Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å injisere plasmider DNA i mus nyre via nyresvikt bekkenet å produsere transgene uttrykk spesielt i nyret.
Abstract
Etter injeksjon oppretter en lokal, høytrykks miljø for å transfect ulike vev med plasmider DNA og andre stoffer. Etter halen blodåre injeksjon, for eksempel er en etablert metode som leveren kan være transfected. Dette manuskriptet beskriver et program etter prinsipper ved injeksjon av mus nyre direkte med plasmider DNA for nyre-spesifikke genuttrykk. Mus er anesthetized og nyre utløses av en flanke snitt etterfulgt av en rask injeksjon av en plasmider DNA inneholder løsning direkte til nyresvikt bekkenet. Nålen holdes på plass i ti sekunder og webområdet snitt Burrows. Dagen live dyr bildebehandling, Western blot, eller immunohistochemistry kan brukes til analysen genuttrykk eller andre analyser til transgene valgfrihet brukes for påvisning av protein av interesse. Publisert metoder for å forlenge genuttrykk inkluderer transposon-mediert transgene integrering og cyklofosfamid behandling for å hemme immunforsvaret til av transgene.
Introduction
Etter halen blodåre injeksjon teknikken har blitt en vanlig måte å oppnå høye nivåer av genuttrykk i musen leveren1,2. Nyrene er også transfekterte av denne teknikken på et mye lavere nivå, ca 100 ganger mindre3. Etter nyresvikt bekkenet injeksjon beskrevet her gir en enkel måte å kontrollere spesifisiteten av orgel uttrykk gjennom fysiske midler de samme etter prinsippene som ble opprettet tidligere i leveren4,5 , muskel6og andre organer7,8. Denne metoden transfects celler i levende dyr i vivo ved hjelp av press og fart å tvinge væske som inneholder DNA i cellene, samtidig inducing skade orglet som er raskt løst9. Bruke veletablerte kirurgiske teknikker for å visualisere nyre via en flanke snitt10 sammen med en enkelt injeksjon av insulin sprøyten, har vi funnet vellykket transfection ulike typer nyreceller, hovedsakelig interstitiell fibroblaster, tubuli og samle duct11. Disseksjon av disse musene har vist at andre organer ikke er transfekterte på et nivå høyt nok til å visualisere ved luciferase imaging teknikker11. Siden teknikken er ikke-viral, tillater bruk av plasmider DNA for transfection raskt og enkelt forberedelse av reagenser kreves for injeksjon.
Vi har brukt lokaliserte etter injeksjoner uttrykke antioksidant glutation S-transferase A4, insulin-lignende vekstfaktor 1 reseptoren og hormon erytropoietin i nyrene, alle med den forventede biologiske effekter11, 12 , 13. detaljert evaluering av administrasjonen, injeksjon volum, DNA dosering og promoter valg har vært utført11. I tillegg både piggyBac transposon system og/eller cyklofosfamid behandling å undertrykke immunreaksjon til av transgene vist seg å forbedre langsiktig genet uttrykk utfall11. Andre etterforskere har brukt en nyre blodåre tilnærming i rotte med suksess, oppnå høy transfection effektivitet for perioder på mer enn én måned14. Imidlertid genetisk korrigering av fenotyper mimicking menneskelig sykdom vanligvis utføres i mus først som en proof-of-concept siden de fleste pattedyr genetisk modeller er musen modeller. Vi sammenlignet nyre blodåre injeksjon til nyresvikt bekkenet injeksjon og fant at injeksjon i nyresvikt bekkenet var overlegen nyre venen for genuttrykk (ca ti-fold høyere) og overlevelse11. Nyresvikt bekkenet er en ideell ruten trer i nyrene fordi det er fleksibel nok til å tåle svingninger i urin produksjon og er ofte kjøpedyktig vedlikeholde dens strukturelle integritet selv når utvidet under hydronephrosis. I tillegg injeksjon i nyresvikt bekkenet tilgang til nyrene uten piercing nyre kapselen, slik at de injiserte væsken beholdes synlig av nyre bedre enn intraparenchymal injeksjon. Andre mus organer har ikke en rute posten enn er blodkar, men urin løpet av nyre er en ideell injeksjonsstedet. I tillegg resulterte injeksjon i nyre venen i lekkasje av blod i bukhulen. Totalt nyre volumet av vill-type mus nyrene har blitt anslått av magnetisk resonans imaging å være ca 0.2 cm3, slik at volumet av en enkelt nyre er omtrent lik mengden av væske injisert med nyresvikt bekkenet etter injeksjon (100 µL)15. Her, har vi gjort alle detaljerte nyansene av etter nyresvikt bekkenet injeksjon protokollen for å oppnå reproduserbar transfection av nyret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUCs) av Baylor College of Medicine og Vanderbilt University Medical Center.
1. klargjør DNA løsningen for injeksjon
- Velg plasmid(s) å uttrykke transgene(s) nøye for å maksimere ønskelig egenskaper for å forbedre transfection effektivitet og transgene uttrykk.
Merk: Etter nyresvikt bekkenet injeksjon av plasmider uttrykke fluorescerende markøren TdTomato, hormon erytropoietin (Epo) og firefly luciferase har vært beskrevet tidligere11. Hvis det ikke er en velutviklet analysen for hva effektivitet for transgene, utføre live dyr bildebehandling av luciferase ved å introdusere 10 µg av luciferase-uttrykke plasmider som forbedret firefly luciferase til utvannet DNA for injeksjon.- Velg den minste plasmider som er praktisk for programmet.
Merk: Liten plasmider generelt transfect celler bedre enn store plasmider. For eksempel er zeomycin motstand gene og R6K opprinnelse replikering liten, så utnytte disse elementene i plasmider ryggraden reduseres plasmider størrelse. - Uttrykke transgene fra en pattedyr promoter.
Merk: Nyre celle type transfekterte, lengden av genuttrykk og styrke av genuttrykk alle påvirkes av arrangøren valg. Se Woodard et al. en sammenligning mellom cytomegalovirus (CMV, konstituerende viral), forlengelse faktor-1 alpha (EF-1α; konstituerende endogene), gamma-glutamyl transferase (γGT, tubule-spesifikke) og podocin (NPHS2, podocyte-spesifikke)11. - Ansette en ikke-viral integrere system som transposons dersom høyere langsiktige gene expression nivåer er ønskelig11,16. For studier med tidlig readouts på mindre enn 5 dager etter injeksjon er integrering av transgene unødvendig.
- Velg den minste plasmider som er praktisk for programmet.
- Forberede plasmider DNA injeksjon med en kommersiell metode som en endotoxin-gratis maxiprep kit. Nøye unngå å innføre endotoxins via labware.
Merk: Tilstedeværelsen av endotoxins i DNA løsningen vil lokke fram en alvorlig immunrespons i emnet dyr, at eksperimentet og muligens drepe dyret.- Etter siste DNA isolasjon wash trinn er fullført, må ingen etanol er igjen av visuell inspeksjon og lukt. Bruk gel-lasting tips for å fjerne synlige drops. Tørr rør som inneholder DNA pellet opp ned på laboratoriet delikate oppgaven svaber vev ved romtemperatur eller i en 37-60 ° C ovnen med konstant overvåking. Resuspend pellet straks gjenværende etanol har fordampet for å forhindre uttørring av pellet.
Merk: Gjenværende etanol forstyrrer spektrofotometer lesing av DNA konsentrasjonen og introduksjon til nyrene er ikke ønskelig. - Resuspend DNA pellet i samme bufferen som brukes for injeksjon (etter levering buffer, 100-300 µL) for å begrense variasjon i den kjemiske sammensetningen av DNA buffer løsning mellom grupper.
