Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Published 8/15/2008
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Biology

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Summary

Cette vidéo montre la technique de microinjection dans la gonade de C. elegans pour créer des animaux transgéniques.

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Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

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Abstract

Caenorhabditis elegans transgéniques peuvent être facilement créées via la micro-injection d'une solution d'ADN plasmidique dans l'une des gonades. L'ADN plasmidique réorganise pour former concatémères extrachromosomique qui sont héritées de façon stable, mais pas avec la même efficacité que les chromosomes réelle 2. Un gène d'intérêt est co-injecté avec un marqueur évident phénotypiques, comme rol-6 ou GFP, pour permettre la sélection d'animaux transgéniques sous un microscope à dissection. Le gène exogène peut être exprimée à partir de son promoteur natif pour les études de localisation cellulaire. Alternativement, le transgène peut être piloté par un promoteur différent tissu-spécifique d'évaluer le rôle du produit du gène dans la cellule ou un tissu particulier. Cette technique entraîne efficacement l'expression des gènes dans tous les tissus de C. elegans à l'exception des cellules germinales de l'embryon ou au début 3. Création d'animaux transgéniques est largement utilisé pour une gamme de paradigmes expérimentaux. Cette vidéo montre la procédure de micro-injection pour produire des vers transgéniques. Par ailleurs, la sélection et le maintien de lignées transgéniques stables C. elegans est décrite.

Protocol

Construction plasmide d'expression

Deux plasmides sont nécessaires: un pour expression tissu-spécifique du gène d'intérêt et d'une seconde comme marqueur de la transformation sélectionnable.

Experimental plasmidique

  1. Sélectionnez un promoteur qui est exprimé dans le type de tissu / cellule d'intérêt, par exemple, un nerf ou de muscle promoteur spécifique. Si l'on est d'exprimer des gènes multiples dans le même tissu, une cassette promoteur plasmide dans le système Gateway (Invitrogen) peuvent être utilisés. Cette approche permet l'insertion d'un gène d'intérêt en aval du promoteur par 4 le clonage par recombinaison. Généralement, 2-5 kb de séquences en amont est suffisante pour avoir l'expression correcte et précise.

  2. L'ADNc du gène d'intérêt peut être cloné de deux façons:
    1. Clonage classiques utilisant des enzymes de restriction.
    2. Pour le clonage de la passerelle, il est amplifié par PCR utilisant des amorces qui contiennent la passerelle att séquence B recombinaison. L'ADNc amplifié est d'abord recombinés dans le vecteur donneur pDONR201 pour créer le vecteur d'entrée et ensuite transformé en E. coli souche DH5a. Après la sélection de recombinants succès et mini-prep isolation de l'ADN, le vecteur d'entrée est recombinée dans le vecteur de destination promoteur contenant de créer le plasmide d'expression. Détails sur le clonage par recombinaison sont disponibles à partir du manuel soit Passerelle Invitrogen ou dans Caldwell et al. 5.

Marqueurs de sélection plasmidique

Des exemples de plasmides marqueur transgénique comprennent rol-6 ou l'utilisation du promoteur musculaire du corps murale unc-54 pour conduire l'expression de protéines fluorescentes. Ces plasmides marqueur sont généralement disponibles au sein de la communauté de la recherche sur demande.

Microinjection de C. elegans

Préparation

  1. Effectuer isolement de l'ADN des deux plasmides qui doivent être injectés. Les quantifier et les mélanger dans un rapport 1:1 de 50 ng / ul chacun.

  2. Préparer coussinets agar:
    1. Faire une solution à 2% d'agarose dans de l'eau, la chaleur ou micro-ondes jusqu'à dissolution.
    2. Énonce plusieurs verres 22 x 50 mm sur un couvercle de paillasse.
    3. En utilisant une pipette Pasteur, déposer une goutte de l'agarose fondu sur un couvercle en verre et placer immédiatement un couvercle en verre seconde sur la baisse à un angle de 90 à la première. Répétez l'opération pour plusieurs verres couvrir d'autres. Le diamètre du disque aplati d'agarose doit être comprise entre 15-20 mm.
    4. Après l'agarose solidifié (Cela ne prend que des moments), retirez le couvercle en verre et de permettre le pad à l'air complètement sec (plusieurs heures pour la nuit).
    5. Boutique des plaquettes dans une boîte en verre couvercle à la température ambiante.

  3. Faire chargeurs aiguille pour la solution d'ADN:

    Chargeurs aiguille sont créés à partir de 100 ul tubes capillaires qui sont chauffés au milieu sur une flamme nue et rapidement tiré à environ deux fois leur longueur. Les deux moitiés sont cassé dehors une fois le tube capillaire se refroidit. Des stocks de 10 à 20 chargeurs de seringues pour l'injection. Conserver en position verticale dans un rack microtube. Faites preuve de prudence pour ne pas se empaler sur les points.

  4. Faire des aiguilles de microinjection:

    L'aiguille est fabriquée à partir d'un tube capillaire spéciale qui contient un filament de verre interne; ce filament sert d'une mèche pour la solution d'ADN. Ce sont tirés sur une machine à aiguille extracteur. Nous utilisons un Narishige PP-830 Extracteur avec un réglage de chaleur de 24,8. Plusieurs aiguilles sont tirés à la fois et sont stockées dans une petite boîte en plastique. Aiguilles multiples peuvent être facilement "monté" sur une bande de pâte à modeler pour le stockage à long terme.

  5. Pointe de l'aiguille "disjoncteurs":

    La pointe de l'aiguille de microinjection est tiré si fine qu'elle est effectivement fermé à son extrémité et doit être défoncé à l'aide des tessons de verre petite couverture. Ce sont préparés par emballage de 18 x 18 mm couvercle en verre dans une serviette de papier et appliquer une pression doucement jusqu'à ce qu'elle se brise en plusieurs morceaux. Les éclats d'une taille utile est d'environ 3 x 4 mm.

  6. Cultivez de type sauvage (N2) vers le stade adulte au début d'injection en utilisant des procédures standard de 6. Préparer environ 100 bien mis en scène des vers / construire injecté.

Procédure

  1. Ouvrez la vanne principale sur un réservoir d'hélium qui est relié à un bras de l'aiguille de microinjection et titulaire. Fermez la vanne de régulation pour permettre au gaz d'entrer dans la ligne, amenant la pression à 35 psi. Notez que le gaz peut être libéré à l'aide d'une pédale.

  2. Insérez un chargeur aiguille dans un tube pipetteur bouche standard (trouvés dans des récipients de tubes capillaires en verre) et d'établir une petite quantité du mélange plasmide (~ 1 pl).

  3. Le chargeur de l'aiguille est bien placée dans l'extrémité arrière d'une aiguille d'injection et délicatement insérées tout au long de la longueur del'aiguille jusqu'à sentir une résistance. Expulser la solution d'ADN en soufflant doucement, puis retirer le chargeur.

  4. Insérez l'aiguille dans le bras de micro-injection, en prenant soin de le placer dans le joint en caoutchouc internes de petite taille.

  5. Placer un tesson aiguille bris de glace couvre sur un bord d'un tampon d'agar. Couvrir le fragment, ainsi que toute la surface du pad agar-agar, avec de l'huile d'halocarbures. Placez le tampon d'agar sur la scène d'un microscope inversé.

  6. Position de l'aiguille dans le centre du champ visualisation en utilisant l'objectif 4X et l'illumination en champ clair, mais n'ont pas encore l'abaisser dans l'huile. En outre, la position du bord interne de l'éclat de verre de couverture dans le centre, puis se concentrer sur elle (toujours avec l'objectif 4X). Abaissez l'aiguille dans l'huile, le ramenant dans le même plan focal que l'éclat de verre de couverture. Soulevez le grossissement en passant à l'objectif 40X. Recentrage sur le bord du tesson et repositionner la pointe de l'aiguille, si nécessaire.

  7. Pour ouvrir la pointe de l'aiguille d'injection, doucement pousser l'aiguille contre le bord du verre couvre éclat, tandis que dans le même temps l'application d'une impulsion courte de gaz via la pédale. L'aiguille sera suffisamment rompu ouvert lorsque de petites gouttelettes de liquide échapper à la fin de l'aiguille. L'excès de flux liquide due à une trop grande ouverture n'est pas souhaitable, car elle va tuer les animaux.

  8. Enlever le tampon d'agar de la scène en levant l'aiguille en place, mais ne changent pas l'X ou l'axe Y de position. Faites glisser le stade de dessous de l'aiguille, retirer le tampon d'agar et le placer sur un microscope à dissection. Transfert d'un ver sur le pavé, en dessous de la surface de l'huile. Si le ver se tortille, doucement caresser jusqu'à ce qu'il touche le pad agar. Le ver humide doit adhérer à la sécheresse agarose

  9. Injection
    1. Placer rapidement le dos pad agar sur la scène, le centrage le ver dans le champ de vision.
    2. Abaissez l'aiguille dans le même plan d'orientation que le ver.
    3. Mettre le filtre à Hoffman éclairage (un type de filtre de contraste). Cela permet détails morphologiques du ver à devenir visibles. Si Nomarski / DIC optiques sont disponibles sur le champ inversé qui fonctionnera aussi bien. En utilisant l'objectif 40X, se concentrer sur le "grain" centre syncytial de la gonade ver, en dessous du "nid d'abeille" modèle des noyaux germinales (choisir le gonade est positionné sur le côté du ver face à l'aiguille).
    4. Ajustez la position de l'aiguille jusqu'à la pointe est également en discussion (le même plan que la gonade "grain").
    5. Insérer délicatement l'aiguille dans le centre de la gonade et appliquer une brève impulsion de pression de gaz d'expulser une goutte ou deux de l'ADN dans le bras des gonades. Vous devriez observer une vague de propagation de liquide dans la gonade distale. Ne présumez pas plus de liquide est préférable, car trop de liquide peut couler dans le virage proximale du bras gonades, qui peut arrêter la production d'ovocytes. Si possible, selon la position du ver, injecter le bras gonades d'autres de la même manière.
    6. Il est important de travailler rapidement tout en injectant un ver, car il peut facilement se dessèchent. La décision d'injecter le bras gonades seconde dépend de la rapidité avec laquelle vous pouvez repositionner l'aiguille et le ver. L'ensemble du processus devrait idéalement prendre moins de 1-2 minutes.

  10. Retirez le couvercle en verre de la scène et placez-le sur un microscope à dissection. Appliquer 1 microlitre de M9 tampon (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm de NaCl, 1 mM MgSO 4) directement sur ​​le ver injecté (cela pourrait entraîner submergeant la pointe de la pipette en dessous de la surface de l'huile d'halocarbures). Le tampon doit réhydrater le ver, il sera alors flotter la surface du tampon d'agarose. Transfert du ver à une plaque régulière en utilisant un pick ver. Le coussin d'agarose peuvent être réutilisées plusieurs fois jusqu'à ce qu'il est devenu trop saturé de tampon et les vers ne plus adhérer.

Sélection transgéniques

  1. Ver injecté, le P 0 génération, sont transférés à chaque nouvelle, les plaques des bactéries ensemencées (60 mm) et autorisé à reproduire. Typiquement, les animaux injectés sont incubées à 20 ° C pendant 2-3 jours jusqu'à ce que la progéniture apparaissent.

  2. La progéniture F 1 sont observés pour les preuves du marqueur transgénique (telles que la fluorescence) en utilisant un stéréomicroscope fluorescentes. Chaque fluorescentes, porteuse F 1, un animal cloné est séparément sur ​​une nouvelle plaque (depuis la progéniture de chaque F 1 sont considérées comme une ligne distincte). Le 1 F hermaphrodites sont autorisés à reproduire. Là encore, cela est généralement effectuée au moins 20 ° C pendant 2-3 jours jusqu'à ce que la progéniture apparaissent.

  3. La génération F 2 est observée pour les animaux transgéniques ainsi. F 2 animaux qui ont hérité et d'exprimer le tableau transgéniques sont considérées comme un «stable» en ligne.

    REMARQUE: Lors de la F 1 erâge, il peut y avoir beaucoup d'animaux transgéniques, mais ils ne sont pas stables. La majorité des animaux transgéniques F 1 ne seront pas propagées dans F 2 lignées stables.

    REMARQUE: Pour le contrôle de la variabilité du nombre de copies du gène, de générer un minimum de trois lignes indépendantes stable par la construction injecté.

  4. Chaque ligne indépendante stables devraient être maintenues sur une ligne distincte des vers. Chaque ligne peut être propagé par le transfert de plusieurs animaux transgéniques pour une nouvelle plaque à chaque génération, ce qui doit être effectuée en utilisant un stéréomicroscope fluorescentes si le marqueur de sélection est fluorescent.

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Discussion

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de:
- Injecter directement dans le centre de la gonade
- Ne pas injecter trop de liquide
- Travailler rapidement pour empêcher la dessication.

Si vous rencontrez des problèmes avec l'aiguille, comme elle est cassée trop grand, il est préférable de refaire une aiguille neuve, plutôt que d'essayer d'injecter avec une aiguille de moins idéale.

La génération des vers transgéniques a de nombreuses applications telles que:
- L'identification des gènes mutants, dans la méthode appelée transformation de sauvetage
- La cartographie des domaines protéiques à travers l'expression de protéines tronquées
- La caractérisation du rôle d'un gène dans les processus cellulaires et de la maladie.

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Acknowledgements

Nous tenons à souligner l'esprit de coopération de tous les membres du laboratoire Caldwell. Mouvements anormaux de recherche dans le laboratoire a été soutenu par la dystonie Bachmann-Strauss & Parkinson Foundation, Royaume-Parkinson Foundation, American Association Maladie de Parkinson, la maladie de Parkinson Association de l'Alabama, la Fondation Michael J. Fox pour la recherche sur le Parkinson, et une recherche de premier cycle.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

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References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

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11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

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