Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Published 8/15/2008
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Biology

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Summary

Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

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Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

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Abstract

Transgénicos Caenorhabditis elegans pueden ser fácilmente creados a través de la microinyección de una solución de ADN plásmido en la gónada 1. El ADN del plásmido se reorganiza para formar concatamers extracromosómico que son heredados de forma estable, aunque no con la misma eficacia que los cromosomas actual 2. Un gen de interés es co-inyectados con un marcador fenotípico obvias, tales como rol-6 o las buenas prácticas agrarias, para permitir la selección de animales transgénicos con un microscopio de disección. El gen exógeno se puede expresar a partir de su promotor nativo para los estudios de localización celular. Por otra parte, el transgén puede ser impulsado por un promotor de diferentes tejidos específicos para evaluar la función del producto del gen en esa célula o tejido en particular. Esta técnica de manera eficiente las unidades de la expresión génica en todos los tejidos de C. elegans, excepto para el embrión o principios de la línea germinal 3. La creación de animales transgénicos es ampliamente utilizado para una variedad de paradigmas experimentales. Este video muestra el procedimiento de microinyección para generar gusanos transgénicos. Además, la selección y mantenimiento de líneas transgénicas estables C. elegans se describe.

Protocol

Plásmido de expresión de construcción

Dos plásmidos son necesarios: una para la expresión específica de tejido del gen de interés y un segundo como marcador de transformación seleccionables.

Experimental plásmido

  1. Seleccione un promotor que se expresa en el tipo de tejidos / células de interés, por ejemplo, un nervio o músculo promotor específico. Si se va a expresar múltiples genes dentro del mismo tejido, un cassette promotor plásmido en el sistema de puerta de enlace (Invitrogen) se puede utilizar. Este enfoque permite la inserción de un gen de interés aguas abajo del promotor de 4 clonación de recombinación. En general, 2-5 kb de secuencias de aguas arriba es suficiente para tener una expresión correcta y exacta.

  2. El cDNA del gen de interés puede ser clonado en dos formas:
    1. Clonación convencional con enzimas de restricción.
    2. Para la clonación de puerta de enlace, que es amplificada por PCR utilizando los cebadores que contienen la puerta de enlace att secuencia B de recombinación. El cDNA amplificado se recombinan en la primera pDONR201 vector de donantes para crear el vector de entrada y luego se transformó en E. coli cepa DH5a. Después de la selección de recombinantes éxito y mini-prep aislamiento de ADN, el vector de entrada se recombina en el vector destino promotor que contiene para crear el plásmido de expresión. Detalles sobre la clonación de recombinación están disponibles, ya sea el manual de Invitrogen Gateway o en Caldwell et al. 5.

Marcador seleccionable plásmido

Ejemplos de plásmidos marcador transgénicos incluyen rol-6 o el uso del promotor de la pared muscular del cuerpo unc-54 para dirigir la expresión de proteínas fluorescentes. Estos plásmidos marcadores suelen estar disponibles dentro de la comunidad de investigación bajo pedido.

Microinyección de C. elegans

Preparación

  1. Realizar el aislamiento del ADN de los dos plásmidos que se van a inyectar. Cuantificar ellos y se mezclan en una proporción de 1:1 de 50 ng / l cada uno.

  2. Preparar pastillas de agar:
    1. Haga una solución al 2% de agarosa en el agua, el calor o en el microondas hasta que se disuelva.
    2. Establecido varios 22 x 50 mm cubreobjetos en una mesa de trabajo.
    3. Con una pipeta Pasteur, se coloca una gota de la agarosa derretida en una cubierta de vidrio y colocar inmediatamente una tapa de vidrio segundo a través de la caída en un ángulo de 90 a la primera. Repita este procedimiento para varios vasos de las demás. El diámetro del disco aplanado de agarosa debe estar entre 15-20 mm.
    4. Después de la agarosa se ha solidificado (esto sólo se tarda un minuto), retire la tapa de vidrio y deje que el cojín de aire seco por completo (varias horas o toda la noche).
    5. Tienda de las pastillas en una caja cubierta de vidrio a temperatura ambiente.

  3. Hacer cargadores aguja para solución de ADN:

    Cargadores de aguja son creados a partir de 100 tubos capilares l que se calientan en el centro sobre una llama abierta y rápidamente sacó a sus aproximadamente el doble de longitud. Las dos mitades se rompió además una vez que el tubo capilar se enfría. 10-20 arsenal cargadores de aguja para la inyección. Guárdelo en posición vertical en un bastidor de tubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no atravesar a sí mismo en los puntos.

  4. Hacen que las agujas de microinyección:

    La aguja está hecho de un tubo especial capilar que contiene un filamento de vidrio interior, este filamento sirve como mecha para la solución de ADN. Estos se extraen en una máquina de aguja-tirador. Utilizamos un Narishige PP-830 extractor con un ajuste de calor de 24,8. Varias agujas se tiran a la vez y se almacenan en una pequeña caja de plástico. Agujas múltiples pueden ser fácilmente "montado" en una tira de plastilina para almacenamiento a largo plazo.

  5. Punta de la aguja "interruptores":

    La punta de la aguja de microinyección se tira tan bien que en realidad es cerrado a fin, y debe ser rota abierta con pequeños fragmentos de cristal de la cubierta. Estos son preparados por el ajuste de un 18 x 18 mm cubierta de cristal en una toalla de papel y ejerciendo una suave presión hasta que se rompe en varios pedazos. Fragmentos de un tamaño útil es de aproximadamente 3 x 4 mm.

  6. Crecen de forma silvestre tipo (N2) los gusanos a la etapa adulta temprana para la inyección mediante procedimientos estándar de 6. Preparar adecuadamente organizado cerca de 100 gusanos / construir inyectado.

Procedimiento

  1. Abra la válvula principal en un tanque de helio que está conectado a un brazo de la aguja de microinyección y el soporte. Cierre la válvula de regulación para permitir que el gas para entrar en la línea, con lo que la presión a 35 psi. Tenga en cuenta que el gas puede ser liberado mediante un pedal.

  2. Inserte un cargador de aguja en un tubo de la boca pipeteador estándar (que se encuentran en envases de tubos capilares) y la elaboración de una pequeña cantidad de la mezcla de plásmidos (~ 1 l).

  3. El cargador de la aguja se coloca cuidadosamente en el extremo posterior de una aguja de inyección y se inserta suavemente todo el camino a través de la longitud dela aguja hasta que sienta resistencia. Expulsar a la solución de ADN por soplando suavemente, a continuación, retire el cargador.

  4. Insertar la aguja en el brazo de la microinyección, teniendo cuidado de colocarla dentro de la junta de goma interno pequeño.

  5. Coloque un trozo de aguja rotura de cristal de la cubierta en un borde de una plataforma de agar. Cubrir el fragmento, así como toda la superficie de la almohadilla de agar, con aceite de halocarbonos. Coloque la almohadilla de agar en el escenario de un microscopio invertido.

  6. Posición de la aguja en el centro del campo de visión con el objetivo de 4X y la iluminación de campo claro, pero aún no se baja en el aceite. Además, la posición del borde interior de la astilla de cristal de la cubierta en el centro, a continuación, centrarse en él (aún con el objetivo 4X). Bajar la aguja en el aceite, con lo que en el mismo plano focal que el trozo de cubierta de vidrio. Levante la ampliación por el cambio con el objetivo de 40X. Centrarse en el borde del casco y la posición de la punta de la aguja, si es necesario.

  7. La apertura de la punta de la aguja de inyección, suavemente empujar la aguja en el borde de la tapa de vidrio fragmento, mientras que al mismo tiempo la aplicación de un pulso corto de gas a través del pedal. La aguja se rompe lo suficientemente abierta cuando pequeñas gotas de líquido escapar del extremo de la aguja. Exceso de flujo de líquido debido a una abertura muy grande no es deseable, ya que matar a los animales.

  8. Retire la almohadilla de agar a partir de la etapa de aumento de la aguja hacia arriba, pero no cambiar la posición de X o Y-eje. Deslice la etapa de debajo de la aguja, retire la almohadilla agar y colocarlo en un microscopio de disección. La transferencia de un gusano en la almohadilla, debajo de la superficie del aceite. Si el gusano se retuerce, frotar suavemente hasta que haga contacto con la almohadilla de agar. El gusano húmedos deben adherirse a los secos de agarosa.

  9. Inyección
    1. Coloque rápidamente la parte de atrás pad agar en el escenario, centrando el gusano en el campo de visión.
    2. Baje la aguja en el mismo plano de enfoque como el gusano.
    3. Cambie el filtro de Hoffman Iluminación (un tipo de filtro de contraste). Esto permite que los detalles morfológicos del gusano a ser visible. Si Nomarski / DIC óptica están disponibles en el ámbito invertida que funciona tan bien. Utilizando el objetivo 40X, se centran en el "grano" centro sincitial de las gónadas del gusano, por debajo del "nido de abeja", patrón de los núcleos germinales (elegir la gónada se coloca en el lado de la lombriz frente a la aguja).
    4. Afinar la posición de la aguja hasta que la punta está también en el foco (el mismo plano que la gónada "grano").
    5. Suavemente inserte la aguja en el centro de la gónada y aplicar un breve pulso de la presión del gas para expulsar a una gota o dos de ADN en el brazo de las gónadas. Usted debe observar una ola de expansión de líquido a través de la gónada distal. No asuma más líquido es mejor, ya que un exceso de líquido puede fluir en la curva proximal del brazo de las gónadas, lo que puede detener la producción de ovocitos. Si es posible, dependiendo de la posición del gusano, se inyecta el brazo gonadal otros de la misma manera.
    6. Es importante trabajar con rapidez, mientras que la inyección de un gusano, ya que puede secarse. La decisión de inyectar el brazo gonadal segundo depende de la rapidez con que puede volver a la posición de la aguja y el gusano. Todo el proceso lo ideal sería que en menos de 1-2 minutos.

  10. Quite la cubierta de vidrio desde el escenario y colóquelo en una microscopio de disección. Aplicar 1μl de buffer M9 (22 mm de KH 2 PO 4, 42 mm de Na 2 HPO 4, 85 mm de NaCl, 1 mM MgSO 4) directamente sobre el gusano inyecta (esto podría implicar sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del aceite de halocarbonos). El tampón debe rehidratar el gusano, sino que se va a flotar fuera de la superficie de la placa de agarosa. La transferencia de la lombriz en un plato normal con un pico del gusano. La almohadilla de agarosa puede ser reutilizado varias veces más hasta que se ha convertido en demasiado saturado con tampón y los gusanos ya no se adhieren.

Selección de transgénicos

  1. Gusanos se inyecta, la generación P 0, se transfieren a platos individuales fresco, sin semillas con bacterias (60 mm) y les permite reproducirse. Por lo general, los animales inyectados se incuban a 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen.

  2. La F 1 se observa la evidencia del marcador de transgénicos (como la fluorescencia), utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Cada portador fluorescentes, F 1, los animales clonados por separado en un plato nuevo (ya que la descendencia de cada F 1 se considera una línea distinta). La F 1 hermafroditas se les permite reproducirse. De nuevo, esto se realiza normalmente en menos de 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen.

  3. La generación F 2 se observa en los animales transgénicos así. F 2 animales que han heredado y expresan la variedad transgénica se consideran "estable" de línea.

    NOTA: En la F 1 deedad, puede haber muchos animales transgénicos, pero no son estables. La mayoría de los animales transgénicos F 1 no se propagarán en F 2 líneas estables.

    NOTA: Para el control de la variabilidad en el número de copias del gen, generar un mínimo de tres líneas independientes estables por la construcción de inyección.

  4. Cada línea estable independiente debe mantenerse como una línea separada de los gusanos. Cada línea se puede propagar mediante la transferencia de varios animales transgénicos para una nueva placa en cada generación, lo que debe llevarse a cabo utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente si el marcador de selección es fluorescente.

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Discussion

Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar lo siguiente:
- Inyectar directamente en el centro de la gónada
- No inyectar demasiado líquido
- Trabajar con rapidez para evitar la desecación.

Si llegas a tener problemas con la aguja, como se rompe demasiado grande, lo mejor es rehacer una aguja nueva, en lugar de tratar de inyectar con una aguja de menos de ideal.

La generación de gusanos transgénicos tiene muchas aplicaciones, tales como:
- La identificación de genes mutantes, en el método llamado de rescate de transformación
- Asignación de dominios de la proteína a través de la expresión de proteínas truncadas
- Caracterización de la función de un gen en los procesos celulares y de enfermedades.

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Acknowledgements

Queremos reconocer el espíritu de cooperación de todos los miembros Caldwell laboratorio. Movimiento de investigación trastornos en el laboratorio ha sido apoyado por la distonía Bachmann-Strauss y la Fundación Parkinson, Reino Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Asociación de la Enfermedad de Parkinson de Alabama, la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson, y una investigación de pregrado.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

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