Merk: Ikke resuspend DNA pellet i elueringsrørets buffer løsning som følger med settet. Chelaterande agent EDTA ofte funnet i "TE" buffer preparater kan påvirke nyre og kardiovaskulær funksjon. Avhengig av størrelsen på pellet, elute i 100-300 µL av etter levering buffer for å oppnå en høy konsentrasjon. Siste konsentrasjonen av fullt utvannet DNA vil være mellom 100 ng/µL (10 µg/mus dose) og 500 ng/µL (50 µg/mus dose) så lager DNA konsentrasjonen bør overstige dette. - Fullt resuspend DNA pellet i bufferen. La pellet etter levering buffer i opprinnelige røret ved romtemperatur for minst en time eller over natten på 4 ° C før overføring til et sterilt microfuge rør slik at DNA er fullstendig oppløst.
- Les plasmider DNA konsentrasjonen på et spektrofotometer eller en etablert metode.
Merk: Målingene bør gjøres i duplikat med ekstra gjentak om nødvendig. Hvis 260/280 forholdet er under 1.8, forberedelsene er forurenset med RNA eller annen substans så kaste den og forberede DNA igjen. - Store plasmider DNA resuspended injeksjon buffer på 20 ° C i en boks i en manual avrime fryseren å unngå nedbrytning av DNA.
Merk: Lagret på denne måten, vil DNA utarbeidelse vare i mange år. Kontroller integriteten til DNA ved begrensning Sammendrag og agarose gel geleelektroforese. DNA som er smurt kjørefelt har degradert og kan ikke brukes mens DNA som gir skarpe band av riktig størrelse kan brukes for injeksjon.
- Etter siste DNA isolasjon wash trinn er fullført, må ingen etanol er igjen av visuell inspeksjon og lukt. Bruk gel-lasting tips for å fjerne synlige drops. Tørr rør som inneholder DNA pellet opp ned på laboratoriet delikate oppgaven svaber vev ved romtemperatur eller i en 37-60 ° C ovnen med konstant overvåking. Resuspend pellet straks gjenværende etanol har fordampet for å forhindre uttørring av pellet.
- Klargjør utvannet plasmider DNA løsningen for injeksjon i nyresvikt bekkenet.
Merk: Vurdere kontroll grupper nøye. For mange studier er naiv og buffer injisert-bare kontroller inkludert fordi injeksjon selv forårsaker skade og kan påvirke den eksperimentelle resultat11.- Defrost endotoxin-gratis DNA elut etter levering buffer ved romtemperatur på benken.
- Beregn mengden av DNA nødvendig for injeksjoner og forberede utvannet DNA for hver gruppe. Administrere 10-50 µg av plasmider DNA brakt til et totalt volum på 100 µL med etter levering buffer per musen.
Merk: For eksempel beregningene å injisere 3 mus med 10 µg/mus med en DNA plasmider som har en konsentrasjon på 0,5 µg/µL er som følger.- Forberede nok DNA løsningen å ha omtrent 20% ekstra for lasting sprøyter og død plass på nålen. For 3 mus, forberede en blanding på 3,5 x. Beregn massen av DNA i µg som bør være i løsningen. Her vil det være 10 µg x 3,5 = 35 µg.
- Beregne det totale volumet av løsning ønsket for sprøytebruk 100 µL per musen. I dette tilfellet ville det være 100 µL x 3,5 = 350 µL totalt volum.
- Beregne volumet av lager plasmider DNA å legge til løsningen. I dette tilfellet, det ville være 35 µg / 0,5 µg/µL = 70 µL av lager plasmider DNA.
- Beregne volumet av buffer for å legge til utvannet DNA løsningen ved å trekke volumet av lager DNA lagt (trinn 1.3.2.3) fra det totale volumet av utvannet DNA som ønsket (trinn 1.3.2.2). I dette tilfellet ville det være 350 µL - 70 µL = 280 µL etter levering buffer.
- Utarbeide løsninger i sterilt microfuge rør kommersielt tilgjengelig filter pipette-spisser med steril teknikk på lab-benken.
Merk: DNA løsninger kan være forberedt og oppbevares ved romtemperatur for injeksjoner satte til den dagen. Ikke Injiser mus med en kald løsning som dette vil redusere kroppstemperaturen, men oppvarming er unødvendig.
2. Utfør etter nyresvikt bekkenet injeksjon kirurgi
- Velg mus nøye for kirurgi.
Merk: Stammen spesifikke forskjellene er ennå ikke registrert, men kan forekomme. De fleste injeksjoner har vært på C57BL/6 eller FVB bakgrunner. Nyresvikt bekkenet injeksjoner fungerer best i mus som er 6-12 uker gamle. I mus større enn 16 uker, til en 50% strykprosent av luciferase er imaging mulig uklart grunner. Samme alder-relaterte svikten har observert etter halen blodåre injeksjoner til leveren så dette kan være en generell begrensning gjelder prinsippet om etter injeksjon. Langs de samme linjene, andre har vist at etter halen blodåre injeksjon i fibrotiske rotten leveren ikke er så effektiv som sunt leveren, så det kan være mulig at i innstillingene for nyre fibrose nyresvikt bekkenet etter injeksjon ikke vil være effektivt, men Dette er ikke testet direkte17. - Forberede mus og DNA sprøyter kirurgi.
- Bedøve mus med ketamin og xylazine.
- Sette på de riktige personlige verneutstyret kreves av dyr anlegget, som disponibel lab forkle, kirurgisk ansiktsmaske og nitrilhansker.
- Arbeide med 2-4 mus samtidig, veie hver musen i et 500 mL plast beaker på en skala som er 0,1 g. beregne riktig mengde 24 mg/mL ketamin og 2 mg/mL xylazine fortynnet i normal 0,9% saltløsning administrere hver musen ved intraperitoneal injeksjon (se refererte video for mer om intraperitoneal injeksjon) 18. Bruk formel (50 µL + ((5 µL) x (vekt (g))), eller alternativt beregne i henhold til en formel etter samråd med lokale veterinær team og IACUC.
- Sette inn musen ved intraperitoneal injeksjon av standardmetoder. Plass musen i en papir bøtte til musen er immobile.
Merk: Mus er moden til kirurgi når de ikke lenger reagerer på tå-klype prøve. Gi musene som reagerer til tå-klemme teste 20-30 min etter første injeksjon 20-60 µL mer anesthetic, avhengig av svaret. - Sted musen på en vann-sirkulert heten pute dekket med blå puten og sted vet salve på begge øynene å hindre hornhinnen uttørking.
- Barbere venstre side av baksiden av musen fra skulder til bakdel og flanke ryggraden med en barbermaskin designet for Kjæledyrstell. Fjerne løse hår og rusk.
- Forberede en egen sprøyte som inneholder 100 µL av utvannet DNA for hver bedøvet musen, gjør at det ikke er noen luftbobler.
- Bruk en steril 29G x ½" 0,5 mL U-100 insulinsprøyte med en permanent festet nål uten sikkerhet.
Merk: Sprøytemerke er av avgjørende betydning. Denne måleren tillater en rask injeksjon. Permanent festet nålen hindrer løsningen lekker. Tilstedeværelsen av en sikkerhet vil hindre tilgang til nyresvikt bekkenet. De sprøytemerker som er angitt i tabellen materialer glir mer jevnt under injeksjon enn andre merker testet. - Legg i sprøyten til ~ 120 µL og dra stempelet for å skape et rom på toppen. Trykk med penn før alle air bobler stige til toppen. Holde nålen opp, forsiktig trykk ned stempelet for å fjerne alle til et slippverktøy danner på spissen av nålen. Det bør ikke være synlig bobler stede, disse kan forårsake en air embolism som vil drepe dyret.
- Fullfør deprimerende stempelet til det er 100 µL i sprøyten ved å tømme overflødig DNA løsning i den opprinnelige microfuge tuben. Nøye merke hvis nødvendig og plasser lastet sprøyter på et sterilt drapere å opprettholde sterilitet hvis anlegget der arbeidet utføres ikke tillater recapping nåler.
- Bruk en steril 29G x ½" 0,5 mL U-100 insulinsprøyte med en permanent festet nål uten sikkerhet.
- Bedøve mus med ketamin og xylazine.
- Utføre injeksjon kirurgi.
- Forberede området for kirurgi. Plassere et sterilt drapere over heten pute og tom sterilt kirurgiske redskaper til det sterile drapere uten å berøre dem. Plukke opp musen og plassere den i synsfeltet. Justere belysning for å belyse området.
- Fjern tre 3.15% chlorhexidine gluconate og 70% isopropylalkohol hud antiseptiske vattpinner fra pakker og plasser i nærheten av dyret.
- Endre til sterilt kirurgiske hansker. Arbeider i en sirkelbevegelse begynnelse på snitt området, vattpinnen dyret med en ny chlorhexidine/alkoholholdige vattpinnen tre ganger.
- Finn området snitt som vist i figur 1A. Knipe huden med pinsett, bruk saks for å gjøre et kutt på huden lag ca 1 cm fra ryggraden og under brystkasse. Når kuttet nettstedet er ca 1 cm lang, gjøre en lignende kuttet nettsted nedenfor, i muskel laget.
Merk: Kontroller innsnitt riktig lengde tillate nyre knapt komme gjennom snittet og deretter holdes på plass av innsnitt selv. For lite et snitt og nyrene kan ikke eksponeres; for stor og nyre vil kontinuerlig gli tilbake i bukhulen. - Finn nyrene.
Merk: Det kan være synlig blant hvite fettvev. Milten er også plassert på venstre side av dyret. Fargen på disse organene kan være visuelt differensiert, milten er en mørk rødbrun mens nyre er en mørk rød-oransje. Det er ikke ønskelig å manipulere milten som det kan være lett utløst. - Uten å berøre nyre, forsiktig utsettes fra bukhulen sette jevn, milde press på bakkroppen med fingrene (figur 2C). Bruk lukket pinsett Skyv uønskede organer tilbake i magen om nødvendig. Bruk ikke åpne tang da dette kan skade nyrene eller andre organer.
- Når nyre er magen, forsiktig skille det fra omkringliggende fett akkurat nok til å visualisere nyresvikt pelvis, en liten hvit prikk (figur 1B). Presse overflødig fett til side eller fjerne hvis nødvendig. Pass på ikke å fjerne binyrene, nær toppen pole nyre eller nyre kapselen.
- Bruke lukket tang skyve på høyre side av nyre slik at nyresvikt bekkenet er i sikte, grip syringe lastet insulin med høyre hånd og hold den parallelt arbeidsgruppen overflaten med nålen pekte på nyresvikt bekkenet (figur 2E). Inn nålen nøye nyresvikt bekkenet av immobilisert nyre som vist i figur 1B.
- Injisere løsningen raskt innen tre s. Om lag en tredel av nyrene kan fjerne og endre fargen til hvite.
Merk: Det er vanlig å observere væske buildup i nyre kapsel følgende injeksjon i tillegg til dannelsen av en hematom. Enkelte skader er nødvendig for å oppnå et tilstrekkelig nivå av DNA transfection for gjenkjenning. - Holde nålen i stedet for ca 10 å hindre tilbakestrømning av løsningen. Deretter sakte og forsiktig fjerne nålen. Returnere organ til bukhulen forsiktig strekke webområdet snitt og bruker lukket tang.
- Sutur muskel laget av dyret med 5-0 absorberbare bildet, plassere 2-4 uavhengige knop.
- Sutur huden laget av dyret med 5-0 eller 6-0 ikke-absorberbare nylon sømmer, plassere 2-4 uavhengige knop.
Merk: Kirurgiske verktøy kan brukes etter plassering i et sterilt perle bad og avkjølt.
