Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Biology

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Summary

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

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Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

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Abstract

Myeloide dendritische Zellen (DCs) werden häufig verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen angeborenen und erworbenen Immunmechanismen und die frühe Reaktion auf eine Infektion zu studieren. Da diese die stärksten Antigen-präsentierende Zellen sind, sind DCs zunehmend als Impfstoff Vektor verwendet, um die Induktion von Antigen-spezifische Immunantwort zu untersuchen. In diesem Video zeigen wir, das Verfahren für die Ernte tibias und Oberschenkelknochen von einem Spender-Maus,-verarbeitung im Knochenmark und Differenzierung DCs in vitro. Die Eigenschaften der DCs ändern nach Stimulation: unreife dendritische Zellen sind potente Phagozyten, während reife DCs in der Lage Antigen-Präsentation und Interaktion mit CD4 + und CD8 + T-Zellen sind. Diese Veränderung in der funktionellen Aktivität entspricht der Hochregulation von Zelloberflächenmarker und Zytokin-Produktion. Viele Mittel können zu reifen DCs, darunter Zytokine und Toll-like-Rezeptor-Liganden verwendet werden. In diesem Video zeigen wir durchflusszytometrische Vergleiche der Expression von zwei Co-stimulatorischen Molekülen, CD86 und CD40, und das Zytokin IL-12 nach Stimulation mit CpG über Nacht oder mock-Behandlung. Nach Differenzierung kann DCs weiter für die Verwendung als Impfstoff-Vektor manipuliert oder Antigen-spezifische Immunantwort durch in vitro zu erzeugen pulsierende Verwendung von Peptiden oder Proteinen, oder transduziert mit rekombinanten viralen Vektoren.

Protocol

Dieses Protokoll wurde von Lutz et al angepasst worden. 1

Ernte und Verarbeitung von Knochenmark

  1. Die Isolierung der Tibia und Femur: Euthanize des Spenders Maus und besprühen Sie die Beine mit 70% Ethanol. Fassen Sie den ersten Knöchel fest mit einer stumpfen Zange und fangen an, schneiden Sie die Haut und die zugrunde liegenden Muskulatur der Tibia freizulegen. Um eine Beschädigung des Knochens, langsam und parallel geschnitten, um das Schienbein, so dass das Kniegelenk intakt.

    Zur Reinigung des Oberschenkelknochens, Immobilisierung des Kniegelenks durch Greifen mit einer stumpfen Zange. Entfernen Sie vorsichtig die Muskulatur mit einer scharfen Schere und einer gebogenen Pinzette. Weiter nach oben, bis das Hüftgelenk ausgesetzt ist und eine Schere zwischen dem Kopf des Oberschenkelknochens und des Hüftgelenks gelegt werden. Entfernen Sie die Knochen, indem zwischen Oberschenkel und Hüftgelenk und Ort in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf Eis.
  2. Entfernung von Knochenmark: Sauberkeit übrigen Muskulatur von den Knochen mit einer Schere und einer gebogenen Pinzette. Schneiden Sie die Epiphysen der einzelnen Knochen und suchen Sie das Zentrum Hohlraum. Mit einem 10 mL Spritze mit PBS geladen und ein 25G0.5 "Nadel, spülen Sie die Knochenmark in einem nicht-Gewebe beschichtete Petrischale.
  3. Die Verarbeitung von Knochenmark: Verwenden Sie die Gummi-Ende des Kolbens aus einer 1 ml Spritze mit dem Knochenmark in eine Single-Zellsuspension distanzieren (verwenden Sie ein nach oben und unten, nicht kratzen Bewegung). Sammeln Knochenmark in eine konische Falcon-Röhrchen, und spülen verbleibende Knochenmark mit PBS.

Kultur von dendritischen Zellen

  1. Die Zellen in DC Medien und zählen DC Vorläufern auf einer Zählkammer (Abbildung 1). Sie werden sehen, Zellen unterschiedlicher Größe, die Vorläufer der DC sind die größten und hellsten. Unterschiedlich zählen nur diese Zellen. Von zwei Oberschenkelknochen und zwei Unterschenkelknochen eines Wildtyp C57BL / 6 Mäuse (6-8 Wochen alt), sollten Sie zwischen 25-40 x 10 6 insgesamt DC-Vorstufen zu erwarten.



    Abbildung 1

  2. Kultur-Zellen bei einer Dichte von 2 x 10 5 DC Vorläufern / mL in DC-Medien mit 40 ng / mL rekombinantem murinen GM-CSF ergänzt. Platte Zellen in nicht-Gewebe beschichtete Polystyrol Petrischalen.

Add media (Tag 3)

Zur Aktualisierung der Medien, die Hälfte des Gesamtvolumens von frischen Medien mit 40 ng / mL GM-CSF ergänzt.

Ersetzen Sie ein Drittel der Medien (Tag 6) und Reifung

Zur Aktualisierung der Medien, vorsichtig ein Drittel des Gesamtvolumens von Medien und ersetzen dieses Volumen mit frischem DC-Medien mit 40 ng / mL GM-CSF am Tag 6 der Kultur ergänzt.

Falls gewünscht, können dendritische Zellen zur Reifung mit Zytokinen oder Toll-like-Rezeptor-Liganden stimuliert werden. In dem Video wurden DCs durch Übernacht-Stimulation mit 5 ng / mL CpG gereift.

Ernte von dendritischen Zellen

DC Kultur abgeschlossen ist (Abbildung 2). Zellen sowohl in Suspension und locker auf die Platte geklebt werden. Anhaftenden Zellen kann durch Abkratzen der Schale mit einer Gewebekultur Schaber und Spülen mit PBS entfernt werden. Die Gesamtzahl der Zellen 5-8 fache während der einwöchigen Kultur und Differenzierung Zeitraum zu erhöhen, daher erwarten, 1-1,6 x 10 6 Zellen / ml zu ernten.

Abbildung 2

Abbildung 2

Reagenzien

  1. DC Medien
    1. RPMI-1640 Medium, ergänzt mit:
    2. 10% Fötales Rinderserum
    3. 100 IU / ml Penicillin
    4. 100 ug / ml Streptomycin
    5. 1% L-Glutamin
    6. 0,1% 2-Mercaptoethanol
    7. 1X nicht-essentiellen Aminosäuren
    8. 1X Natriumpyruvat
  2. Rekombinantes murines GM-CSF
    1. rmGM-CSF (PeproTech inc, New Jersey, Katalog-Nr. 315-03)

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Discussion

DCs sind für das Studium der angeborenen und adaptiven Immunsystems Interaktionen nützlich, und kann als Impfstoffvektor eingesetzt werden. In diesem Video haben wir die Schritte, um Knochenmark zu isolieren und zu differenzieren myeloide dendritische Zellen in vitro nachgewiesen. Nach der Kulturzeit, können diese Zellen mikroskopisch visualisiert werden sowohl als adhärente Zellen, die oft über Dendriten, und nicht haftende Rundzellen. Die DCs können weitere für die Antigen-Präsentation werden von Pulsen mit Antigen manipuliert oder stimuliert für die Produktion von Zytokinen und kostimulatorischen Molekül Hochregulation mit Zytokinen und / oder Toll-like-Rezeptor-Liganden (für eine Übersicht siehe Gilboa, 2008 (2)).

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Acknowledgements

JB ist studentships aus dem Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) unterstützt. Unterstützung für dieses Projekt wurde von der Canadian Institutes of Health Research vorgelegt, Grant MOP-67066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

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