Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Published 8/15/2008
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Biology

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Summary

Dieses Video zeigt die Technik der Mikroinjektion in die Gonade von C. elegans, um transgene Tiere zu schaffen.

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Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

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Abstract

Transgene Caenorhabditis elegans leicht über Mikroinjektion eines DNA-Plasmid-Lösung in die Gonade 1 erstellt werden. Die Plasmid-DNA lagert sich extrachromosomale Konkatamere, die stabil vererbt werden, wenn auch nicht mit der gleichen Effizienz wie tatsächliche Chromosomen 2 zu bilden. Ein Gen von Interesse ist mit einer offensichtlichen phänotypischen Marker, wie rol-6 oder GFP co-injiziert, um die Auswahl von transgenen Tieren unter einem Binokular erlauben. Das exogene Gen kann aus seiner nativen Promotor für zelluläre Lokalisation Studien ausgedrückt werden. Alternativ kann das Transgen von einem anderen Gewebe-spezifischen Promotor, um die Rolle des Genprodukts in der jeweiligen Zelle oder eines Gewebes zu beurteilen gefahren werden. Diese Technik effizient Laufwerke Genexpression in allen Geweben von C. elegans mit Ausnahme der Keimbahn oder frühen Embryo 3. Erstellung von transgenen Tieren ist bekannt für eine Reihe von experimentellen Paradigmen genutzt. Dieses Video zeigt die Mikroinjektion Verfahren zur transgenen Würmern zu generieren. Darüber hinaus ist die Auswahl und Pflege von stabilen transgenen C. elegans Zeilen beschrieben.

Protocol

Expressionsplasmid Construction

Zwei Plasmide sind erforderlich: eine für Gewebe-spezifische Expression des Gens von Interesse und eine zweite als wählbare Transformation Marker.

Experimentelle Plasmid

  1. Wählen Sie einen Promotor, der in dem Gewebe / Zelltyp von Interesse, zum Beispiel, einen Nerv oder Muskel-spezifischen Promotors exprimiert wird. Wenn man mehrere Gene im gleichen Gewebe auszudrücken ist, kann ein Promotorkassette Plasmid in das Gateway-System (Invitrogen) verwendet werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Einfügung von jedem Gen von Interesse stromabwärts des Promotors durch recombinational Klonen 4. Generell ist 2-5 kb Upstream-Sequenzen aus, um korrekte und genaue Ausdruck haben.

  2. Die cDNA des Gens von Interesse kann auf zwei Arten geklont werden:
    1. Konventionelle Klonen mit Hilfe von Restriktionsenzymen.
    2. Für Gateway-Klonen ist es PCR mit den Primern, dass das Gateway att B recombinational Sequenz enthalten. Die amplifizierte cDNA wird zunächst in der Donor-Vektor pDONR201 um den Eintrag zu erstellen Vektor rekombiniert und dann in E. coli-Stamm DH5a. Nach der Auswahl von erfolgreichen Rekombinanten und mini-prep Isolierung von DNA, wird der Eintrag Vektor in die Promotor-Destination-Vektor zu erstellen Expressionsplasmid rekombiniert. Details zu recombinational Klonen sind entweder von der Invitrogen Gateway-Handbuch oder in Caldwell et al Verfügung. 5.

Selektionsmarker Plasmid

Als Beispiele transgener Marker Plasmide umfassen rol-6 oder Gebrauch des Körpers Wand Muskel Promoter unc-54 um fluoreszierende Protein-Expression zu fahren. Diese Marker Plasmide sind in der Regel innerhalb der Forschergemeinde auf Anfrage zur Verfügung.

Mikroinjektion von C. elegans

Vorbereitung

  1. Führen DNA-Isolierung der beiden Plasmide, die injiziert werden sollen. Quantifizieren sie und mischen im Verhältnis 1:1 von 50 ng / ul jeder.

  2. Bereiten Sie Agar-Pads:
    1. Machen Sie einen 2% igen Lösung in Wasser, Wärme oder in der Mikrowelle bis zur Lösung.
    2. Set aus mehreren 22 x 50 mm Deckgläser auf einem Labortisch.
    3. Mit einer Pasteurpipette einen Tropfen des geschmolzenen Agarose auf einem Deckglas und sofort Platz ein zweites Deckglas über die Tropfen in einem 90-Winkel zur ersten. Wiederholen Sie dies für einige andere Deckgläser. Der Durchmesser des abgeflachten Scheibe aus Agarose sollte zwischen 15-20 mm sein.
    4. Nach Erstarren der Agarose (dies dauert nur Momente), entfernen Sie die Abdeckung aus Glas und lassen Sie das Pad an der Luft trocknen komplett (mehrere Stunden bis über Nacht).
    5. Bewahren Sie die Pads in einem Deckglas Feld bei Raumtemperatur.

  3. Machen Nadel Lader für DNA-Lösung:

    Needle Lader sind aus 100 ul Kapillaren, die in der Mitte über einer offenen Flamme erhitzt und schnell auf etwa das Doppelte ihrer Länge gezogen geschaffen. Die beiden Hälften sind getrennt, sobald die Kapillare kühlt aufgeschnappt. Stockpile 10-20 Nadel Lader zur Injektion. Aufrecht lagern in einem Mikrozentrifugenröhrchen Rack. Seien Sie vorsichtig, um nicht aufspießen sich auf die Punkte.

  4. Machen Mikroinjektion Nadeln:

    Die Nadel ist aus einem speziellen Kapillarröhrchen, dass eine interne Glasfilament enthält gemacht, das Filament dient als Docht für die DNA-Lösung. Diese basieren auf einer Nadel-Abzieher Maschine gezogen. Wir verwenden eine Narishige PP-830 Abzieher mit einer Heizstufe von 24,8. Mehrere Nadeln sind in einer Zeit gezogen und in einem kleinen Plastik-Box gespeichert. Mehrere Nadeln können leicht "gemountet" werden auf einem Streifen Knetmasse für eine langfristige Lagerung.

  5. Nadelspitze "Brandung":

    Die Spitze des Mikroinjektionsnadel gezogen wird so fein, dass es tatsächlich daran geschlossenen Ende und sollte aufgebrochen werden mit kleinen Scherben Deckglas. Diese werden durch das Einwickeln eines 18 x 18 mm Deckglas in ein Papiertuch und sanft Druck, bis es in mehrere Teile zerbricht vorbereitet. Scherben eines nützliche Größe ca. 3 x 4 mm.

  6. Wachsen Wildtyp (N2) Würmer bis in die frühen Erwachsenen-Stadium für die Injektion mit Standard-Verfahren 6. Bereiten Sie etwa 100 richtig inszeniert Würmer / Konstrukt injiziert.

Verfahren

  1. Öffnen Sie das Ventil auf ein Helium-Tank, die zu einem Mikroinjektionsnadel Arm und Halter verbunden ist. Schließen Sie das Regelventil, damit das Gas in die Zeile eingeben, wodurch der Druck auf 35 psi. Beachten Sie, dass das freigesetzte Gas kann mit einem Fußpedal werden.

  2. Legen Sie eine Nadel-Loader in einen Standard-Mund Pipette Schlauch (gefunden in Behältnissen aus Glas Kapillaren) und stellt eine kleine Menge der Plasmid-Mischung (~ 1 ul).

  3. Die Nadel-Loader wird vorsichtig in das hintere Ende einer Injektionsnadel gesetzt und sanft eingesetzt ganzen Weg durch die Länge derdie Nadel bis Widerstand zu spüren. Vertreibt die DNA-Lösung durch leichtes Blasen, entfernen Sie dann mit dem Kran.

  4. Legen Sie die Nadel in den Arm Mikroinjektion, wobei darauf geachtet, um es im kleinen internen Gummidichtung Platz.

  5. Legen Sie eine Nadel-breaking Splitter Deckglas an einer Kante einer Agar-Pad. Bedecken Sie den Splitter, sowie die gesamte Oberfläche des Agar-Pad, mit Halocarbonöl. Legen Sie die Agar-Pad auf der Stufe eines inversen Mikroskops.

  6. Position der Nadel in der Mitte des Gesichtsfeldes mit dem 4X objektive und Hellfeldbeleuchtung, aber noch nicht unten in das Öl. Auch, stellen Sie den inneren Rand der Scherbe Deckglas in der Mitte, dann auf ihn zu konzentrieren (immer noch mit 4X Ziel). Senken Sie die Nadel in das Öl, womit sie in der gleichen Bildebene als Splitter Deckglas. Erhöhen Sie die Vergrößerung durch die Umstellung auf den 40X-Objektiv. Neuausrichtung auf den Rand der Scherbe und Neupositionierung der Spitze der Nadel, wenn nötig.

  7. Zum Öffnen der Spitze der Injektionsnadel, sanft anstoßen die Nadel gegen die Kante der Abdeckung Glasscherbe, während zur gleichen Zeit die Anwendung einen kurzen Impuls von Gas über das Fußpedal. Die Nadel wird ausreichend gebrochen werden geöffnet, wenn kleine Tröpfchen von Flüssigkeit austreten Ende der Nadel. Überschüssige Flüssigkeit fließen durch eine zu große Öffnung ist nicht wünschenswert, da es die Tiere zu töten.

  8. Entfernen Sie die Agar-Pad von der Bühne durch eine Erhöhung der Nadel nach oben, aber keine Änderung der X-oder Y-Achsen-Position. Schieben Sie die Bühne nicht unterhalb der Nadel, entfernen Sie die Agar-Pad und platzieren es auf einem Binokular. Transfer ein Wurm auf dem Pad, unter der Oberfläche des Öls. Wenn der Wurm schlängelt sich sanft streicheln, bis sie die Agar-Pad. Die feuchte Wurm sollte auf die trockene Agarose halten.

  9. Injektion
    1. Raschen Platzierung der Agar-Pad zurück auf die Bühne, Zentrierung der Wurm in das Blickfeld.
    2. Senken Sie die Nadel in der gleichen Ebene des Fokus wie der Wurm.
    3. Schalten Sie den Filter auf Hoffman Illumination (eine Art von Gegensatz Filter). Dies ermöglicht morphologische Details des Wurms sichtbar werden. Wenn Nomarski / DIC-Optik sind auf den invertierten Bereich, der so gut funktionieren wird. Mit dem 40X-Objektiv, über die "körnige" Syncytial Zentrum der Wurm Gonade, unterhalb der "Wabe"-Muster des Keims Kerne (wählen Sie je nachdem, was Gonade befindet sich auf der Seite der Wurm vor der Nadel positioniert) zu konzentrieren.
    4. Feinabstimmung der Position der Nadel, bis die Spitze auch im Fokus (der gleichen Ebene wie die Gonade "Körnigkeit").
    5. Schieben Sie die Nadel in der Mitte der Gonade und wenden Sie einen kurzen Puls der Gasdruck auf einen Tropfen oder zwei von DNA in die Gonaden Arm zu vertreiben. Sie sollten eine Welle der Flüssigkeit verteilt über den distalen Gonaden zu beobachten. Gehen Sie nicht davon mehr flüssig ist besser, da zu viel Flüssigkeit in den proximalen Kurve der Gonade Arm, der heruntergefahren werden Eizelle Produktion fließen kann. Wenn möglich, abhängig von der Position des Wurms, spritzen sie den anderen Gonade Arm in der gleichen Weise.
    6. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten während der Injektion ein Wurm, da sie leicht austrocknen. Die Entscheidung für die zweite Gonade Arm spritzen ist abhängig, wie schnell man wieder Position der Nadel und Wurm. Der gesamte Prozess sollte idealerweise weniger als 1-2 Minuten.

  10. Entfernen Sie die Abdeckung aus Glas von der Bühne und legen Sie es auf einem Binokular. Bewerben 1μl der M9-Puffer (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO 4) direkt auf das injizierte Wurm (dies könnte zur Folge Eintauchen der Pipettenspitze unter der Oberfläche des Halocarbonöl). Der Puffer sollte rehydrieren der Wurm, es wird dann float aus dem Agarose-Pad-Oberfläche. Übertragung der Wurm zu einer regelmäßigen Platte mit einem Wurm zu pflücken. Die Agarose-Pad kann mehrere Male wiederverwendet werden, bis es geworden ist, zu gesättigt mit Puffer und die Würmer nicht mehr zu halten.

Transgene Auswahl

  1. Injected Würmer, die P 0 Generation, sind auf die individuellen frisch, bakteriell ausgesät Platten (60 mm) überführt und zu reproduzieren. Typischerweise sind injizierten Tieren bei 20 ° C für 2-3 Tage inkubiert, bis die Nachkommen erscheinen.

  2. Die F 1 Nachkommen sind zum Nachweis der transgenen Marker (z. B. Fluoreszenz) mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop beobachtet. Jeder fluoreszierend, Träger F 1, ist Tier einzeln auf eine neue Platte geklont (seit Nachkommen von jedem F 1 eine klare Linie berücksichtigt werden). Die F 1 Hermaphroditen sind erlaubt sich zu vermehren. Auch dies ist in der Regel bei 20 ° C für 2-3 Tage durchgeführt, bis die Nachkommen erscheinen.

  3. Die F 2-Generation ist für transgene Tiere sowie beobachtet. F 2 Tiere, die geerbt haben und drücken die transgenen Array werden als "stable"-Zeile.

    HINWEIS: Bei der F 1 stAlter kann es viele transgene Tiere, aber sie sind nicht stabil. Die Mehrzahl der F 1 transgenen Tieren nicht in F 2 stabile Linien vermehrt werden.

    HINWEIS: Für die Steuerung für die Variabilität in der Genkopienzahl, erzeugen ein Minimum von drei unabhängigen stabilen Linien pro Konstrukt injiziert.

  4. Jeder unabhängige stabile Linie sollte in einer separaten Zeile der Würmer gehalten werden. Jede Zeile kann durch die Übertragung von mehreren transgenen Tieren, um eine neue Platte bei jeder Generation weitergegeben werden, dies muss mit Hilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskop werden, wenn der Selektionsmarker ist fluoreszierend.

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Discussion

Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, um:
- Einfügen direkt in das Zentrum der Gonade
- Nicht spritzen zu viel Flüssigkeit
- Schnell zu arbeiten, um Austrocknung zu verhindern.

Wenn Sie Probleme mit der Nadel, wie es gebrochen ist zu groß ausgeführt wird, ist es am besten Remake eine frische Nadel, anstatt zu versuchen, mit einem weniger als ideal Nadel injiziert.

Die Erzeugung von transgenen Würmer hat viele Anwendungen wie zum Beispiel:
- Identifizierung von mutierten Genen, in Methode aufgerufen Transformation Rettung
- Abbildung von Protein-Domänen durch die Expression des verkürzten Proteinen
- Charakterisierung der Rolle eines Gens in Zellen und Krankheitsprozesse.

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Acknowledgements

Wir wollen den Geist der Zusammenarbeit aller Caldwell Lab Mitglieder anzuerkennen. Bewegungsstörungen Forschung im Labor wurde von der Bachmann-Strauss Dystonie & Parkinson Foundation, Vereinigte Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Parkinson Disease Association of Alabama, die Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, und ein Undergraduate Research unterstützt.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

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References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

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