Figur 1. Riktig snitt området og nål plassering for etter nyresvikt bekkenet injeksjoner. A) i snitt (rød linje) skal ligger ca 1 cm fra ryggraden og ca 1 cm nedenfor brystkasse museklikk. B) etter nyre er utsatt via flanke innsnitt, skal nyresvikt bekkenet plasseres som en liten gulaktig klar/hvit prikk midtveis nede nyrene. Injeksjon skal ikke forstyrre den nyre blodåre, nyre arterien eller ureter. Nålen av insulin er settes direkte inn nyresvikt bekkenet som vist til en dybde på ca 0,5 cm og raskt deprimert i 2-3 s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. De kirurgiske skritt å utføre nyresvikt bekkenet etter injeksjon av plasmider DNA. A) tang klype i huden slik at kirurgen å gjøre en ~ 1 cm flanke snitt med en skalpell, først gjennom huden laget, deretter gjennom muskel laget. B) bruke to par stengt tang åpne kirurgisk såret, nyre er visualisert i magen hvis mulig. C) med milde press på magen, uten å berøre noen organer direkte, eksponeres nyre gjennom flanke innsnitt. D) fett er forsiktig dissekert fra nyrene forstyrre den som mulig å få en nedsatt bekkenet. E) å trykke på høyre side av venstre nyre bedre visualisere nyresvikt bekkenet, sprøyten holdes med tommelen på depressor og nålen er forsiktig men bestemt plassert i nyresvikt bekkenet. F) følgende på < 3 s injeksjon, fjerne kan observeres i områdene av nyre mottatt mesteparten av injeksjon. G) sterile lilla vicryl absorberbare suturer brukes til å lage 2-4 uavhengige knop i muskel laget. H) sterile blå nylon ikke-absorberbare sømmer brukes til å lage 2-4 uavhengige knop i huden laget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Utvinning fra kirurgi og postoperativ overvåking.
- Gi mus smertestillende i henhold til institusjonens IACUC behov for smerte kontroll. For eksempel administrere buprenorfin ved injeksjon hver 8-12 h 48 h post-operatively hvis NSAID-relaterte nyreskader skal unngås for studier.
- Hold mus ved varme pad og deltok etterforskeren til fullt mobile med sternal recumbency. Når fullt tilbake mus til en ren bur som inneholder en liten mengde sengetøy fra deres hjem buret for å redusere stress. Gjøre huset mus utsatt for kirurgi med naiv mus.
Merk: Tilstanden til mus vil forbedre raskt, vises har normalt innen 24-48 timer. - Gi saltholdig væske og økt analgesi til mus som vises stresset å forbedre tilstanden. Hvis mus ikke raskt gjenopprette, måle musen vekt og euthanize mus som har tapt mer enn 20% av sin opprinnelige kroppsvekt. Euthanize mus vises uremisk eller ellers døende. Mulig sunnhet problemer er beskrevet i tabell 1.
Merk: Mus noen ganger fjerne deres ytre suturer eller bildet løsnet før såret nedleggelse. Dårlig suturing av muskel laget med en intakt hud lag kan resultere i en brokk på webområdet snitt, angitt av svulmende. I slike tilfeller, plasserer musen under narkose (isoflurane er raskere enn ketamin/xylazine) og reparere kirurgiske området med nye suturer så snart som mulig. Hvis ikke-absorberbare huden suturer forblir etter 10-14 dager, fjernes. Noen ganger kan mus fjerne deres bur make suturer eller kjempe. Fjerne aggressoren mus til sitt eget bur med berikelse å hindre dem fra å skade andre musene så snart slik atferd er identifisert. - Når helse eller eksperimentelle endepunktene er nådd, euthanize musene karbondioksid innånding eller isoflurane overdose etterfulgt av en sekundær metode for euthanasia som cervical forvridning ifølge standarden Driftsmetoden for euthanasia på Plasser på institusjonen
| Årsak | Utbruddet | Antall mus berørt | Symptomer | Umiddelbar handling | Langsiktig løsning | ||
| DNA inneholdt endotoxins | 6-40 h etter injeksjon. | Vil påvirke hver mus gitt forurenset DNA utarbeidelse. | Pusteproblemer, tegn på store smerter, orgel svikt, død. | Euthanize berørte musene. Test hver injisert komponent for endotoxins med Limulus Amebocyte Lysate. | Bruk endotoxin-gratis maxiprep kits og bare sterile og nye eller NaOH behandlet labware. Bruk en kjøpt kommersielt, endotoxin-testet buffer for å fortynne DNA. | ||
| Anestesi overdose | Under kirurgi, enten før eller etter DNA injeksjon. | Kan påvirke bare yngre, mindre eller slankere musene. | Opphøre åndedrett på varmeputen, vannlating. | Redusere anestesi for gjenværende mus. | Dobbeltsjekk forberedelse og protokoll for dosering nøyaktighet. Utelate "runts." Rådføre seg veterinarian hvis passende dose ble brukt. | ||
| Luftboble i sprøyten eller nål brukes for injeksjon | Umiddelbart etter nyresvikt bekkenet injeksjon. | Med mindre alle sprøyter ble lastet uforsiktig, påvirker dette bare ett museklikk. | Gisper etter pusten. | Sjekk gjenværende sprøyter for underskriver av luftbobler. | Forberede sprøyter nøye, trykke sprøyten for å fjerne bobler nederst. Forbedre belysningen bedre visualisere bobler. | ||
| Åpningen av kirurgiske området | 12-72 h etter injeksjon | Én eller flere mus. Noen ganger det hel bur. | Gapende sår, vanligvis ingen annen nød | Gjenta suturing å reparere såret nøye under isoflurane anestesi med steril teknikk. Måtte vanne med saltvann eller fjerne såret kantlinjer med saks. | Hvis alle mus har svært kort eller manglende suturer, kan det hende ett museklikk fjerner dem, så mus kan skilles. Forbedre suturing teknikk. Bruk uavhengig knop. | ||
| Brokk på kirurgiske området | 48 + h etter injeksjon | Én eller flere mus. | Haugen er synlig på kirurgiske området. | Under isoflurane kuttet anestesi med steril teknikk, helbredet huden å avsløre brokk muskel lag. Erstatte organer i peritoneum, reparere muskulaturen laget med absorberbare suturer og lukker området. | Dette angir dårlig suturing av muskulaturen laget. Forbedre suturing teknikk. Bruk uavhengig knop. | ||
| Nyresvikt | 48 + h etter injeksjon | Én eller flere mus. | Vekttap på > 20%, muligens bli uremisk, bøyd holdning | Gi saltvann og øke eller forlenge analgesi. Hvis ingen forbedring er observert, ofre berørte musene. | Endre sykdom tilstanden til dyret å gjøre det mindre alvorlig. Endre transgene mindre sterk eller induserbart. Injisere mus på en tidligere timepoint i sykdomsprogresjon. | ||
| Abcess eller infeksjon | Dager til uker etter operasjonen | Én eller flere mus. | Håndgripelig abcess eller tegn av sepsis | Euthanize berørte musene. Be om obduksjon å bekrefte antatt infeksjon. | Dette kan skje når kirurgisk betingelsene og injeksjoner ikke er tilstrekkelig sterilt. Prosedyren for mus med et vanlig immunsystem men ytterligere forholdsregler må tas i innstillingen immunsupprimerte dyr som de behandlet med cyklofosfamid. | ||
Tabell 1. Tabell over potensielle helse problemene under nyresvikt bekkenet injeksjon protokollen. Selv om de nevnte helseproblemer ikke er vanlig, finnes det en rekke etterforsker-relaterte feil som kan oppstå i løpet av prosedyren. Denne tabellen kan være hjelp i forebygging og diagnose av helseproblemer og gjennomføringen av mulige tiltak for å hindre at slike problemer oppstår i fremtiden. Med praksis, bør etterforskere forvente sjeldne helseproblemer og dødelighet på grunn av prosedyren.
3. vurdere injeksjon effektivitet og transgene effekter
- Bruk en velutviklet analysen for den ønskede transgene for å vurdere hva effektiviteten. Bruke positive og negative kontroller nøye for å sørge for at analysen er bestemt.
Merk: Avhengig av alternativet som formidler, mus vil trolig ha sterkeste transgene uttrykket på dag 1; alltid innen den første uken etter injeksjon. - Utføre live dyr bildebehandling av luciferase ved å introdusere 10 µg av luciferase-uttrykke plasmider som forbedret firefly luciferase til utvannet DNA for injeksjon.
