En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

Biology

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Summary

Este vídeo demuestra cómo llevar a cabo en la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón a cuerpos embrioides utilizando el método de gota.

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Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

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Abstract

Las células madre tienen el potencial extraordinario para convertirse en muchos tipos celulares diferentes. Cuando una célula madre se divide, cada nueva célula tiene la capacidad de seguir siendo una célula madre o convertirse en otro tipo de célula con una función más especializada, Esta prometedora de la ciencia está llevando a los científicos a investigar la posibilidad de terapias basadas en células para tratar la enfermedad. Cuando la cultura en suspensión sin factores de antidiferenciación, las células madre embrionarias se diferencian y espontánea forma tridimensional agregados multicelulares. Estos agregados de células se llaman cuerpos embrioides (EB). Colgando cultura gota es una formación muy utilizado EB método de inducción. La parte inferior redondeada de gota colgante permite la agregación de células madre embrionarias que pueden proporcionar las células MES un buen ambiente para la formación de EBS. El número de células madre embrionarias aggregatied en una gota se puede controlar variando el número de células en la suspensión inicial de la célula para ser colgado como una gota de la tapa de la placa de Petri. El uso de este método que puede reproducible forma homogénea EBs de un número determinado de células madre embrionarias.

Protocol

  1. Gelatinizar T75 frasco con una solución de gelatina al 0,1% y la placa se incuba en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejidos durante la noche un día antes.
  2. Saque las células MES de incubar, se aspira el medio, enjuague el cultivo de células ES con PBS, se añaden 0,05% de solución de tripsina para cubrir el fondo del plato (2 placas ml/100mm).
  3. Se incuba a 37 ° C durante aproximadamente un minuto, hasta que las células son desprendimiento de la placa.
  4. Suavemente triturar (pipeta de arriba y abajo) de las células trypsinized cuatro a seis veces para dispersar las células madre embrionarias con una pipeta Pasteur conectada,. Transferencia de las células madre embrionarias se dispersaron en un tubo de centrífuga de 15 ml cónicos que contengan precalentado (37 ° C) medio MES.
  5. Recoger las células por centrifugación. Aspirar el sobrenadante, agregar 10 ml de medio de MES y la pipeta hacia arriba y abajo para formar una suspensión de células individuales.
  6. La transferencia de la suspensión celular en un matraz T75 pre-recubiertas con gelatina al 0,1% y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 durante una hora

    * Después de una hora, los fibroblastos se han adherido a la placa, pero las células madre permanecen en el medio. Pipeta hasta el medio para recolectar las células madre.

  7. Vuelta a las células a 1000 rpm durante 5 min y se aspira el medio de MES. A continuación, añadir otra de 10 ml de medio de diferenciación MES y volver a suspender las células mediante pipeteo repetitivo hasta que parece que hay una suspensión fina de las células.
  8. Recuento de células con un medio de diferenciación hemocitómetro utilizar para diluir la suspensión de células madre a una concentración de 400 a 500 células por 20 ul (20ul/drop) en un recipiente estéril.
  9. Levante la tapa, con cuidado invertir y colocar en la parte superior de la cápsula que contiene 10 ml de PBS. Con una pipeta multicanal, hacer filas de las gotas de 20 ul en la superficie interna hasta convertido de la tapa de la placa de cultivo de tejidos.
  10. Coloque cuidadosamente el plato en la incubadora por 2 días. Después de dos días, con cuidado a su vez sobre la cubierta de la placa, aspirar el medio 180 ul diferenciación fresca y poner unas gotas en el pocillo de una placa de 96 pozos ultra adjunto. Luego de recogida la caída de las gotas de pipeta y la transferencia, una por una, a la placa de 96 pocillos. Coloque las placas en el reposo durante tres días incubadora.
  11. Cubrir cada pocillo de una placa de tejido de 48 pocillos con 300ul de 0,1% de gelatina. Después de añadir la gelatina, se incuba la placa durante la noche a 37 ° C, un día antes antes de la transferencia de la EBS.
  12. Al día siguiente, se aspira que la gelatina de la placa de 48 pocillos. A continuación, añadir 300 ul de medio de diferenciación a cada pocillo. Transferir el EBs de la 96 y placas a los 48 y recubiertos de gelatina placas de uno por uno. Cambiar el medio al día siguiente y luego cambiar el medio de cada dos días para mantener las células.
  13. Contracciones espontáneas cardiaomyocyte debe ser evidente en los últimos 7 días.

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Discussion

Las desventajas del método de gota son los siguientes: el volumen de líquido de una caída se limita a menos de 50 ul por el mantenimiento de las gotas colgando de la tapa por la tensión superficial, y es imposible cambiar el medio para colgar gotas. La observación de la formación de EBS en gotas directamente con el microscopio es también muy difícil durante el cultivo. Más aún, el método de la gota colgante consta de dos pasos, por lo tanto, una serie de pasos del método de gota puede ser un problema.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

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