Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Published 8/15/2008
11 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Bu video transgenik hayvanlar oluşturmak için C. elegans gonad içine mikroenjeksiyon tekniği göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation

Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transgenik Caenorhabditis elegans gonad 1 DNA plazmid çözüm mikroenjeksiyon ile kolayca oluşturulabilir. Plazmid DNA, stabil bir şekilde olsa da gerçek kromozom 2 olarak aynı verimlilikle değil, miras alınır ekstrakromozomal concatamers oluşturmak için yeniden düzenler . Diseksiyon mikroskobu altında transgenik hayvanlar seçimi izin vermek, ilgi bir gen rol-6 ya da GFP gibi bariz bir fenotipik işaretleyici ile ortak enjekte edilir. Eksojen gen hücresel yerelleştirme çalışmaları için ana organizatörü ifade edilebilir. Alternatif olarak, transgen, bu belirli bir hücre ya da doku gen ürünü rolünü değerlendirmek için farklı bir doku-spesifik organizatörü tarafından sürülebilir. Bu teknikte verimli C. elegans germline ya da erken embriyo 3 hariç bütün dokularda gen ekspresyonu sürücüler. Transgenik hayvanlar oluşturulması, deneysel paradigmalar bir dizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu video transgenik solucanları oluşturmak için mikroenjeksiyon işlemi göstermektedir. Ayrıca, istikrarlı transgenik C. elegans hatları seçimi ve bakım açıklanmıştır.

Protocol

İfade Plazmid yapı

İki plazmid gereklidir: doku özel ilgi gen ekspresyonu ve seçilebilir dönüşüm belirteci olarak ikinci bir biri.

Deneysel Plazmid

  1. Örneğin faiz doku / hücre tipi, bir sinir ya da kas-özel organizatörü olarak ifade organizatörü seçin. Aynı doku içinde birden fazla genin ifade etmek için ise, Gateway sisteminin (Invitrogen) plazmid bir yararlanıcı kaset kullanılabilir. Bu yaklaşım, recombinational klonlama 4 organizatörü faiz downstream herhangi bir gen ekleme sağlar. Genellikle 2-5 kb upstream dizilerinin doğru ve doğru ifade etmek için yeterli.

  2. CDNA ilgi genin iki şekilde klonlanmış olabilir:
    1. Restriksiyon enzimlerini kullanarak Konvansiyonel klonlama.
    2. Gateway klonlama için, PCR Ağ Geçidi att B recombinational dizisi içeren primerler kullanılarak amplifiye. Amplifiye cDNA ilk giriş vektörü oluşturmak için donör vektör pDONR201 recombined ve sonra E. dönüştü coli suşu DH5a. Başarılı rekombinantlar ve DNA mini hazırlık izolasyon seçimi takiben, giriş vektörü ifade plazmid yaratmak için organizatörü içeren hedef vektör recombined. Recombinational klonlama Ayrıntılar Invitrogen Ağ Geçidi manuel veya Caldwell ve ark mevcuttur. 5.

Plazmid Seçilebilir Marker

Transgenik işaret plazmid örnekleri, rol-6 ya da vücut duvarı kas organizatörü unc-54 floresan protein ekspresyonu sürücü kullanımı sayılabilir. Bu işaretleyici plazmidler genellikle istek üzerine araştırma toplum içinde mevcuttur.

C. elegans, Mikroenjeksiyon

Hazırlık

  1. Enjekte edilecek olan iki plazmid DNA izolasyonu gerçekleştirin. Asitli ve 50 ng / ul her 1:1 oranında karıştırın.

  2. Agar pedleri hazırlayın:
    1. Eriyene kadar ısı veya mikrodalga% 2 agaroz su çözümü olun.
    2. Bir masa üstü birkaç 22 x 50 mm kapak camları yola çıktı.
    3. Pasteur pipeti kullanarak, bir kapak cam erimiş agaroz bir damla koyun ve hemen ilk 90 açıyla açılan üzerinden ikinci bir cam kapak yerleştirin. Diğer birçok kapak camları için bu işlemi tekrarlayın. Agaroz basık disk çapı 15-20 mm arasında olmalıdır.
    4. Agaroz (Bu dakikanızı alır) katılaşmış sonra, kapak camını çıkarın ve pedi tamamen kurumaya izin (bir gecede birkaç saat).
    5. Cam bir kapakla kutusunda yastıkları, oda sıcaklığında saklayın.

  3. DNA çözümü için iğne yükleyiciler olun:

    İğne yükleyiciler ortasında açık ateşte ısıtılır ve boyları yaklaşık iki katı hızla çekti 100 ul kılcal tüpler oluşturulur. Kılcal tüp soğutulduktan sonra iki yarısı ayrı tersledi. 10-20 enjeksiyon için iğne yükleyiciler Stoğu. Dik bir mikrosantrifüj tüp rafta saklayın. Noktalarda kendini Impale olarak dikkatli kullanın.

