La differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (MES) Cellule con il metodo goccia

Biology

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Summary

Questo video mostra come condurre differenziamento in vitro di cellule staminali embrionali di topo di corpi embrionali usando il metodo goccia pendente.

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Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

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Abstract

Le cellule staminali hanno la potenzialità notevoli di svilupparsi in molti tipi cellulari diversi. Quando una cellula staminale si divide, ogni nuova cellula ha il potenziale per rimanere sia una cellula staminale o diventare un altro tipo di cellula con una funzione più specializzati, questo promettente della scienza sta portando gli scienziati a studiare la possibilità di terapie basate sulle cellule per curare le malattie. Quando la cultura in sospensione senza fattori antidifferenziazione, le cellule staminali embrionali differenziare spontaneamente e formare aggregati pluricellulari tridimensionale. Questi aggregati di cellule si chiamano corpi embrionali (EB). Hanging cultura goccia è un metodo ampiamente utilizzato formazione EB induzione. Il fondo arrotondato di goccia consente l'aggregazione delle cellule staminali in grado di fornire cellule MES un buon ambiente per la formazione di EBS. Il numero di cellule ES aggregatied in una goccia può essere controllata variando il numero di cellule nella sospensione cellulare prima di essere appeso come una goccia dal coperchio della piastra Petri. Con questo metodo possiamo riproducibile forma omogenea EB da un numero predeterminato di cellule ES.

Protocol

  1. Gelatinizzare T75 beuta con una soluzione di 0,1% di gelatina e la piastra di incubare a 37 ° C, 5% CO 2 colture di tessuti incubatore durante la notte un giorno prima.
  2. Estrarre le cellule MES da incubare, aspirare il terreno, lavare la coltura delle cellule ES con PBS, aggiungere la soluzione tripsina 0,05% per ricoprire il fondo del piatto (2 piastra ml/100mm).
  3. Incubare a 37 ° C per circa 1 minuti, fino a quando le cellule sono muta fuori dal piatto.
  4. Delicatamente triturare (pipetta su e giù) le cellule trypsinized quattro a sei volte per disperdere le cellule ES con una pipetta Pasteur collegato,. Trasferire le cellule ES dispersi in un tubo da 15 ml per centrifuga conica contenente preriscaldata (37 ° C) media MES.
  5. Raccogliere le cellule per centrifugazione. Aspirare il surnatante, aggiungere 10 ml di terreno MES e pipettare su e giù per formare una sospensione di cellule singole.
  6. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone T75 preverniciato con 0,1% di gelatina e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per un'ora

    * Dopo un'ora, i fibroblasti hanno attaccato alla piastra, ma le cellule staminali rimangono nel terreno. Pipettare il medium per raccogliere le cellule staminali.

  7. Spin le cellule a 1000 rpm per 5 minuti e aspirare al largo della media MES. Quindi aggiungere un altro 10 ml di medium di differenziazione MES e risospendere le cellule pipettando ripetitivo fino a quando non sembra essere una sospensione fine di cellule.
  8. Contare le celle con un mezzo di differenziazione emocitometro utilizzare per diluire la sospensione di cellule staminali ad una concentrazione da 400 a 500 cellule per 20 ul (20ul/drop) in una bacinella sterile.
  9. Sollevare il coperchio, capovolgere delicatamente e collocarlo sulla parte superiore del piatto che contiene 10 ml di PBS. Utilizzando una pipetta multicanale, fare file di 20 ul gocce sul up-trasformato superficie interna del coperchio del piatto coltura di tessuti.
  10. Con attenzione la capsula in incubatrice per 2 giorni. Dopo due giorni, con attenzione capovolgere la piastra di copertura, aspirare 180 media ul differenziazione fresco e mettere alcune gocce nel pozzetto di una piastra a 96 pozzetti ultrabassa attaccamento. Poi la goccia pick-up con le gocce pipetta e il trasferimento, uno ad uno, alla piastra a 96 pozzetti. Posizionare le piastre in indisturbati per 3 giorni incubatrice.
  11. Cappotto ciascun pozzetto di una 48-e piastra di coltura tissutale con 300ul di 0,1% di gelatina. Dopo aver aggiunto la gelatina, incubare la piastra di una notte a 37 ° C un giorno prima prima del trasferimento della Ebs.
  12. Il giorno dopo, aspirare la gelatina dal 48-pozzetti. Poi aggiungere 300 ul di medio differenziazione in ciascun pozzetto. Trasferire la EB dal 96 pozzetti alle 48 e gelatina rivestite piatti uno per uno. Modificare il medium il giorno dopo e quindi modificare il medium a giorni alterni per mantenere le cellule.
  13. Spontanea contrazioni cardiaomyocyte dovrebbe essere evidente entro 7 giorni.

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Discussion

Gli svantaggi del metodo della goccia pendente sono i seguenti: il volume di una goccia di liquido è limitata a meno di 50ul dovuto al mantenimento di gocce sul coperchio dalla tensione superficiale, ed è impossibile cambiare il supporto per appendere gocce. Osservazione di formare EBS in gocce direttamente con la microscopia è anche molto difficile durante la coltivazione. Più ulteriormente più, il metodo goccia consiste di due fasi, quindi, una serie di passo del metodo goccia può essere fastidioso.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

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References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

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