בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

סרט הווידאו הזה מדגים כיצד ההתנהגות בידול במבחנה של תאים עובריים בעכבר לגופים embryoid בשיטת ירידה תלוי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

לתאי גזע יש פוטנציאל מדהים להתפתח הרבה סוגי תאים שונים. כאשר תא גזע מתחלק, בכל תא חדש יש פוטנציאל או להישאר תא גזע או להיות סוג אחר של תא עם פונקציה מיוחדת יותר, זה מבטיח של המדע המוביל מדענים לחקור את האפשרות של טיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות. כאשר התרבות השעיה ללא גורמי antidifferentiation, בתאי גזע עובריים ספונטני להבדיל צורה תלת ממדית אגרגטים תאיים. אגרגטים אלה התא נקראים גופים embryoid (EB). תלוי תרבות ירידה היא היווצרות בשימוש נרחב EB שיטת האינדוקציה. תחתית מעוגלת הירידה תלוי מאפשר צבירה של תאים ES אשר יכול לספק תאים MES סביבה טובה עבור יצירת EBS. מספר תאים ES aggregatied לירידה תלוי יכול להיות נשלט על ידי שינוי מספר התאים בתרחיף התא הראשוני להיות תלויים כמו ירידה מן המכסה של צלחת פטרי. באמצעות שיטה זו אנו יכולים reproducibly טופס EBS הומוגנית מתוך מספר קבוע מראש של תאים עובריים.

Protocol

  1. Gelatinize T75 הבקבוק באמצעות פתרון ג'לטין 0.1% ו צלחת דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 רקמה תרבות יום חממה בן לילה לפני.
  2. להוציא את התאים מן MES דגירה, לשאוב את המדיום, לשטוף את תרבית תאים ES עם PBS, להוסיף פתרון טריפסין 0.05% ל המעיל התחתון של המנה (2 צלחת ml/100mm).
  3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 דקות, עד התאים ומשילה מעליה את הצלחת.
  4. בעדינות triturate (pipet למעלה ולמטה) התאים trypsinized ארבע עד שש פעמים כדי לפזר את תאים ES עם פקוק פיפטה פסטר,. העברת התאים ES התפזרו לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה חרוטי המכיל prewarmed (37 ° C) בינוני MES.
  5. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה. לשאוב supernatant, הוסף 10 מ"ל של מדיום MES ו פיפטה מעלה ומטה כדי ליצור השעיה תא בודד.
  6. העברת ההשעיה לתוך תא בקבוק T75 מראש מצופה 0.1% לטין לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך שעה אחת

    * לאחר כשעה, fibroblasts יש המצורפת הצלחת אבל בתאי גזע להישאר בינוני. פיפטה את המדיום כדי לאסוף את בתאי גזע.

  7. ספין התאים בסל"ד 1000 דקות 5 ו לשאוב את המדיום MES. ואז להוסיף עוד 10 מ"ל של מדיום בידול MES ו resuspend התאים על ידי pipetting חוזרות עד שנראה השעיה וקנס של תאים.
  8. ספירת תאים עם מדיום להשתמש hemocytometer בידול לדלל את ההשעיה בתאי גזע כדי בריכוז של 400-500 תאים לכל 20ul (20ul/drop) באגן סטרילית.
  9. הרם את המכסה, להפוך אותו בזהירות ומניחים אותו על גבי צלחת המכילה 10 מ"ל של PBS. בעזרת פיפטה רב, לעשות שורות של טיפות 20ul על פני השטח עד שהפך הפנימי של המכסה של המנה בתרבית רקמה.
  10. בזהירות במקום צלחת בחממה במשך 2 ימים. לאחר יומיים, בזהירות להתהפך לכסות את הצלחת, לשאוב 180 בידול ul בינוני טרי לשים מספר טיפות לתוך הבאר של צלחת 96-מצורף גם ultralow. ואז הטנדר טיפה עם טפטפת טיפות והעברה, אחד על אחד, הצלחת 96-היטב. מניחים את הלוחות לתוך החממה באין מפריע במשך 3 ימים.
  11. מעיל אחד טוב של 48-היטב בתרבות רקמה צלחת עם 300ul של 0.1% ג'לטין. לאחר הוספת ג'לטין, דגירה את הצלחת לילה בשעה 37 ° C יום אחד קדימה לפני העברת EBS.
  12. למחרת, לשאוב את הג'לטין מהצלחת 48-הבאר. ואז להוסיף 300 ul של המדיום בידול היטב כל אחד. העברת EBS של 96 צלחות היטב את הג'לטין 48 מצופה צלחות גם אחד על אחד. שנה את בינונית למחרת ולאחר מכן שנה את בינונית בכל יום אחר כדי לשמור על התאים.
  13. התכווצויות cardiaomyocyte ספונטנית צריך להיות ברור תוך 7 ימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החסרונות של שיטה טיפה תלויה הן כדלקמן: נפח נוזל טיפה מוגבל פחות 50ul עקב שמירה על טיפות תלויות על מכסה ידי מתח פנים, ואי אפשר לשנות את המדיום לתליית טיפות. תצפית של יצירת EBS בטיפות ישירות עם מיקרוסקופיה הוא גם קשה מאוד במהלך הטיפוח. עוד יותר, השיטה ירידה תלוי מורכב משני שלבים, אם כן, סדרה של צעד של השיטה ירידה תלוי עשוי להיות בעייתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics