स्थिर ट्रांसजेनिक सी. Microinjection का उपयोग एलिगेंस पीढ़ी

Published 8/15/2008
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Biology

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Summary

इस वीडियो सी एलिगेंस जननपिंड ट्रांसजेनिक जानवर बनाने में microinjection की तकनीक को दर्शाता है.

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Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

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Abstract

ट्रांसजेनिक Caenorhabditis एलिगेंस जननपिंड 1 में एक डीएनए प्लाज्मिड समाधान के microinjection के माध्यम से आसानी से बनाया जा सकता है . प्लास्मिड डीएनए के लिए extrachromosomal concatamers कि stably कर रहे हैं, हालांकि वास्तविक 2 गुणसूत्रों के रूप में एक ही दक्षता के साथ विरासत में मिली नहीं फार्म rearranges. ब्याज की एक जीन है rol-6 या GFP के रूप में एक स्पष्ट प्ररूपी मार्कर के साथ सह इंजेक्शन, एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत ट्रांसजेनिक जानवरों के चयन की अनुमति है. exogenous जीन सेलुलर स्थानीयकरण अध्ययन के लिए अपने देशी प्रमोटर से व्यक्त किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, transgene है कि विशेष रूप से सेल या ऊतकों में जीन उत्पाद की भूमिका का आकलन करने के लिए एक अलग विशिष्ट ऊतक प्रमोटर द्वारा संचालित किया जा सकता है है. इस तकनीक कुशलतापूर्वक germline या जल्दी 3 भ्रूण के अलावा सी एलिगेंस के सभी ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव. ट्रांसजेनिक जानवरों के निर्माण में व्यापक रूप से प्रयोगात्मक मानदंड की एक श्रृंखला के लिए उपयोग किया जाता है. यह वीडियो microinjection ट्रांसजेनिक कीड़े उत्पन्न प्रक्रिया को दर्शाता है. इसके अलावा, चयन और स्थिर ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस लाइनों के रखरखाव में वर्णित है.

Protocol

अभिव्यक्ति प्लाज्मिड निर्माण

दो plasmids आवश्यक हैं: एक ऊतक विशेष हित के जीन की अभिव्यक्ति और चयन परिवर्तन मार्कर के रूप में एक दूसरे के लिए.

प्रायोगिक प्लाज्मिड

  1. प्रमोटर है कि ब्याज की / ऊतक कोशिका प्रकार, उदाहरण के लिए, एक तंत्रिका या मांसपेशी विशिष्ट प्रमोटर में व्यक्त किया है का चयन करें. यदि एक ही ऊतक के भीतर कई जीनों व्यक्त की है, एक प्रमोटर कैसेट गेटवे प्रणाली (Invitrogen) में प्लाज्मिड इस्तेमाल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण recombinational क्लोनिंग 4 द्वारा प्रमोटर के हित बहाव के किसी भी जीन की प्रविष्टि की अनुमति देता है आम तौर पर, अपस्ट्रीम दृश्यों के 2-5 केबी सही और सटीक अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त है.

  2. हित के जीन की सीडीएनए दो मायनों में क्लोन किया जा सकता है है:
    1. पारंपरिक क्लोनिंग प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग.
    2. गेटवे क्लोनिंग के लिए, यह है पीसीआर प्राइमरों कि गेटवे att बी recombinational अनुक्रम होते का उपयोग प्रवर्धित . प्रवर्धित सीडीएनए पहले दाता वेक्टर pDONR201 प्रविष्टि वेक्टर बनाने में recombined है और फिर ई. में तब्दील कोलाई तनाव DH5a. सफल recombinants और मिनी प्रस्तुत करने का डीएनए के अलगाव के चयन के बाद, प्रविष्टि वेक्टर प्रमोटर युक्त गंतव्य सदिश अभिव्यक्ति प्लाज्मिड बनाने में recombined है. Recombinational क्लोनिंग पर विवरण या तो Invitrogen गेटवे पुस्तिका से या काल्डवेल एट अल में उपलब्ध हैं 5..

चयन प्लाज्मिड मार्कर

ट्रांसजेनिक मार्कर plasmids के उदाहरण rol-6 या शरीर दीवार मांसपेशी प्रमोटर unc 54 का उपयोग करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति ड्राइव शामिल हैं. ये मार्कर plasmids आमतौर पर अनुसंधान समुदाय के भीतर से अनुरोध पर उपलब्ध हैं.

सी. एलिगेंस के Microinjection

तैयार

  1. दो plasmids कि इंजेक्शन जा रहे हैं डीएनए अलगाव प्रदर्शन. उन्हें quantitate और 50 एनजी / μl प्रत्येक के एक 1:1 के अनुपात में एक साथ मिश्रण.

  2. अगर पैड तैयार:
    1. पानी में एक 2% agarose समाधान करें, गर्मी या माइक्रोवेव जब तक भंग.
    2. एक benchtop पर कई 22 x 50 मिमी को कवर चश्मा सेट करें.
    3. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग, एक कांच कवर पर पिघला agarose की एक बूंद जगह और तुरंत ड्रॉप से ​​अधिक एक 90 कोण पर एक दूसरे कांच कवर करने के लिए पहली जगह है. कई अन्य कवर चश्मे के लिए दोहराएँ. agarose के चपटे डिस्क के व्यास 15-20 मिमी के बीच होना चाहिए.
    4. Agarose (इस क्षणों लेता है केवल) के बाद जम गया है, कांच कवर हटाने और पैड के लिए पूरी तरह से शुष्क हवा की अनुमति (रात भर के लिए कई घंटे).
    5. कमरे के तापमान पर एक कवर गिलास बॉक्स में पैड का स्टोर.

  3. डीएनए समाधान के लिए सुई लोडर:

    सुई लोडर 100 μl केशिका ट्यूब है कि बीच में एक खुला लौ पर गरम कर रहे हैं और तेजी से लगभग दो बार उनकी लंबाई खींच से बनाया जाता है. दो हिस्सों के अलावा तोड़ रहे हैं एक बार केशिका ट्यूब ठंडा. 10-20 इंजेक्शन के लिए सुई लोडर संचय. एक microcentrifuge ट्यूब रैक में ईमानदार स्टोर. सावधानी के रूप में अपने अंक पर नहीं कोचना.

  4. Microinjection सुइयों करें:

    सुई एक विशेष केशिका ट्यूब कि एक आंतरिक गिलास फिलामेंट शामिल से बना है, इस फिलामेंट डीएनए समाधान के लिए एक बाती के रूप में कार्य करता है. ये एक मशीन सुई खींचने पर खींच रहे हैं. हम 24.8 के एक गर्मी की स्थापना के साथ एक Narishige पीपी 830 खींचने का उपयोग करें. कई सुई एक बार में खींच रहे हैं और एक छोटे से प्लास्टिक बॉक्स में संग्रहित कर रहे हैं. आसानी से एकाधिक सुइयों किया जा सकता है "आरोहित" लंबी अवधि के भंडारण के लिए क्ले मॉडलिंग की एक पट्टी पर.

  5. सुई टिप "तोड़ने":

    microinjection सुई की नोक इतना ठीक है कि यह वास्तव में यह अंत में बंद कर दिया है खींचा है और खुला टूट जाना चाहिए कवर कांच के छोटे shards का उपयोग. इन में एक कागज तौलिया में एक 18 x 18 मिमी कवर कांच लपेटकर और धीरे जब तक यह कई टुकड़ों में टूट जाता है दबाव लागू करने के द्वारा तैयार कर रहे हैं. एक उपयोगी आकार के shards लगभग 3 4 मिमी x.

  6. मानक प्रक्रियाओं 6 का उपयोग इंजेक्शन के लिए जल्दी वयस्क चरण के लिए जंगली प्रकार के कीड़े (N2) आगे बढ़ें . के बारे में 100 तैयार ठीक से कीड़े के मंचन / इंजेक्शन का निर्माण.

प्रक्रिया

  1. एक हीलियम टैंक है कि एक microinjection सुई हाथ और धारक से जुड़ा है पर मुख्य वाल्व खोलें. नियामक वाल्व बंद गैस लाइन में प्रवेश करने के लिए, 35 साई को दबाव में लाने की अनुमति है. सूचना है कि गैस की एक पैर पेडल का उपयोग जारी किया जा सकता है.

  2. एक मानक मुँह pipetter टयूबिंग (गिलास केशिका ट्यूब के कंटेनर में पाया) में एक सुई लोडर डालें और प्लाज्मिड मिश्रण (~ 1 μl) की एक छोटी राशि आकर्षित.

  3. सुई लोडर ध्यान से एक इंजेक्शन की सुई के पीछे के अंत में रखा गया है और धीरे से की लंबाई के माध्यम से सभी तरह डालाप्रतिरोध जब तक सुई लगा है. धीरे से उड़ाने की डीएनए समाधान निष्कासित, तो लोडर हटा दें.

  4. Microinjection हाथ में सुई डालें, छोटे आंतरिक रबर गैसकेट के भीतर जगह करने के लिए सावधान किया जा रहा है.

  5. सुई तोड़ने कवर कांच का ठीकरा एक अगर पैड के एक किनारे पर रखें. ठीकरा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अगर पैड की पूरी सतह हेलोकार्बन तेल के साथ, कवर. एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर अगर पैड रखें.

  6. देखने 4X उद्देश्य और चमकदार क्षेत्र की रोशनी का उपयोग क्षेत्र के केंद्र में सुई की स्थिति है, लेकिन यह तेल में अभी तक कम नहीं. इसके अलावा, केंद्र में कवर कांच का ठीकरा के भीतर बढ़त की स्थिति है, तो उस पर ध्यान केंद्रित (अभी भी 4X उद्देश्य का उपयोग). तेल में सुई लोअर, यह कवर कांच का ठीकरा के रूप में एक ही फोकल हवाई जहाज़ में लाने. 40x उद्देश्य के लिए स्विचन द्वारा बढ़ाई उठाएँ. ठीकरा के किनारे पर refocus और सुई की नोक reposition, यदि आवश्यक है.

  7. इंजेक्शन सुई की नोक खुला है, धीरे कवर कांच ठीकरा के किनारे के खिलाफ सुई कुहनी से हलका धक्का है, जबकि एक ही समय में पैर पेडल के माध्यम से गैस की एक छोटी नाड़ी आवेदन. सुई पर्याप्त खुला टूट जाएगा जब तरल के छोटे बूंदों सुई के अंत से बच. अतिरिक्त तरल प्रवाह बहुत बड़ी एक खोलने के कारण वांछनीय नहीं है, के रूप में यह जानवरों को मार देगा.

  8. मंच से सुई जुटाने द्वारा अगर पैड, निकालें लेकिन एक्स या Y-अक्ष की स्थिति को बदल नहीं है. चरण सुई के नीचे से बाहर स्लाइड, अगर पैड को हटा दें और इसे एक विदारक माइक्रोस्कोप पर जगह. पैड पर तेल की सतह के नीचे एक कीड़ा, स्थानांतरण. यदि कीड़ा wriggles, धीरे स्ट्रोक यह जब तक यह अगर पैड संपर्कों. नम कीड़ा सूखी agarose का पालन करना चाहिए.

  9. इंजेक्शन
    1. जल्दी मंच पर अगर पैड वापस जगह है, देखने के क्षेत्र में कीड़ा केंद्रित.
    2. कृमि के रूप में ध्यान की एक ही विमान में सुई लोअर.
    3. हॉफमैन प्रदीप्ति (विपरीत फिल्टर का एक प्रकार) के लिए फिल्टर स्विच करें. इस कृमि के रूपात्मक विस्तार दिखाई बनने के लिए अनुमति देता है. यदि Nomarski / डीआईसी प्रकाशिकी उल्टे गुंजाइश है कि रूप में अच्छी तरह से काम करेगा पर उपलब्ध हैं. 40x उद्देश्य का प्रयोग, "दानेदार" कीड़ा जननपिंड syncytial केंद्र, रोगाणु नाभिक "मधुकोश" पैटर्न से नीचे (चुन जो भी जननपिंड सुई का सामना करना पड़ रहा कीड़ा के किनारे पर तैनात है) पर ध्यान केंद्रित.
    4. ठीक सुई की स्थिति जब तक टिप ध्यान में भी (जननपिंड "graininess" के रूप में एक ही विमान) धुन.
    5. धीरे जननपिंड के केंद्र में सुई डालने और जननपिंड हाथ में डीएनए के एक या दो छोटी बूंद निष्कासित गैस के दबाव के एक संक्षिप्त पल्स लागू. आप बाहर का जननपिंड भर में तरल प्रसार की एक लहर का पालन करना चाहिए. लगता है अधिक तरल बेहतर है, के बाद से बहुत अधिक तरल जननपिंड हाथ के प्रॉक्सिमल मोड़ है, जो नीचे oocyte उत्पादन बंद कर सकते हैं में प्रवाह कर सकते हैं मत करो. यदि संभव हो तो, कृमि की स्थिति पर निर्भर करता है, एक ही तरीके से अन्य जननपिंड हाथ इंजेक्षन.
    6. यह करने के लिए जल्दी से काम करते हुए एक कीड़ा इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में यह आसानी से कुम्हलाना कर सकते हैं. दूसरा जननपिंड हाथ इंजेक्षन करने के लिए निर्णय कैसे जल्दी आप सुई और कीड़ा स्थिति कर सकते हैं पर निर्भर है. पूरी प्रक्रिया को आदर्श कम से कम 1-2 मिनट ले जाना चाहिए.

  10. मंच से कांच कवर निकालें और यह एक विदारक गुंजाइश पर जगह है. M9 बफर के 1μl (22mm के.एच. 2 4 पीओ 42mm ना HPO 2 4, 85mm NaCl, 1mm MgSO 4) इंजेक्शन कीड़ा पर सीधे लागू करें (इस हेलोकार्बन तेल की सतह के नीचे विंदुक टिप submerging आवश्यक हो सकता है). बफर कीड़ा rehydrate चाहिए, यह तो बंद agarose पैड सतह फ्लोट जाएगा. एक नियमित रूप से एक कीड़ा लेने का उपयोग कर थाली में कीड़ा स्थानांतरण. agarose पैड कई गुना अधिक reused किया जा सकता है जब तक यह भी संतृप्त बफर और अब कोई पालन कीड़े के साथ बन गया है.

ट्रांसजेनिक चयन

  1. इंजेक्ट कीड़े, पी 0 पीढ़ी, व्यक्तिगत, ताजा, bacterially वरीयता प्राप्त प्लेटें (60 मिमी) को हस्तांतरित कर रहे हैं और पुन: पेश करने की अनुमति दी. आमतौर पर, इंजेक्शन पशुओं के रूप में 20 ° C पर 2-3 दिनों के लिए incubated रहे हैं जब तक संतानों दिखाई.

  2. एफ 1 वंश ट्रांसजेनिक मार्कर (जैसे प्रतिदीप्ति के रूप में) एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope उपयोग के सबूत के लिए मनाया जाता है. प्रत्येक फ्लोरोसेंट, 1 एफ वाहक, पशु अलग एक नई प्लेट पर क्लोन है (प्रत्येक 1 एफ से संतानों के बाद से एक अलग लाइन माना जाता है ). एफ 1 hermaphrodites को पुन: पेश करने की अनुमति दी जाती है. फिर, यह आम तौर पर 20 डिग्री 2-3 दिनों के लिए सी है पर प्रदर्शन किया जब तक संतानों दिखाई.

  3. एफ 2 पीढ़ी के रूप में अच्छी तरह से ट्रांसजेनिक जानवरों के लिए मनाया जाता है. एफ 2 जानवरों है कि विरासत में मिला है और ट्रांसजेनिक सरणी व्यक्त एक "स्थिर" रेखा माना जाता है .

    एफ 1 सेंट पर: नोटउम्र वहाँ कई ट्रांसजेनिक जानवर हो सकता है, लेकिन हो सकता है वे स्थिर नहीं कर रहे हैं. एफ 1 ट्रांसजेनिक जानवर के बहुमत एफ 2 स्थिर लाइनों में प्रचार नहीं करेंगे.

    नोट: जीन की नकल संख्या में परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रण करने के लिए, तीन इंजेक्शन का निर्माण प्रति स्वतंत्र स्थिर लाइनों की एक न्यूनतम उत्पन्न.

  4. प्रत्येक स्वतंत्र स्थिर लाइन कीड़े की एक अलग लाइन के रूप में रखा जाना चाहिए. प्रत्येक पंक्ति हर पीढ़ी में एक नया प्लेट कई ट्रांसजेनिक जानवर स्थानांतरित द्वारा प्रचारित किया जा सकता है, यह एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाना चाहिए अगर चयन मार्कर फ्लोरोसेंट है.

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Discussion

जब इस प्रक्रिया कर रही है, यह महत्वपूर्ण है को याद है:
- जननपिंड के केंद्र में सीधे इंजेक्षन
- बहुत ज्यादा तरल नहीं इंजेक्षन
- जल्दी काम करने के लिए dessication को रोकने.

यदि आप सुई, इस तरह के रूप में यह बहुत बड़ी टूट गया है के साथ समस्याओं में चलाने के लिए, यह सबसे अच्छा है आदर्श सुई की तुलना में एक कम समय के साथ इंजेक्षन करने की कोशिश के बजाय एक ताजा सुई रीमेक है.

ट्रांसजेनिक कीड़े की पीढ़ी इस तरह के रूप में कई आवेदन किया है:
उत्परिवर्ती जीन की पहचान, विधि में परिवर्तन बचाव बुलाया
- प्रोटीन डोमेन के छोटा प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से मैपिंग
सेलुलर और रोग प्रक्रियाओं में एक जीन की भूमिका के लक्षण वर्णन.

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Acknowledgements

हम सभी काल्डवेल लैब के सदस्यों के सहकारी भावना को स्वीकार चाहते हैं. आंदोलन विकारों अनुसंधान प्रयोगशाला में dystonia Bachmann - स्ट्रॉस और पार्किंसंस फाउंडेशन, संयुक्त पार्किंसंस फाउंडेशन, अमेरिकी पार्किंसंस रोग एसोसिएशन, अलबामा के पार्किंसंस रोग एसोसिएशन, माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन पार्किंसंस अनुसंधान के लिए, और एक अंडर ग्रेजुएट रिसर्च द्वारा समर्थित किया गया है.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

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References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

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