Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Biology
 

Summary

Die Differenzierung der ESC deckt sich mit Zelltyp-spezifische Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung des Chromatins. Der Nachweis dieser Veränderungen bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die stemcellness und der Zelldifferenzierung zu definieren. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) stellt eine wertvolle Methode, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Stammzell-Differenzierung zu sezieren.

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Bertani, S., Kan, A., Sauer, F. Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (17), e780, doi:10.3791/780 (2008).

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Abstract

Die funktionelle und strukturelle Komplexität der Myriaden von Zellen in vielzelligen Organismen ergibt sich aus einer kleinen Anzahl von Stammzellen. Selbsterneuerung und Multipotenz, dass eine Stammzelle in nahezu jeder Zelle Typ 1 unterscheiden können: Stammzellen sind durch zwei grundlegende Eigenschaften aus. Die Progression Stammzellen zu differenzierten Zelle ist durch den Verlust von Multipotenz, strukturellen und morphologischen Veränderungen und die hierarchische Aktivität von Transkriptionsfaktoren und Signalmoleküle, deren Aktivitäten zu etablieren und zu pflegen zelltypspezifisch Genexpressionsmuster gekennzeichnet. Auf molekularer Ebene beinhaltet die Zelldifferenzierung dynamischen Veränderungen der Struktur und Zusammensetzung von Chromatin und der Nachweis dieser dynamischen Veränderungen können wertvolle Einblicke in die funktionellen Eigenschaften von Stammzellen und der Zelldifferenzierung Prozess 2,3 liefern. Chromatin ist eine hoch verdichtete DNA-Protein-Komplex, der entsteht, wenn Zellen Paket chromosomale DNA mit Proteinen, vor allem Histone 4. Stemcellness und Zelldifferenzierung hat mit dem Vorhandensein von spezifischen Arrays von regulatorischen Proteinen wie epigenetische Faktoren, Histon-Varianten und Transkriptionsfaktoren 2,3,5 korreliert.


Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) bietet eine wertvolle Methode, um die Anwesenheit von RNA, Proteine ​​und Proteinmodifikationen in Chromatin 6,7 überwachen. Der Vergleich von Chromatin aus verschiedenen Zelltypen aufzuklären dynamischen Änderungen im Protein-Chromatin Verbände, die während der Zelldifferenzierung auftreten.

Chromatin Immunopräzipitation beinhaltet die Reinigung von in vivo vernetzt Chromatin. Die isolierte Chromatin ist in kleinere Fragmente durch enzymatische Verdauung oder mechanische Kraft reduziert. Chromatin-Fragmente werden ausgefällt mittels spezifischer Antikörper an Proteine ​​oder Protein-und DNA-Modifikationen Ziel. Die gefällte DNA oder RNA wird gereinigt und als Matrize für die PCR oder DNA-Mikroarray-basierte Assays. Voraussetzungen für eine erfolgreiche ChIP sind hochwertige Antikörper gegen das gewünschte Antigen und die Verfügbarkeit von Chromatin aus Kontroll-Zellen, die nicht exprimieren das Zielmolekül. Chip kann korrelieren die Anwesenheit von Proteinen, Protein-und RNA Modifikationen und RNA mit spezifischen Ziel-DNA, und je nach Wahl des outread Tool, erkennt der Verband der Zielmoleküle an bestimmten Zielgenen oder im Rahmen eines gesamten Genoms. Der Vergleich der Verteilung der Proteine ​​im Chromatin differenzierenden Zellen kann erhellen den dynamischen Veränderungen des Chromatins Zusammensetzung, die mit dem Fortschreiten der Zellen entlang einer Zelllinie zusammenfallen.

Protocol

Auftauen ES-Zellen (nicht im Video zu sehen)

ES-Zellen werden in Medium mit 10% DMSO eingefroren. Da DMSO die Differenzierung von ES-Zellen induzieren kann, kann es möglich sein, die Zellen gegen Ende des Tages auftauen und so auf das Medium wechseln zum nächsten Morgen, um die Auswirkungen der verbleibenden DMSO zu minimieren.

  1. Coat einer 6-well Zellkultur-Platte mit 0,1% Gelatine für mindestens 15 min und absaugen unmittelbar vor der Platte Zellen auf.
  2. Thaw ES-Zellen (ca. 5 x 10 6 Zellen, was einem konfluenten 6-well) in einem 37 ° C Wasserbad und verdünnen in 10 ml vorgewärmtem ES-Zell-Medium.
  3. Pellet die Zellen durch Spinnen für 10 Minuten bei 1000 rpm in einer Tischzentrifuge klinischen Zentrifuge.
  4. Absaugen Medium und sanft die Zellen in 10 ml 37 ° C vorgewärmten Medium.
  5. Transfer-Zell-Suspension, die 6-Well-Platte und wachsen bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Inkubator.
  6. Ändern Medium am folgenden Tag, um tote Zellen und restliches DMSO zu entfernen.

Passage und Expansion von ES-Zellkulturen

ES-Zellen werden routinemäßig alle passagiert 2 / 3 Tage, und das Medium wird jeden zweiten Tag gewechselt. So erfordern ES-Zellen tägliche Aufmerksamkeit. Nach unserer Erfahrung wachsen Feeder-unabhängige ES-Zellen rascher und schneller versauern das Medium, Drehen gelb. Unter Berücksichtigung der Zellen an das Medium sauer (durch nicht verändern die Medien jeden Tag oder durch Passagieren der Zellen bei einer zu niedrigen Verdünnung) führt dazu, dass die Zellen Krise durchlaufen, Triggerung über Differenzierung und Zelltod, nach denen ihre Totipotenz nicht gewährleistet werden kann. Plating-Zellen bei einer zu niedrigen Dichte, unzureichende Verteilung der Zellen während der Passage, oder unebene Beschichtung können ähnliche Probleme verursachen, da die Zellen werden große Klumpen vor Erreichen der Konfluenz bilden und die Zellen in diesen Klumpen wird differenzieren oder zu sterben. Keimbahn-Getriebe ist ein deutlich in Zellen, die misshandelt worden sind, auch wenn sie zum Zeitpunkt der Injektion gesund erscheinen, reduziert.

  1. Für eine konfluente 6-Well-Platte von Zellen absaugen Medium ab und wäscht mit 2-3 ml 37 ° C vorgewärmt PBS, Pipettieren es von den Zellen weg.
  2. Cover-Zellen mit 1 ml 1 × Trypsin-Lösung für 3-4 Minuten oder bis die Zellen gleichmäßig in kleine Klumpen verteilt.
  3. 1 ml Medium, um das Trypsin zu inaktivieren.
  4. Sammeln trypsiniert Zellen und Platten-Zellen (in der Regel 2 / 5 gut), ein frisch verkleistert 6-Well-Platte.

Freezing ES-Zellen

  1. Trypsinize einer konfluenten 6-Well-Platte (ca. 1 × 10 7 Zellen) wie oben beschrieben.
  2. Sammeln trypsiniert Zellen in 9 ml Medium und Pellet für 5 Minuten bei 1.000 Umdrehungen pro Minute.
  3. Absaugen mittel-und resuspendieren Zellpellet in 1 ml der frisch zubereiteten Einfriermedium. Aliquot von 0,5 ml Zellen in zwei Kryoröhrchen.
  4. Frieren Sie das Fläschchen bei -80 ° C über Nacht und Transfer zum flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung.

ChIP-on-Chip-VERFAHREN

Immunpräzipitation

  1. Formaldehyd Vernetzung Zellen (Suspensionszellen)
    1. Verwenden Sie 5 x 07 bis 1 Oktober x 10 8 Zellen pro Immunpräzipitation.
    2. Add frischen Formaldehyd zu der Zellsuspension in einer Konzentration von 1%.
    3. Brütet Zellen mit Formaldehyd-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
    4. Add 1 / 10 Volumen von 1,25 M Glycin, Formaldehyd zu stillen.
    5. Spülen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml 1x PBS.
    6. Pool-Zellen in 50 ml konische Röhrchen und drehen sich mit 700g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Pellet in 1,5 ml Lysispuffer. Transfer-Zellen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Flash-Freeze dreimal Zellen in flüssigem Stickstoff und die Verwendung eines Gewebes Mahlwerk Zellen zu brechen. Sobald Zellen vernetzt sind, können sie in gefrorenem Zustand bei -80 ° C unbegrenzt.

Herstellung von magnetischen Kügelchen (Schritte sind bei 4 ° C)

  1. Add 50 ul Dynal Perlen bis 1,5 ml low retention Mikroröhrchen. Richten Sie 1 Tube Perlen pro Immunpräzipitation. 1 ml Block-Lösung.
  2. Sammle Perlen mit Dynal MPC. Die Röhrchen in magnetischen Rack. Lassen Sie Perlen auf der Seite des Röhrchens zu sammeln. Dies dauert etwa 15 s. Invert Rack zweimal zu helfen, um Perlen zu sammeln. Überstand entfernen mit Pipette.
  3. 1 ml Block-Lösung und sanft resuspendieren Perlen bei der Entfernung von den Magnetstreifen aus dem Rack und Invertieren der Stange, wobei die Rohre noch an seinem Platz - entweder 10-20 mal, oder bis die Kugeln gleichmäßig zu resuspendieren. Sammle Perlen wie oben beschrieben (Schritt 2). Überstand entfernen mit Pipette.
  4. Wash Perlen in 1,5 ml Block-Lösung, wie in Schritt 3 noch einmal.
  5. Resuspendieren Perlen in 750 ul-Block-Lösung und fügen 10 ug Antikörper. Inkubation bei 4 ° C für mindestens 6h, oder über Nacht auf einem Rotator.
  6. Wash Perlen drei times in 1 ml Block-Lösung, wie in Schritt 3 beschrieben.

Zell-Beschallung

  1. Gefrorene Zellpellets von -80 ° C und Transfer Zellen Rohre für die Beschallung. Wir haben derzeit lieber auf den Grund zu einem Standard polupropylene, 15 ml konischen Rohr für die Beschallung zu verwenden. Wir schneiden das Rohr in zwei Stücke auf dem 5-ml-Markierung und entsorgen Sie die obere Hälfte. Tubes können mit Parafilm oder mit dem Schlauch Kappe abgedeckt werden beim Einrichten.
  2. Mit einem Mikrozentrifugenröhrchen Rack Position Rohr, so dass die Sonicator Sonde sitzt ca. 0,5-1,0 cm über dem Boden des Röhrchens. Achten Sie darauf, dass die Sonde zentriert ist und nicht in Kontakt mit den Seiten der Röhre. (Probe Positionierung kann, ob die Lösung Schäume oder nicht während der Beschallung zu beeinflussen. Typischerweise Schaumbildung zeigt, dass die beschallt DNA schlecht wird geschert werden.)
  3. Ultraschallbad Aufhängung 6 mal während 20 s. Die Proben sollten in einem Eis-Wasser-Bad während der Beschallung gehalten werden. Zur Verringerung Aufschäumen zunächst eingestellt Ausgangsleistung auf 0 und erhöhen manuell bis zur endgültigen Leistung während der ersten platzen. (Wenn es erhebliche Schaumbildung, können alle Blasen durch Zentrifugation bei 20.000 g durch vorsichtiges Resuspendieren des gesamten Materials entfernt werden, gefolgt, so dass keine Schaumblasen.)
  4. Spin bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C bis Pellet Schutt und Ernte der Überstand in ein 1,5 ml-Tube.
  5. Sparen Sie 50 ul Zelllysat aus jeder Probe als Input DNA. Lagerung bei -20 ° C. Zumindest ein Input DNA Aliquot sollte pro Charge beschallen Lysat gehalten werden. Beachten Sie, dass die Auswirkungen von den Auswirkungen der Beschallung und der daraus resultierenden Verteilung der Fragmentgrößen erst nach vernetzen Umkehr und Reinigung von DNA überprüft werden.

Chromatin Immunopräzipitation

  1. Fügen Sie die Chromatin-Gegenwert von 5 x 07 bis 1 Oktober x 10 8 Zellen von Cell Beschallung, Schritt 4, um die 50 ul Antikörper / Magnetic-Bead-Mix aus Vorbereiten magnetische Kügelchen, Schritt 6 mit einem Gesamtvolumen von 1 ml (Es kann möglich, mit Lysepuffer, wenn überhaupt) einstellen. Inkubieren über Nacht auf Rotator bei 4 ° C.

Waschen

  1. Sammle Perlen mit Dynal MPC. Die Röhrchen im Rack. Lassen Sie Perlen auf der Seite des Röhrchens zu sammeln. Dies sollte zu etwa 20 s. Invert Rack zweimal zu helfen, sammeln Sie alle Perlen. Überstand entfernen mit Pipette, wechselnde Spitzen zwischen den Proben.
  2. 1 ml Lysepuffer in jedes Röhrchen und sanft resuspendieren Perlen. Dies kann durch Entfernen der Magnetstreifen aus dem Rack und Invertieren der Rack erfolgen, mit Röhren noch an seinem Platz - 10-20 mal, oder bis die Beads gleichmäßig suspendiert. Sammle Perlen. Überstand entfernen, indem Pipette. Wiederholen Sie diesen waschen 5 weitere Male, wechselnde Spitzen zwischen Wäschen.
  3. Wash Perlen 6-mal in 1 ml IP1 Buffer, wie in Schritt 2 beschrieben.
  4. Wash Perlen 6-mal in 1 ml IP2 Buffer, wie in Schritt 2 beschrieben.
  5. Wash Perlen 6-mal in 1 ml TE 8,0 Puffer, wie in Schritt 2 beschrieben.
  6. Spin bei 960g für 3 min bei 4 ° C und entfernen Sie alle verbleibenden TE-Puffer.

Elution

  1. Add 210 ul Elutionspuffer eluieren und Material aus Perlen durch Inkubation die Röhrchen in einem 65 ° C Wasserbad für 15 min. Vortex kurz alle 2 min. Diese Inkubation kann bis zu 30 min, die zur Verbesserung Erholung des Eluats kann verlängert werden.
  2. Spin down Perlen bei 16.000 g für 1 min bei Raumtemperatur.
  3. Nehmen Sie 200 ul des Überstandes und Transfer zum neuen Rohr. Das Material kann bei -20 ° C eingefroren und über Nacht gelagert.

Crosslink Umkehr

  1. Reverse-Vernetzung der Immunpräzipitation DNA aus Elution, Schritt 3 durch Inkubation bei 65 ° C für mindestens 6 h und einem Maximum von 15 h (Längere Zeiten vernetzen Umkehr in der Regel zu einer erhöhten Lärm in der Microarray-Analyse ergeben). Diese Inkubation kann in einem Ofen durchgeführt werden, so dass das Rohr gleichmäßig und beheizt gibt es weniger Kondenswasser gebildet.
  2. Tauwetter 50 ul DNA-Eingang nach Beschallung vorbehalten (Schritt 13), fügen Sie 150 pl (3 Bände) Elutionspuffer und mischen. Rückwärts vernetzen dieser Eingang DNA durch Inkubation bei 65 ° C wie in Crosslink Umkehr, Schritt 1. Ab diesem Zeitpunkt ist jedes Rohr Immunpräzipitation oder Input-DNA als separates Rohr oder Probe für spätere Bearbeitungsschritte werden.

Reinigung DNA

  1. Add 8 ul 10 mg ml-1 RNaseA (0,2 mg ml-1 Endkonzentration), mischen durch Invertieren des Röhrchens mehrmals und bei 37 ° C für 2 h.
  2. Add 4 ul 20 mg ml-1 Proteinase K (0,2 pg ml-1 Endkonzentration) und mischen durch Invertieren des Röhrchens mehrmals und Inkubieren bei 55 ° C für 2 h.
  3. Add 400 ul Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (P: C: IA), Vortex-und getrennten Phasen mit 2 ml Schwere Phaselock Rohr (folgen Sie den Anweisungen von Eppendorf zur Verfügung gestellt).
  4. Wenn die P: C: IA-Lösung ist zu alt oder ist bei niedrigen pH-Wert, wird es degr werdenadation der DNA, was zu Lärm in der Microarray-Analyse und der Verlust der Nachweis der gültigen Ziele.
  5. Transfer wässrige Schicht auf neue Zentrifugenröhrchen mit 16 ul 5 M NaCl (200 mM) Endkonzentration) und 1,5 ul 20 μ ul-1 Glykogen (30 ug Gesamt).
  6. Add 800 ul EtOH. Inkubieren über Nacht bei -20 ° C oder 30 min bei -80 ° C.
  7. Spin bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C bis Pellet DNA. Wash Pellets durch Zugabe von 500 ul 80% EtOH, Vortexen zu Pellet und Spinnen wieder bei 20.000 g für 5 min bei 4 ° C.
  8. Entfernen Sie alle verbleibenden 80% EtOH. Drehen Sie das Röhrchen kurz, um alle verbleibenden Flüssigkeit zu sammeln und zu entfernen mit einem pipetteman Flüssigkeit, die Vermeidung der Pellets. Lassen Rohre an der Luft trocknen, bis Pellets nur trocken: Pellets sollte trotzdem noch eine feuchte Aussehen. Resuspendieren jedes Pellet in 70 ul 10 mM Tris-HCl, pH 8,0.
  9. Übertrocknung dieser Pellets können sie nur schwer zu resuspendieren, oder verpflichtet ist, blättert nicht ab und lösen sich von der Seite der Röhre.
  10. Optional: Speichern 15 ul Immunpräzipitation Probe für eine spätere Verwendung. Dieses Material kann verwendet werden, um Gen-spezifische PCR Bestätigung der Microarray-Ergebnisse durchzuführen.
  11. Quantify Konzentration durch UV-Absorption (260 nm).

NB: Die folgenden Schritte, einschließlich Bibliothek Vorbereitung und Verstärkung nutzen ein modifiziertes GenomePLex WGA-Kit mit 10-fach Amp Mix von Sigma ohne dNTPs:

Bibliothek Vorbereitung

Erhältlich in den GenomePLex WGA-Kit mit 10-fach Amp Mix von Sigma

  1. Add 2 ul 1X Bibliothek Vorbereitung Buffer zu 10 ul der DNA-Probe aus der Reinigung DNA, Schritt 11 in einem PCR-Röhrchen.
  2. Add 1 ul-Bibliothek Stabilisierung Solution.
  3. Vortex gründlich durch Zentrifugation zu konsolidieren, und in den Thermocycler bei 95 ° C für 2 Minuten.
  4. Danach wird die Probe auf Eis, durch Zentrifugation durch Zentrifugation zu konsolidieren, und dann wieder zu Eis.
  5. Add 1 ul-Bibliothek Vorbereitung Enzyme, gründlich vortexen und anschließend kurz zentrifugieren.
  6. Wägegut in einem Thermocycler und inkubieren wie folgt:
    • 16 ° C für 20 Minuten
    • 24 ° C für 20 Minuten
    • 37 ° C für 20 Minuten
    • 75 ° C für 5 Minuten
    • 4 ° C zu halten
  7. Nehmen Sie Proben von Thermocycler und kurz zentrifugieren. Die Proben können sofort verstärkt werden, oder bei 20 ° C für 3 Tage gespeichert.

Verstärkung

Erhältlich in den GenomePLex WGA-Kit mit 10-fach Amp Mix von Sigma

  1. Ein Master-Mix wird durch Addition der folgenden Reagenzien, die 15 ul Reaktion aus Schritt 3 vorbereitet, unten:
    • 7,5 ul 10X Amp Mix (ohne dNTPs)
    • 5,0 ul der WGA-DNA-Polymerase
    • 3,0 ul einer 10 mM dNTP (je) Lager (Endkonzentration 0,4 mM)
    • Bringen Endreaktionsvolumen auf 75 ul mit Nuklease-freiem Wasser
  2. Vortex gründlich. Kurz zentrifugieren und beginnen Thermocycling.
    • Initiale Denaturierung 95 ° C für 3 Minuten
    • Führen Sie 14 Zyklen wie folgt:
    • Denaturieren 94 ° C für 15 Sekunden
    • Glühen / Extend 65 ° C für 5 Minuten
    Nach dem Radfahren abgeschlossen ist, halten die Reaktionen bei 4 ° C oder bei -20 ° C bis zur Analyse bereit oder Reinigung.
  3. Purify die DNA mit PCR Purification ® Kit von Quiagen nach den Anweisungen des Herstellers und zu quantifizieren Konzentration durch UV-Absorption (260 nm).
  4. Führen Sie erneut einen Zyklus von Verstärkung aus der Bibliothek Vorbereitung, Schritt 1 bis Amplification, Stufe 2, mit folgenden Anpassungen.

    • Hinsichtlich der Menge der benötigten DNA aus Schritt 3 oben, um die Fragmentierung zu initiieren: Wenn die Konzentration der DNA ist etwa 200-300 g / ml, für 2,5 ul Probe und passen mit Wasser auf ein Endvolumen von 10 ul.
    Wenn die Konzentration der DNA ist etwa 50-60 pg / ml, verwenden Sie 5 ul der Probe und passen mit Wasser auf ein Endvolumen von 10 ul.


    • In diesem zweiten Amplifikation Prozess wird dNTPs mit dTTPs für den Master-Mix Austausch für eine Mischung mit 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dCTP und 8 mM dTTP und 2 mM dUTP in der gleichen Konzentration, dass die bisherige Mischung.

  5. Messen DNA mittels UV-VIS Spektralphotometer (260 nm). Normalerweise ist größer als 9 pg amplifizierte DNA von jeder Reaktion erhalten.

    NB: Die Beschriftung der DNA-Targets mit der GeneChip durchgeführt ® WT doppelsträngige DNA-Terminal Labelling Kit von Affymetrix nach den Anweisungen des Herstellers, wie nachfolgend beschrieben:

Fragment verstärkt Ziele

  1. Fragment der Proben unter Verwendung der entsprechenden Tabelle unten je nachdem, was Array-Typ wird das Ziel sein Hybrid-das Meerwasser mit.

    Tabelle 1. Fragmentation Mix für einzelne Arrays
    Component Volume / Betrag in 1 Rxn
    Doppelsträngige DNA 7,5 ug
    10X cDNA Fragmentation 4,8 ul
    UDG, 10 U / ul 1,5 ul
    APE 1, 100 U / ul ul 2,25
    Nuklease-freies Wasser bis zu 48 ul
    Erhältlich in den GeneChip ® WT doppelsträngige DNA-Terminal Labelling Kit von Affymetrix

    Tabelle 2. Fragmentation Mix für Multi-Array-Sets
    Component Volume / Betrag in 1 Rxn
    Doppelsträngigen DNA-9 ug
    10X cDNA Fragmentation 4,8 ul
    UDG, 10 U / ul 1,5 ul
    APE 1, 100 U / ul ul 2,25
    Nuklease-freies Wasser bis zu 48
    Erhältlich in den GeneChip ® WT doppelsträngige DNA-Terminal Labelling Kit von Affymetrix
  2. Set up Fragmentierung Mix entweder nach den Tabellen oben. Flick-mix und Spin-down der Rohre.
  3. Inkubieren Sie die Reaktionen an:
    • 37 ° C für 1 h.
    • 93 ° C für 2 min.
    • 4 ° C für mindestens 2 Minuten.
  4. Flick-mix, Spin-down der Rohre und Transfer 45 ul der Probe in ein neues Röhrchen.
  5. Nehmen Sie 2 ul von jeder Probe für Gel-Shift-Analyse.

Label fragmentiert doppelsträngige DNA

  1. Bereiten Sie die doppelsträngige DNA-Labelling Mix wie in der folgenden Tabelle beschrieben:

    Tabelle 3. Zusammensetzung der doppelsträngigen DNA-Labelling Mix
    Component Volume / Betrag in 1 Rxn
    5X TdT-Puffer 12 ul
    TdT 2 ul
    DNA Labelling Reagent, 5 mM 1 ul
    Gesamtvolumen 15 ul
    Erhältlich in den GeneChip ® WT doppelsträngige DNA-Terminal Labelling Kit von Affymetrix
  2. Add 15 ul des doppelsträngigen DNA Labeling Mix, um die DNA-Proben, Flick-mix und Spin sie nieder.
  3. Inkubieren Sie die Reaktionen an:
    • 37 ° C für 60 min.
    • 70 ° C für 10 min.
    • 4 ° C für mindestens 2 min.
  4. Nehmen Sie 2 ul von jeder Probe für Gel-Shift-Analyse.

Gel-Shift-Analyse

  1. Bereiten Sie einen 4% igen Agarosegel.
  2. Inkubieren Proben aus Fragment verstärkt Ziele, Schritt 5 und Label fragmentiert doppelsträngige DNA, Schritt 4 bei 65 ° C für 2 min.
  3. Add 10 ul Streptavidin (1 mg / ml), und inkubieren Proben bei Raumtemperatur für 5 min.
  4. Run Proben aus Schritt 3 auf einem 4% igen Agarosegel (Gel-Shift-Analyse, Schritt 1), um die Verschiebung der Migration der Kennzeichnung von Produkten zu prüfen.

Array Hybridisierung und Waschen Array

Aufgeführt von der Genomic Center der University of California Riverside.

Array-Analyse

Durchgeführt durch rechnerische Analyse.

Pufferzusammensetzungen:

Block-Lösung: PBS + 0,5% Rinderserumalbumin (BSA).

Lysis Buffer: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5
140 mM NaCl
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0,1% SDS
1mM PMSF
Finale pH 7,5

IP1: Lysis Buffer + 500 mM NaCl

IP2: 10 mM Tris-HCl
250 mM LiCl
1 mM EDTA
0,5% NP-40
0,5% Sodium Dioxycholat
Finale pH 8,0

TE: 10 mM Tris, pH 7,4
1 mM EDTA

Finale pH 8,0
Elutionspuffer: TE-Puffer + 1% SDS.

Discussion

Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) bietet eine wertvolle Technik für die Präparation von Chromatin-basierte Prozesse während der zellulären Differenzierung. Voraussetzungen für den Erfolg dieser Methode sind gute Antikörper und die Verfügbarkeit von Chromatin aus Kontroll-Zellen oder Gewebe, die das Antigen von Interesse fehlt. Durch die Kombination von ChIP mit DNA-Mikroarray-Technologie, riesige Mengen an Informationen eingeholt werden können. Die Validierung der ChIP Ergebnisse hängt von der Verfügbarkeit geeigneter Testsysteme, dass die dynamische Zuordnung von Proteinen, Protein-Modifikationen und / oder RNA mit der Ausführung der biologischen Prozesse im Zell-Entwicklung verknüpfen können.

Acknowledgements

Die vorliegende Arbeit wurde durch eine Spende (RS1-00477-1) vom California Institute for Regenerative Medicine (CIRM), um FS unterstützt

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Poteinase-K Reagent Roche Group #EO0491
RNase-A Reagent Fermentas #EN0531
formaldehyde 37% Reagent EMD Millipore FX040-13
Chloroform Reagent EMD Millipore 3150
Ethanol Reagent Goldshield
phenol:chloroform:isoamyl alcohol Reagent Invitrogen 15593-031
SA, fraction V Reagent EMD Millipore 2930
Dubecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190
HEPES Reagent EMD Millipore 5330
Sodium Chloride Reagent Fisher Scientific S271-10
EDTA Reagent EMD Millipore 4050
Triton X-100 Reagent EMD Millipore 9410
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent JT Baker 4095-02
Lithium chloride Reagent EMD Millipore 5910
Tris-HCl Reagent EMD Millipore 9230
NP-40 Reagent Calbiochem 492015
Deoxycholic acid, sodium salt Reagent Fisher Scientific BP349-100
Ammonium acetate Reagent Applichem 631-61-8
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
dynalbeads, protein A Reagent Invitrogen 100.02D
dynalbeads, protein G Reagent Invitrogen 100.04D
1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme Other Phenix Research Products MAX-815S
Phase Lock Gel Light, 2.0 ml Reagent Eppendorf 955154037

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
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Comments

5 Comments

  1. how to prepare ChIp-DNA sample for sequencing?( single-End; solexa)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 30, 2008 - 9:17 AM
  2. Hi
    Thanks for the protocol. Do you have any protocol for less than 10,000 cells?
    Ramji

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2008 - 7:27 PM
  3. hi, search in Nature protocols as microChIP. This protocol was made for up to minimun of 100 cells or more. This is great protocol best wishes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2009 - 8:56 PM
  4. what is a good positive control antibody to show that the procedure works?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 18, 2010 - 3:47 PM
  5. It is a very general question, but you can use histone antibodies as positive controls.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 18, 2010 - 5:01 PM

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