Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Myeloid dendritik hücreler (DC) doğal ve adaptif immün mekanizmaları ve enfeksiyona karşı erken yanıt arasındaki etkileşimleri incelemek için sık sık kullanılır. Bu hücreler sunan en güçlü antijen olduğundan, DC'lere giderek antijen-spesifik immün yanıtlarının indüksiyonu çalışma bir aşı vektörü olarak kullanılan ediliyor. Bu video, biz, bir donör fare tibiaları ve femur hasat, kemik iliği işleme ve in vitro DC'ler ayırt prosedürü göstermektedir. Uyarılmasını takiben DC'ler değişim özellikleri: olgun DC'ler antijen sunumu ve etkileşim CD4 + ve CD8 + T hücreleri yeteneğine ise immatür dendritik hücreler, güçlü fagositlerdir. Bu değişiklik, fonksiyonel aktivite uyarılması ile hücre yüzey belirteçleri ve sitokin üretimi karşılık gelir. Birçok ajanlar olgun DC'ler, sitokinler ve toll-benzeri reseptör ligandlar dahil etmek için kullanılabilir. Bu video, CpG ya da sahte tedavi ile bir gecede uyarılmasını takiben, iki eş-uyarıcı moleküller, CD86 ve CD40, sitokin, IL-12 ekspresyonu akım sitometri karşılaştırmalar göstermektedir. Farklılaşma sonra, DC'ler daha bir aşı vektörü olarak kullanılmak üzere manipüle edilebilir ya da in vitro antijen-spesifik immün yanıt oluşturmak için peptid veya proteinleri kullanarak darbeli, ya da rekombinant viral vektörler kullanılarak transduced.

Protocol

Bu protokol, Lutz ve ark adapte edilmiştir. 1

Hasat ve kemik iliği işleme

  1. Tibia ve femur İzolasyon: donör fare Euthanize ve% 70 etanol ile bacaklarda sprey. Künt forseps ile ilk ayak bileği sıkıca kavrayın ve tibia maruz deri ve altta yatan kas kesip başlar. Kemik hasar görmesini önlemek için, tibia, diz eklem sağlam bırakarak yavaş yavaş ve paralel kesmek.

    Femur temizlemek için, künt forseps tutarak diz eklemi hareketsiz. Kas uzak, keskin bir makas ve kavisli bir forseps bir çift ile temizleyin. Kalça ekleminin maruz kaldığı ve femur başı ve kalça eklemi arasındaki makas konabilir kadar yukarı doğru devam edin. Fosfat içine femur ve kalça eklemi ve yer arasındaki kesim tarafından kemikleri çıkarın buz tamponlu salin (PBS).
  2. Kemik iliği Temizleme: makas ve kavisli bir forseps kullanarak kemiklerden Temizlik kalan kas. Her kemik epifizleri kesiniz ve merkezi boşluğu bulmak. PBS ile yüklü bir 10 ml şırınga ve 25G0.5 "iğne kullanarak, olmayan bir doku kaplı petri, kemik iliği yıkayın.
  3. Kemik iliği İşleme: (hareket kazıma, yukarı ve aşağı tuşlarını kullanarak), bir tek hücre süspansiyonu haline kemik iliği ayırmak bir 1ml şırınga pistonu kauçuk sonuna kullanın . Kemik iliği, konik bir şahin tüp içinde toplamak ve rezidüel kemik iliği PBS ile yıkayın.

Dendritik hücreler Kültür

  1. Bir hemasitometre DC medya ve sayısı DC öncüleri yeniden süspanse hücreleri (Şekil 1). Farklı boyutlarda hücreleri göreceksiniz DC öncüleri en büyük ve en parlak. Ayirt sadece bu hücreleri saymak. Iki femur ve iki tibiaları yabani tip C57BL / 6 fare (eski 6-8 hafta), 25-40 x 10 6 toplam DC öncüleri arasında beklemek gerekir.



    Şekil 1

  2. 2 x 5 10 DC öncüleri / mL, 40 ng / mL rekombinant fare GM-CSF ile desteklenmiş DC medya yoğunluğu Kültür hücreleri . Levha hücreleri, doku kaplı olmayan polistiren petri tabak.

Medya (3 gün)

Medya yenilemek için 40 ng / ml GM-CSF ile desteklenmiş taze medya toplam hacminin yarısını ekleyin.

Bir medya üçüncü (günde 6) ve olgunlaşma değiştirin

Medya yenilemek için, medya toplam hacmin üçte biri dikkatlice çıkarın ve kültür 6 gün 40 ng / ml GM-CSF ile desteklenmiş taze DC medya ile bu sesi yerine.

İsterseniz, dendritik hücreler sitokinler veya toll-benzeri reseptör ligandlar kullanılarak olgunlaşması için teşvik edilebilir. Video, DC'ler 5 ng / ml CpG gecede stimülasyonu ile olgunlaştı.

Dendritik hücreler Harvest

DC kültür, komple (Şekil 2). Hücreler, süspansiyon ve gevşek plaka yapıştırılır hem de olacaktır. Yapıştırılabilen hücreleri, doku kültürü kazıyıcı ile çanak kazıma ve PBS ile durulama silinebilir. Hücrelerinin toplam sayısı, hafta süren kültür ve farklılaşma dönemi sırasında 5-8 kat artacak, bu nedenle, 1-1,6 x 10 6 hücre / mL hasat bekliyoruz .

Şekil 2

Şekil 2

Reaktifler

  1. DC medya
    1. RPMI-1640 ile desteklenmiş medya:
    2. % 10 fetal sığır serumu
    3. 100 IU / ml penisilin
    4. 100 mg / ml streptomisin
    5. % 1 L-glutamin
    6. 0,1% 2-mercaptoethanol
    7. 1X non-esansiyel amino asitler
    8. 1x sodyum piruvat
  2. GM-CSF Rekombinant fare
    1. rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, katalog no. 315-03)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DC'ler doğal ve adaptif immün etkileşimlerin çalışmalar için yararlı olur ve bir aşı vektörü olarak istihdam edilebilir. Bu video, in vitro olarak izole etmek ve kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için adımlar göstermiştir. Kültür dönemini takiben, bu hücrelerin mikroskobik hem olarak yapışık genellikle dendritler sahip hücreler, ve yapışmaz yuvarlak hücreler görüntülendi olabilir. DC'lerin antijen ile darbeli antijen sunumu için manipüle veya sitokin üretimi ve sitokinlerin ve / veya toll-benzeri reseptör ligandlar (inceleme için, bkz. Gilboa, 2008 (2)) kullanarak kostimülatör molekül upregülasyonu için uyarılmış olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

JB, Fen Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) studentships tarafından desteklenmektedir. Bu proje için Destek Hibe MOP-67.066, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü tarafından sağlanmıştır.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics