In vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (MES) cellen met behulp van de Opknoping neerzetten

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Deze video laat zien hoe in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen te voeren om embryoid lichamen met behulp van de opknoping drop methode.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stamcellen hebben de opmerkelijke potentie uit te groeien tot een groot aantal verschillende celtypen. Wanneer een stamcel deelt, elke nieuwe cel de mogelijkheid om ofwel te blijven een stamcel of worden een ander type cel met een meer gespecialiseerde functie heeft, is deze veelbelovende van de wetenschap vooraanstaande wetenschappers de mogelijkheid van cel-gebaseerde therapieën voor behandeling van de ziekte te onderzoeken. Wanneer cultuur in suspensie zonder antidifferentiation factoren, embryonale stamcellen spontaan differentiëren en vormen drie-dimensionale meercellige aggregaten. Deze cel aggregaten worden genoemd embryoid organen (EB). Opknoping druppel cultuur is een veel gebruikt EB formatie inductie methode. De afgeronde onderkant van opknoping druppel maakt de samenvoeging van de ES-cellen die kunnen zorgen voor MES-cellen een goede omgeving voor het vormen van EBS. Het aantal van de ES-cellen aggregatied in een opknoping druppel kan worden geregeld door het variëren van het aantal cellen in de eerste celsuspensie te worden opgehangen als een druppel uit het deksel van de petrischaal. Met behulp van deze methode kunnen we reproduceerbare vorm homogene EBS vanuit een vooraf bepaald aantal ES-cellen.

Protocol

  1. Gelatineren T75 fles met behulp van een 0,1% gelatine-oplossing en incubeer plaat in een 37 ° C, 5% CO 2 weefselkweek incubator 's nachts een dag voor.
  2. Haal de MES-cellen van broeden, zuig het medium, spoel de ES-cel-cultuur met PBS, toe te voegen 0,05% trypsine oplossing voor laag de bodem van de schaal (2 ml/100mm plaat).
  3. Incubeer bij 37 ° C gedurende ongeveer een minuut, totdat de cellen afstoten van de plaat.
  4. Voorzichtig vermaal (pipet op en neer) de getrypsiniseerd cellen vier tot zes keer naar de ES-cellen met een aangesloten Pasteur pipet verspreiden,. Breng de verspreide ES-cellen in een 15-ml conische centrifugebuis met voorverwarmde (37 ° C) MES medium.
  5. Verzamel cellen door centrifugeren. Zuig het supernatant, Voeg 10 ml van MES medium en pipet op en neer om een ​​enkele celsuspensie te vormen.
  6. Breng de celsuspensie in een T75 fles pre-gecoat met 0,1% gelatine en incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2 voor een uur

    * Na een uur, zijn de fibroblasten aan de plaat, maar de stamcellen blijven in het medium. Pipetteer het medium om de stamcellen te verzamelen.

  7. Spin de cellen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten en zuig uit de MES medium. Voeg vervolgens nog eens 10 ml van MES differentiatie medium en resuspendeer de cellen door repetitieve pipetteren totdat blijkt dat er een fijne suspensie van cellen.
  8. Tellen cellen met een hemocytometer gebruik differentiatie medium om de stamcellen schorsing verdunnen tot een concentratie van 400 tot 500 cellen per 20ul (20ul/drop) in een steriele bekken.
  9. Til het deksel voorzichtig omkeren en plaats deze op de top van het schaaltje met 10 ml PBS. Met behulp van een multichannel pipet, maken rijen van 20ul druppels op de up-keerde binnenkant van het deksel van de weefselkweek schotel.
  10. Plaats voorzichtig de schaal in de incubator voor 2 dagen. Na twee dagen, voorzichtig draai het bord te dekken, aspiratie 180 ul vers medium differentiatie en doe enkele druppels in de put van een 96-well Ultra-wandplaat. Dan pick-up van de druppel met de pipet en overdracht druppels, een voor een, aan de 96-well plaat. Leg de platen in de incubator ongestoord gedurende 3 dagen.
  11. Coat elk putje van een 48-well plaat met weefselkweek 300ul van 0,1% gelatine. Na het toevoegen van de gelatine, 's nachts incuberen van de plaat bij 37 ° C een dag van tevoren vóór de overdracht van de Ebs.
  12. De volgende dag, zuigen de gelatine uit de 48-well plaat. Voeg vervolgens 300 ul van differentiatie medium aan elk putje. Breng de EBS van de platen met 96 putjes om de 48 goed gelatine-gecoate platen een voor een. Verander het medium de volgende dag en wijzigt u vervolgens het medium om de andere dag naar de cellen te behouden.
  13. Spontane cardiaomyocyte contracties moet blijken binnen 7 dagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De nadelen van opknoping drop methode zijn als volgt: de vloeistof volume van een druppel is beperkt tot minder dan 50ul te wijten aan het behoud van opknoping druppels op het deksel door oppervlaktespanning, en het is onmogelijk om het medium te veranderen voor opknoping druppels. Observatie van het vormen van EBS in druppels direct met microscopie is ook zeer moeilijk tijdens de teelt. Verder, de opknoping druppel methode bestaat uit twee stappen, kan daarom een ​​reeks stap van de opknoping drop methode lastig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics