Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Myeloïde dendritische cellen (DC's) worden vaak gebruikt om de interacties tussen de aangeboren en adaptieve immuun mechanismen en het begin van de reactie op de infectie te bestuderen. Omdat dit de meest potente antigeen presenterende cellen, worden DCs steeds meer gebruikt als vaccin vector voor de inductie van antigeen-specifieke immuunrespons te bestuderen. In deze video, tonen we de procedure voor het oogsten dij-en bovenbenen van een donor muis, de verwerking van het beenmerg en differentiëren DC's in vitro. De eigenschappen van DCs te veranderen na stimulatie: onrijpe dendritische cellen zijn krachtige fagocyten, terwijl de rijpe DCs zijn in staat om antigeen presentatie en interactie met CD4 + en CD8 + T-cellen. Deze verandering in functionele activiteit komt overeen met de opregulatie van celoppervlaktemerkers en cytokine productie. Veel agenten kunnen gebruikt worden om te rijpen DC's, zoals cytokines en toll-like receptor liganden. In deze video, tonen we flowcytometrische vergelijkingen van de expressie van twee co-stimulerende moleculen, CD86 en CD40, en de cytokine, IL-12, na 's nachts stimulatie met CpG of modellen behandeling. Na de differentiatie, kan DCs verder worden gemanipuleerd voor gebruik als een vaccin vector of om antigeen-specifieke immuunrespons te genereren door in vitro pulserende met behulp van peptiden of eiwitten, of met behulp van recombinante getransduceerde virale vectoren.

Protocol

Dit protocol is een aangepaste versie van Lutz et al. 1.

Oogst en verwerking van het beenmerg

  1. Isolatie van het scheenbeen en dijbeen: euthanaseren de donor muis en spuit de benen met 70% ethanol. Stevig vastpakken de eerste enkel met stompe tang en begint weg te snijden van de huid en de onderliggende spieren aan het scheenbeen bloot te leggen. Om te voorkomen dat schade aan het bot, langzaam en parallel gesneden om de tibia, waardoor het kniegewricht intact.

    Voor het reinigen van het dijbeen, immobiliseren het kniegewricht door vast te pakken met stompe tang. Reinig de spieren weg met een scherpe schaar en gebogen pincet. Ga verder naar boven tot aan het heupgewricht wordt blootgesteld en een schaar kan worden geplaatst tussen de kop van het dijbeen en het heupgewricht. Verwijder de botten door te snijden tussen femur en heup en plaats in de fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs.
  2. Verwijderen van het beenmerg: Schoon overgebleven spieren van de botten met een schaar en gebogen pincet. Snijd de epifysen van elk bot en zoek het midden holte. Met behulp van een 10 ml spuit vol met PBS en een 25G0.5 "naald, spoelt het beenmerg in een niet-gecoate weefsel petrischaal.
  3. Verwerking van het beenmerg: Gebruik de rubberen uiteinde van de zuiger van een 1 ml spuit om het beenmerg dissociëren in een single-celsuspensie (gebruik een op en neer, niet schrapen beweging). Verzamel beenmerg in een conische falcon buis, en spoel resterende beenmerg met PBS.

Cultuur van dendritische cellen

  1. Resuspendeer cellen in DC media en tel DC voorlopers op een hemocytometer (figuur 1). U ziet de cellen van verschillende grootte, de DC-precursoren zijn de grootste en helderste. Differentieel tellen alleen deze cellen. Van twee dijbeen en twee dij van een wild-type C57Bl / 6 muis (6-8 weken oud), kunt u verwachten tussen de 25 tot 40 x 10 6 in totaal DC-precursoren.



    Figuur 1

  2. Cultuur-cellen bij een dichtheid van 2 x 10 5 DC voorlopers / ml in DC media aangevuld met 40 ng / ml recombinant muizen GM-CSF. Plaat cellen in niet-weefsel-gecoate polystyreen petri platen.

Voeg media (dag 3)

Op te frissen de media, voeg de helft van het totale volume van vers medium aangevuld met 40 ng / mL GM-CSF.

Vervang een derde van de media (dag 6) en rijping

Op te frissen de media, verwijder voorzichtig een derde van het totale volume van de media en vervang dit volume met verse DC media aangevuld met 40 ng / mL GM-CSF op dag 6 van de cultuur.

Indien gewenst, kan dendritische cellen worden gestimuleerd om te rijpen gebruik van cytokines of toll-like receptor liganden. In de video, kregen ontwikkelingslanden gerijpt door 's nachts stimulatie met 5 ng / mL CpG.

Oogst van dendritische cellen

DC cultuur is voltooid (figuur 2). Cellen worden zowel in suspensie en losjes gehandeld op grond van de plaat. Aangehouden cellen kunnen worden verwijderd door schrapen de schotel met een weefselkweek schraper en spoelen met PBS. Het totale aantal cellen zullen 5-8 voudige toename in de week-lange cultuur en differentiatie periode, daarom verwachten dat 1 tot 1,6 x 10 6 cellen / ml oogst.

Figuur 2

Figuur 2

Reagentia

  1. DC media
    1. RPMI-1640 media, aangevuld met:
    2. 10% foetaal runderserum
    3. 100 IU / ml penicilline
    4. 100 ug / ml streptomycine
    5. 1% L-glutamine
    6. 0,1% 2-mercapto-ethanol
    7. 1X niet-essentiële aminozuren
    8. 1X natriumpyruvaat
  2. Recombinant muizen GM-CSF
    1. rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, catalogus zonder. 315-03)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DC's zijn nuttig voor studies van aangeboren en adaptieve immuunsysteem interacties, en kan worden gebruikt als vaccin vector. In deze video, hebben we aangetoond dat de stappen om beenmerg te isoleren en te differentiëren myeloïde dendritische cellen in vitro. Na de cultuur periode kunnen deze cellen microscopisch gevisualiseerd worden zowel als hechtende cellen, die vaak beschikken over dendrieten, en niet-klevende ronde cellen. De DCS kan verder worden gemanipuleerd voor antigeen presentatie door pulseren met een antigeen of gestimuleerd om cytokine productie en costimulatoire molecuul up-regulatie met behulp van cytokines en / of toll-like receptor liganden (voor overzicht, zie Gilboa, 2008 (2)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

JB wordt ondersteund door studiebeurzen van het Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC). Steun voor dit project is verstrekt door de Canadese Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics