'étude de l'induction de l'antigène des réponses immunitaires spécifiques. Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure pour la récolte de tibias et les fémurs d'une souris donneuse, le traitement de la moelle osseuse et de différenciation in vitro de PED. Les propriétés du changement PED après stimulation: les cellules dendritiques immatures sont des phagocytes puissants, alors que les PED matures sont capables de présentation des antigènes et l'interaction avec les cellules CD4 + et CD8 +. Ce changement dans l'activité fonctionnelle correspond à la régulation positive des marqueurs de surface cellulaire et la production de cytokines. De nombreux agents peuvent être utilisés pour les PED matures, y compris les cytokines et les ligands de récepteurs toll-like. Dans cette vidéo, nous démontrons comparaisons de cytométrie en flux de l'expression de deux molécules de co-stimulation, CD86 et CD40, et la cytokine, l'IL-12, suite à une stimulation pendant la nuit avec un traitement CpG ou une maquette. Après différenciation, les PED peut être manipulé pour être utilisé comme vecteur de vaccin ou de générer des antigènes spécifiques par des réponses immunitaires in vitro, pulsant en utilisant des peptides ou des protéines, ou transduites à l'aide de vecteurs viraux recombinants.

Protocol

Ce protocole a été adapté de Lutz et al. 1

Récolte et traitement de la moelle osseuse

  1. Isolement du tibia et du fémur: Euthanasier la souris donneuse et pulvériser les jambes avec de l'éthanol à 70%. Saisir la cheville premier fermement avec une pince émoussée et de commencer à couper la peau et la musculature sous-jacente pour exposer le tibia. Pour éviter d'endommager l'os, couper lentement et parallèlement au tibia, laissant intact le genou.

    Pour nettoyer le fémur, immobiliser l'articulation du genou en saisissant avec une pince émoussée. Nettoyez la musculature avec une paire de ciseaux pointus et pinces courbes. Continuez vers le haut jusqu'à la hanche est exposée et les ciseaux peut être placée entre la tête du fémur et l'articulation de la hanche. Enlever les os en coupant entre les communes du fémur et de la hanche et le placer dans un tampon phosphate salin (PBS) sur la glace.
  2. Prélèvement de moelle osseuse: Nettoyer la musculature restant de l'os en utilisant des ciseaux et des pinces courbes. Coupez les épiphyses de chaque os et de localiser la cavité centrale. En utilisant une seringue de 10 ml chargé avec du PBS et une 25G0.5 "aiguille, rincer la moelle osseuse dans un non-tissu boîte de Petri couché.
  3. Traitement de la moelle osseuse: Utilisez l'extrémité en caoutchouc du piston d'une seringue 1mL de dissocier la moelle osseuse dans une suspension à cellule unique (utiliser un haut et en bas, ne pas gratter le mouvement). Recueillir la moelle osseuse dans un tube conique faucon, et rincer la moelle osseuse résiduelle avec du PBS.

Culture de cellules dendritiques

  1. Resuspendre les cellules dans les médias et le nombre de DC DC précurseurs sur un hématimètre (figure 1). Vous verrez les cellules de tailles diverses, les précurseurs DC sont les plus importants et les plus brillants. Différentiellement compter que ces cellules. De deux fémurs et deux tibias d'un C57Bl type sauvage / 6 de la souris (6-8 semaines), vous devriez vous attendre entre 25-40 x 10 6 précurseurs DC totale.



    Figure 1

  2. Cellules en culture à une densité de 2 x 10 précurseurs DC 5 / mL dans des milieux supplémentés avec DC 40 ng / mL recombinante GM-CSF murin. Cellules de la plaque chez les non-tissus enduits des boîtes de Pétri en polystyrène.

Ajouter des médias (jour 3)

Pour actualiser les médias, ajouter la moitié du volume total des milieux frais complété avec 40 ng / ml de GM-CSF.

Remplacer un tiers des médias (jour 6) et la maturation

Pour actualiser les médias, retirez soigneusement tiers du volume total des médias et de remplacer ce volume avec les médias DC frais complété avec 40 ng / ml de GM-CSF au jour 6 de la culture.

Si désiré, les cellules dendritiques peuvent être stimulés à l'aide à la maturation des cytokines ou des ligands du récepteur Toll-like. Dans la vidéo, les PED ont été mûri par la stimulation pendant la nuit avec 5 ng / mL CpG.

Récolte des cellules dendritiques

La culture DC est complète (figure 2). Les cellules seront à la fois en suspension et vaguement adhérer à la plaque. Cellules adhérées peut être enlevé en grattant le plat avec un grattoir culture de tissus et de rinçage avec du PBS. Le nombre total de cellules augmente 5-8 fois pendant la semaine de la culture et la période de différenciation, par conséquent, espérer récolter de 1 à 1,6 x 10 6 cellules / ml.

Figure 2

Figure 2

Réactifs

  1. CC des médias
    1. RPMI-1640, complété par:
    2. 10% sérum de veau fœtal
    3. 100 UI / ml de pénicilline
    4. 100 pg / mL de streptomycine
    5. 1% de L-glutamine
    6. 0,1% de 2-mercaptoéthanol
    7. 1X non acides aminés essentiels
    8. 1X pyruvate de sodium
  2. Recombinant GM-CSF murin
    1. rmGM-CSF (Peprotech inc, au New Jersey, aucun catalogue. 315-03)

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Discussion

PED sont utiles pour les études d'innée et adaptative des interactions immunitaires, et peut être utilisé comme un vecteur vaccinal. Dans cette vidéo, nous avons démontré les étapes pour isoler la moelle osseuse et de différencier les cellules dendritiques myéloïdes in vitro. Après la période de culture, ces cellules peuvent être visualisés au microscope deux cellules comme adhérente, qui possèdent souvent des dendrites, et les cellules rondes non-adhérents. Les PED peuvent encore être manipulées pour la présentation des antigènes par des impulsions avec un antigène ou stimulés pour la production de cytokines et de régulation à la hausse molécule de costimulation utilisant des cytokines et / ou des ligands de récepteurs Toll-like (pour revue, voir Gilboa, 2008 (2)).

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Acknowledgements

JB est soutenu par des bourses d'études en sciences naturelles et en génie (CRSNG). Prise en charge de ce projet ont été fournis par les Instituts canadiens de recherche en santé, Grant RdP-67 066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

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