  4. Mikroenjeksiyon iğne yapın:

    Bir iç cam elyaf içeren özel bir kılcal tüpten iğne yapılır; bu filament DNA çözümü için bir fitil olarak hizmet vermektedir. Bu iğne çektirmenin makinede çekilir. Biz bir ısı ayarı ile 24.8 Narishige PP-830 çektirmesi kullanın. Bir seferde birkaç iğne çekilir ve küçük bir plastik kutu içinde saklanır. Birden fazla iğne kolayca modelleme kil, uzun süreli depolama için bir şerit üzerinde "monte" olabilir.

  5. İğne ucu "kesiciler"

    Mikroenjeksiyon iğne ucu kadar ince aslında sonu kapalı olduğunu çekilir ve küçük kapak cam kırıkları ile açık kırık olmalıdır. Bu bir kağıt havlu, 18 x 18 mm kapak cam ambalaj ve birkaç parçaya kırar kadar hafifçe basınç uygulayarak tarafından hazırlanır. Shard yararlı bir boyutu yaklaşık 3 x 4 mm.

  6. Vahşi tip (N2) solucanlar standart prosedürler kullanarak 6 enjeksiyon için erken yetişkinlik evresi için büyütün. Yaklaşık 100 hazırlayın düzgün solucanlar sahnelenen / inşa enjekte.

Prosedür

  1. Mikroenjeksiyon iğne kol ve sahibine bağlı olan bir helyum tankı ana vanayı açın. Gaz basıncı 35 psi getirerek, çizgi girmek için izin vermek için regülatör vanasını kapatın. Ayak pedalı ile gaz açığa çıkabilir dikkat edin.

  2. Bir iğne yükleyici, standart bir ağız pipetter cam kapiller tüplerin kaplar içinde bulunan tüp içine yerleştirin ve plazmid karışımı (~ 1 ul) küçük bir miktar yukarı çekmek.

  3. Iğne yükleyici bir enjeksiyon iğnesi arka uç dikkatlice yerleştirilir ve hafifçe uzunluğu boyunca tüm yol takılıiğne kadar direnç hissedilir. Hafifçe üfleyerek DNA çözüm kovduktan sonra yükleyici çıkarın.

  4. Küçük kauçuk conta içinde yerleştirmek için dikkatli olmak, mikroenjeksiyon koluna iğne takın.

  5. Agar bir ped bir kenarı cam kapak iğne kırma shard yerleştirin. Halokarbon yağ ile, shard, agar pad gibi tüm yüzeyi örtün. Ters bir mikroskop sahnede agar yastık yerleştirin.

  6. 4X objektif ve parlak bir alan aydınlatma kullanarak görüş alanının merkezinde iğne pozisyonu, ama henüz yağa düşürmez. Ayrıca, merkezde kapak cam shard iç kenarı konumu, o zaman odaklanmak (hala 4X objektif kullanarak). Cam kapak shard aynı odak düzlem haline getirerek, yağ içine iğne indirin. 40X objektif geçiş büyütme kaldırın. Shard kenarı üzerinde odaklanılması ve gerekirse iğne ucu yeniden konumlandırmak.

  7. Ayak pedalı ile gaz kısa bir darbe uygulayarak, aynı zamanda da bir iğne ucu kadar açmak için, yavaşça, kapak cam Shard kenarına iğne dürtmek. Sıvı küçük damlacıklar iğne sonunda kaçmak iğne yeterince açık kırılmış olacaktır. Hayvanları öldürecek gibi çok büyük bir açılış nedeniyle Aşırı sıvı akış, arzu edilen değildir.

  8. Iğne kadar yükselterek aşamasından agar pedini, ancak X ya da Y ekseni konumunu değiştirmez. Aşamada iğnenin altından dışarı doğru kaydırın, agar pad kaldırmak ve diseksiyon mikroskobu üzerine yerleştirin. Petrol yüzeyinin altında bir solucan, ped üzerine aktarın. Eğer solucan wriggles, yavaşça felç temas agar pad kadar. Nemli solucan kuru agaroz uymalıdır.

  9. Enjeksiyon
    1. Hızla, sahneye agar pad yerine geri görüş alanı solucan merkezleme.
    2. Solucan gibi odak aynı düzlem içine iğne indirin.
    3. Hoffman Işık (kontrast filtre türü) filtreleri geçin. Bu solucanın morfolojik ayrıntı görünür olmasını sağlar. Nomarski / DIC optik ters kapsamı üzerinde de çalışacak. 40X objektif kullanarak, mikrop çekirdeğinin "petek" desen altında solucan gonad "grenli" sinsityal merkezi, (solucan iğne bakan tarafında konumlandırılmış hangisi gonad seçin) odaklanmak.
    4. İnce ayar iğne ucu (gonad "grenleşme" olarak aynı düzlemde) odak kadar pozisyonu.
    5. Gonad merkezi haline hafifçe iğne takın ve DNA ile ilgili bir ya da iki damlacık gonad kol sınırdışı gaz basıncı kısa bir darbe uygulayın. Distal gonad boyunca sıvı yayılmış bir dalga dikkat etmelisiniz. Oosit üretim kapatabilirsiniz gonad kol proksimal viraj içine çok fazla sıvı akabilir yılından bu yana daha fazla sıvı, daha iyi kabul etmeyin. Eğer mümkünse, solucanın pozisyonuna bağlı olarak, aynı şekilde diğer gonad kol enjekte edilir.
    6. Kolaylıkla birbirinden ayrılacak gibi, bir solucan enjekte ederken hızlı çalışması için önemlidir. Ikinci gonad kol enjekte kararı iğne ve solucan yeniden pozisyonu ne kadar hızlı bağlıdır. Tüm süreci, ideal olarak 1-2 dakika daha az almalıdır.

  10. Aşamasından cam kapak çıkarın ve diseksiyon kapsamı üzerine yerleştirin. Doğrudan enjekte solucan üzerine M9 tampon 1μl (22mm KH 2 PO 4, 42mm, Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1mm MgSO 4) (Bu Halokarbon petrol yüzeyinin altında pipet daldırarak yol açabilir) uygulayın. Tampon solucan rehidrate; sonra agaroz ped yüzeyi yüzer. Bir solucan almak kullanarak normal bir plaka solucan aktarın. Agaroz ped, tampon ve solucanlar artık uymak çok doymuş hale kadar birkaç kez daha tekrar edilebilir.

Transgenik seçimi

  1. Enjekte solucanlar, P 0 nesil, bireysel taze, bakteriyel numaralı seribaşı levhalar (60 mm) aktarılır ve üremek için izin verilir. Tipik olarak, enjekte edilen hayvanların yavrular ortaya çıkıncaya kadar 2-3 gün süreyle 20 ° C'de inkübe edilir.

  2. F 1 yavrular floresan stereomikroskopta kullanarak transgenik marker (örneğin floresans) kanıt görülmektedir. Her floresan, taşıyıcı F 1, hayvan ayrı ayrı (her F 1 yavrulara ayrı bir hat kabul edilir) yeni bir plaka üzerine klonlanmış olduğunu. F 1 çift cinsiyetli, üremek için izin verilir . Yine, yavrular ortaya çıkıncaya kadar bu genellikle 20 ° C de 2-3 gün için yapılır.

  3. F 2 nesil transgenik hayvanlar için de görülmektedir. F 2 hayvan miras ve transgenik dizi ifade "istikrarlı" bir çizgi olarak kabul edilir .

    NOT: F 1 styaşı birçok transgenik hayvanlar olabilir, ama onlar kararlı değildir. F 1 transgenik hayvanlar çoğunluğu F 2 istikrarlı hatları içine yayılır olmayacaktır.

    NOT: gen kopya sayısı değişkenliği kontrol etmek için, en az enjekte inşa başına üç bağımsız sabit hatları oluşturur .

  4. Her bağımsız istikrarlı bir çizgi solucanlar ayrı bir çizgi olarak muhafaza edilmelidir. Her satır, her nesil yeni bir plaka birkaç transgenik hayvanlar transfer tarafından yayılan olabilir; seçilebilir marker floresan ise bu floresan stereomikroskopta kullanarak yapılmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu işlemi yaparken, hatırlamak önemlidir:
- Gonad merkezi içine doğrudan enjekte
- Çok fazla sıvı enjekte
- Kuruma önlemek için hızlı bir şekilde çalışır.

Çok büyük kırık gibi iğne ile ilgili sorunlar yaşarsanız, bu daha az ideal bir iğne ile enjekte etmeye çalışıyor yerine, taze bir iğne yeniden en iyisidir.

Transgenik solucanlar nesil gibi birçok uygulama vardır:
- Mutant genlerin belirlenmesi, dönüşüm kurtarma yöntemi denir
- Kesilmiş proteinleri ifade ile protein etki haritalama
- Hücresel ve hastalık süreçlerinin bir gen rol karakterizasyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Bachmann-Strauss Distoni ve Parkinson Vakfı, Birleşik Parkinson Vakfı, Amerikan Parkinson Hastalığı Derneği, Parkinson Hastalığı Derneği Alabama, Michael J. Fox Parkinson Araştırma Vakfı ve Lisans Araştırma laboratuarında Hareket bozuklukları araştırma tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats