التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (MES) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا الفيديو يوضح كيفية السلوك في المختبر من تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للهيئات مضغي الشكل باستخدام طريقة قطرة شنقا.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الخلايا الجذعية لديها القدرة على تطوير ملحوظ في العديد من أنواع مختلفة من الخلايا. عندما يقسم الخلايا الجذعية ، فإن كل خلية جديدة لديها القدرة على البقاء إما أو تصبح الخلايا الجذعية نوع آخر من الخلايا ذات وظيفة أكثر تخصصا ، وهذا العلم هو واعد كبار العلماء لدراسة إمكانية خلية مقرها العلاجات لعلاج المرض. عندما الثقافة في الوقف بدون عوامل antidifferentiation ، والخلايا الجذعية الجنينية تفرق بشكل عفوي وشكل ثلاثي الأبعاد مجاميع متعددة الخلايا. وتسمى هذه المجاميع الخلية الهيئات مضغي الشكل (EB). اعدام ثقافة الإفلات من تشكيل EB المستخدمة على نطاق واسع طريقة الاستقراء. الجزء السفلي من قطرة شنقا تقريب يسمح تجميع الخلايا ES الخلايا التي يمكن أن توفر بيئة جيدة زارة التربية والعلم لتشكيل EBS. يمكن السيطرة على عدد من الخلايا ES aggregatied في انخفاض شنقا متفاوتة عدد من الخلايا في خلية تعليق أولي على أن تكون معلقة على قطرة من غطاء طبق بيتري. باستخدام هذا الأسلوب يمكن أن نشكل بتكاثر EBS متجانسة من عدد محدد مسبقا من الخلايا ES.

Protocol

  1. يهلم T75 القارورة باستخدام محلول 0.1 ٪ الجيلاتين واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 زراعة الأنسجة حاضنة قبل يوم واحد بين عشية وضحاها.
  2. أخرج من احتضان خلايا MES ، نضح المتوسط ​​، شطف خلية ثقافة وفاق مع برنامج تلفزيوني ، إضافة 0.05 ٪ إلى حل التربسين معطف أسفل الطبق (2 صفيحة ml/100mm).
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 1 دقيقة ، حتى الخلايا هي النزع قبالة لوحة.
  4. متمزج بلطف (الماصة صعودا وهبوطا) الخلايا trypsinized أربع إلى ست مرات لتفريق الخلايا وفاق مع ماصة باستير توصيله. نقل الخلايا ES فرقت في أنبوب 15 مل تحتوي على أجهزة الطرد المركزي المخروطية prewarmed (37 درجة مئوية) MES المتوسطة.
  5. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي. نضح لطاف ، أضف 10 مل من وزارة التربية والعلم المتوسطة ماصة صعودا وهبوطا لتشكيل تعليق خلية واحدة.
  6. نقل تعليق خلية في قارورة T75 قبل المغلفة مع 0.1 ٪ في الجيلاتين واحتضان 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 لمدة ساعة واحدة

    * بعد ساعة واحدة ، قد أولت الليفية إلى لوحة الخلايا الجذعية ولكن تبقى في المتوسط. ماصة يصل المتوسط ​​لجمع الخلايا الجذعية.

  7. تدور الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، ونضح قبالة المتوسطة زارة التربية والعلم. ثم يضاف 10 مل أخرى من المتوسطة وزارة التربية والعلم تمايز الخلايا عن طريق resuspend pipetting المتكررة حتى يبدو أن هناك تعليق غرامة من الخلايا.
  8. عدد الخلايا التي تحتوي على التفريق المتوسطة عدادة الكريات تستخدم لتخفيف تعليق الخلايا الجذعية إلى التركيز بين 400 إلى 500 خلية لكل 20ul (20ul/drop) في حوض العقيمة.
  9. رفع الغطاء ، عكس بعناية ووضعه على قمة من صحن يحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني. باستخدام ماصة الأقنية ، وجعل الصفوف من قطرات 20ul على السطح حتى تحول الداخلي للغطاء من النسيج صحن الثقافة.
  10. المكان بعناية الطبق في الحاضنة لمدة 2 ايام. بعد يومين ، بدوره بعناية على مدى غطاء لوحة ، ونضح 180 UL متوسطة التمايز الطازجة ووضع عدة قطرات في البئر لوحة ultralow مرفق 96 - جيدا. ثم تراجع لاقط مع قطرات ماصة ونقلها ، واحدة تلو الأخرى ، لوحة 96 - جيدا. وضع لوحات في الحاضنة لمدة 3 أيام دون عائق.
  11. معطف كل بئر لزراعة الأنسجة 48 لوحة جيدا مع 300ul من 0.1 ٪ الجيلاتين. بعد إضافة الجيلاتين ، واحتضان لوحة ليلا 37 درجة مئوية قبل يوم واحد قبل نقل EBS.
  12. في اليوم التالي ، نضح في الجيلاتين من 48 لوحة جيدا. ثم يضاف 300 UL متوسطة التمايز إلى كل بئر. نقل الصفائح الحديدية من 96 إلى جانب لوحات 48 الجيلاتين المغلفة جيدا واحدة تلو الأخرى. تغيير المتوسطة في اليوم التالي ثم تغيير المتوسط ​​كل يوم للحفاظ على الخلايا.
  13. وينبغي أن تقلصات cardiaomyocyte عفوية يكون واضحا في غضون 7 أيام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مساوئ أسلوب قطرة شنقا هي كما يلي : يقتصر حجم السائل لتنخفض إلى أقل من 50ul بسبب الحفاظ على قطرات المعلقة على غطاء من التوتر السطحي ، وانه من المستحيل تغيير وسيلة لتعليق قطرات. الملاحظة تشكيل EBS في قطرات مباشرة مع المجهري هو أيضا من الصعب جدا خلال زراعة. مزيد المزيد ، وطريقة قطرة شنقا يتكون من خطوتين ، وبالتالي ، قد يكون خطوة من سلسلة من الأسلوب قطرة شنقا يكون مزعجا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics