El aislamiento de las primeras células madre hematopoyéticas murinas saco vitelino y AGM

Published 6/27/2008
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Biology

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Este video muestra la forma de micro-disección del saco vitelino y la aorta-gonadal-mesonefros región a partir de embriones y el uso de la citometría de flujo para clasificar las células madre hematopoyéticas.

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Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM. J. Vis. Exp. (16), e789, doi:10.3791/789 (2008).

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Abstract

En el embrión de ratón, la hematopoyesis temprana se produce de forma simultánea en múltiples órganos, que incluye el saco vitelino y la región de la aorta-gónada-mesonefros. Estas regiones son cruciales en el establecimiento del sistema de la sangre en los embriones y conduce a la eventual movimiento de las células madre en el hígado fetal y el desarrollo de células madre adultas en el bonemarrow. Las primeras células madre hematopoyéticas pueden ser aislados de estos órganos a través de microdisección del embrión seguido de la clasificación de citometría de flujo para obtener una población más puro. No queda claro cómo estas poblaciones de células madre contribuyen a la piscina de células madre fetales y adultos. Además, nuestro laboratorio investiga cómo las células madre a principios funcionalmente diferentes de las células madre fetales y adultas hematopoyéticas. Además, nuestro tipo de laboratorio de diferentes poblaciones de células madre hematopoyéticas y prueba de su papel funcional en el contexto de una gran variedad de modelos genéticos. En este video, se demuestra el procedimiento de disección de micro-que comúnmente usamos, y también muestran los resultados de un plotfter FACS típica de aislamiento de estas poblaciones es raro, es posible llevar a cabo una serie de ensayos funcionales que incluyen: ensayos de la colonia y los trasplantes de médula ósea.

Protocol

La disección y aislamiento de las primeras células madre hematopoyéticas murinas saco vitelino y la región aorta-gonadal-mesonefros

  1. Antes de comenzar, es importante que todos los reactivos y las herramientas necesarias para el procedimiento:
    • Tijeras
    • Fórceps, tamaño 4, y de grado quirúrgico dobladas en la punta con fórceps, de tamaño 5 / 45 (opcional)
    • Agujas de calibre 30 con la jeringa
    • Placas de Petri de 35 mm y 100 mm
    • PBS con 10% y 20% de suero fetal bovino
    • y por último, la colagenasa
  2. Para comenzar la disección, es necesario recoger los cuernos uterinos de una mujer embarazada a los 10,5 días después de la concepción.
  3. Los animales son sacrificados de acuerdo con los procedimientos aprobados. Usamos la asfixia de dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical.
  4. Abdomen de la hembra es húmedo con etanol y se abre la piel con unas tijeras.
  5. La celebración de la piel con pinzas, los cortes adicionales se realizan para abrir el peritoneo.
  6. Se abre el abdomen y los cuernos uterinos se pueden visualizar. El uso de pinzas para sostener los cuernos uterinos, cortar los extremos distal y el centro especial de dos cuernos.
  7. Cuernos uterinos se colocan en una placa de Petri que contiene PBS frío con FBS al 10% para eliminar los tejidos del útero.
  8. Utilizando el tamaño de 4 pinzas y trabajando bajo el microscopio, retire suavemente el tejido endometrial de alrededor de cada embrión concebido, teniendo cuidado de no perforar la placenta.
  9. Una vez retirados, los embriones se colocan en un plato fresco con PBS frío y 10% de SFB.
  10. Retire con cuidado el tejido de la placenta para revelar el embrión encerrado en el saco vitelino mediante el uso de las pinzas para cortar el embrión encerrado saco vitelino fuera de la placenta en su momento. El saco vitelino contiene arterias vitelino, y una parte del cordón umbilical, puede ser burlado suavemente lejos del embrión y dejar de lado en el hielo de la disociación.
  11. El embrión se mueve a una pequeña placa de Petri con niveles mínimos de PBS con 10% de SFB - sólo lo suficiente para mojar el embrión, pero no demasiado. Mantener los niveles óptimos del embrión inmóvil mientras que la placa se agita lentamente, manteniendo el embrión en su lugar durante la disección.
  12. Cambie a la agujas de calibre 30, que se utilizan para eliminar las partes superior e inferior del embrión mediante la reducción por encima de las patas delanteras y por debajo de las patas traseras. Familiarizarse con el uso de agujas como instrumentos de corte puede tomar un poco de práctica. Un método de utilización repetida de pequeños cortes al cruzar las agujas disecar el tejido, con la aguja en la mano dominante para que actúe como una guía de corte de la aguja que se celebra en la mano no dominante.
  13. Retire la parte dorsal del embrión. Este es el tejido que contiene los somitas. Suavemente cortar el tejido dorsal más sin dejar de ser una distancia suficiente de la aorta (línea roja) para evitar que los Knicks. Corte de la aorta se traduciría en la pérdida de sangre y la imposibilidad de visualizar fácilmente su ubicación. Una vez más, haciendo pequeños cortes con las agujas es vital para mantener un lugar de corte preciso.
  14. Impulsar el tejido extra de distancia fuera de la vista y a su vez el embrión alrededor para cortar el tejido ventral, una vez más el corte tan cerca de la aorta como sea posible sin que knicking. Los cortes se harán muy lejos de la localización óptima se traduciría en tejidos abdominales están presentes, que se puede quitar una vez que la Junta está aislado.
  15. La posición del embrión con su cara dorsal hacia abajo o de espaldas contra la placa. Splay suavemente el embrión abierta presionando los lados hacia abajo y la visualización de la ubicación de las crestas gonadales. Estos se encuentran un poco fuera del centro como estructuras tubulares a cada lado de la aorta.
  16. Completar la disección mediante la eliminación de los tejidos lado el exceso de uso de las técnicas de corte igual que antes. Una vez que el tejido lado del embrión se retira, entonces el embrión se pone de cabeza para extraer el tejido lado restante.
  17. En este punto, la Junta General para detectar cualquier exceso de tejido que se puede quitar fácilmente con las agujas, sin daño a la aorta o las gónadas. Eliminar el exceso de cantidad de resultados posibles en un mejor aislamiento de la población de células madre ya que contamos con sólo unos pocos marcadores de superficie celular para la purificación.
  18. Usando las pinzas de punta doblada, con suavidad recoger cada Junta y el lugar en PBS frío con FBS al 10% hasta el momento de la disociación.

La disociación y análisis FACS

  1. Para disociar el tejido, sacos de primera yema de lugar y las juntas generales en tubos separados.
  2. Girar brevemente a los tejidos de pellets y descartar PBS con 10% de SFB.
  3. Resuspender los tejidos en el 0,25% de colagenasa en PBS con 20% de SFB, con un volumen suficiente para cubrir adecuadamente los tejidos.
  4. Incubar los tejidos a 37 grados. 25-30 minutos para las juntas generales y 35 para 40 minutos saco de la yema.
  5. Al final de la incubación, los tejidos con suavidad pipeta hacia arriba y abajo a la disociación en suspensiones de células individuales.
  6. Lavar los tejidos con exceso de wi PBSdía 10% de SFB, que sedimenten las células y resuspender en agua dulce PBS estéril con 10% de SFB.
  7. Para el análisis de FACS, las células se tiñen de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Utilizamos un FACSAria de BD Biosciences para realizar citometría de flujo. Debido al tamaño y la fragilidad de las células embrionarias, la apertura de clasificación se ajusta a un diámetro mayor que para un adulto las células hematopoyéticas, que también estudio en el laboratorio. Del mismo modo, la presión se ajuste a menos que las condiciones requeridas por un adulto las células hematopoyéticas. Por ejemplo, la clasificación en el FACSAria, el tamaño de la boquilla sería de 100 micras y la presión de clase es de 30 psi.
  8. Para los análisis de células madre, células de triple positiva que expresa la cKit marcadores, CD34, CD41 y son aislados y ordenados desde el saco vitelino y positivos doble (cKit, CD34) están aislados de la Junta General de Accionistas a través de la FACS. Un gráfico típico sería el siguiente: cKit células positivas son analizadas para CD34 y CD41 de forma simultánea o individualmente. Por lo general, las células presentan una gradación de positividad para cada marcador con la población de células madre que se encuentran como un subconjunto de la población positiva. Estos gráficos nos muestran que hemos logrado un buen rendimiento celular con 100 a 300 células por saco de la yema y la Junta General de Accionistas por.

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