- Rengjør alle overflater utsatt for mus. Plass den første bur mus inn i kammeret og forsegle den stengt. Det er nok isoflurane for eksperimentet ved å sjekke gage; Dersom ikke, sammenlegge isoflurane inntil nivået når "maks" linjen. Starte strømmen av isoflurane ved å slå isoflurane ringe til 3.5 og oksygen til 2.
- Injisere hver musen ved intraperitoneal injeksjon med 100 µL av tinte 30 mg/mL luciferin. Fortegnelse tid.
- Åpne programvaren for å kontrollere tenkelig maskinen av klikker opp på appelsin og gul museikonet. Under "Velg/Add-bruker-ID", velge riktig initialene fra rullegardinmenyen ved siden av "Bruker-ID." Klikk "OK". På toppmenyen, klikk "Erverv" og velg "Automatisk lagring til..." fra det miste-ned menyen. Velg mappen eller Opprett en ny mappe for å lagre dataene.
- Gå til boksen bilde oppkjøpet i nedre høyre hjørne. Kontroller at innstillingen automatisk er som følger: Binning, medium; F/stopp, 1 for selvlysende, 8 for fotografi; Utslipp Filter, åpen. Imaging modus, kontrollerer Luminescent, fotografi, overlegg, og justeringen bare. Klikk "starte" for å starte systemet vente til initialiseringen er ferdig, og endre "Synsfelt" til "E" til bilde fem mus.
- Slå ventilen for anestesi rør slik at nosecones inni maskinen administrerer isoflurane. Sted dyrene inne tenkelig maskinen i ønsket rekkefølge på magen med ryggen mot kameraet over å visualisere nyrene. Hvis mer enn én bur skal avbildes, plassere neste byrået i isoflurane kammeret.
- 5-10 min etter luciferin injeksjon, trykk "Hent" å ta bildet.
- "Verktøyet paletten" på høyre side, klikk "Image Juster." Under "Fargeskala" redusere "Min" baren til uttrykk er tydelig i alle forventede mus, visualisert som lilla over hver mus nyre. Hvis noen mus ikke viser uttrykket, reinject mus med 100 µL av luciferin og vent minst 3 min før reacquiring.
- Hvis bildet har mettet piksler, redusere eksponeringstid og hente på nytt for å få en kvantitativ bilde som tilstedeværelse av mettet piksler fører undervurderer hva effektiviteten. Lavest mulig eksponeringstiden er 0,5 s.
- Hvis bildet viser bare svak genuttrykk på første eksponering, øke eksponeringstiden 2 min og hente på nytt. Hver gang bildet blir gjenerobret, er dataene automatisk lagret i den valgte mappen slik at alle bildene er tilgjengelige for videre analyse senere.
- Gjenta tenkelig trinnene for påfølgende burene mus.
- Fjern mus fra tenkelig maskinen. Slå av gassen. Rengjør kammer, nosecones, og tenkelig scenen. Lukk programmet.
Merk: Programvaren vil be om å "Lagre datasett." Dette refererer til manipulasjoner laget i datasettet, ikke selve dataene.- Klikk "Ja" for å lagre endringer i omfanget og områder av interesse (ROIs). Klikk "Nei" for å gå tilbake til de opprinnelige innstillingene for bildene.
- Åpne programvaren for dataanalyse. "Verktøyet paletten" Klikk "Avkastningen verktøy." Klikk sirkelikonet og klikk "1" i rullegardinmenyen til å plassere en ny avkastning i bildevinduet som angis med en rød ellipse med fire firkanter rundt den. Justere størrelsen på Avkastningen ved å plassere markøren over en rød firkant for å omslutte lilla området overliggende injisert nyrene.
- Markøren over en rød firkant på Avkastningen, høyreklikk og velg "Duplisere ROI" for å opprette en ny avkastning i bildevinduet og flytte det til neste musen. Gjenta prosedyren til alle mus i bildet har en avkastning over injisert nyrene.
- I menyen direkte over bildet endre "Enheter" fra "Teller" til "Radiance (fotoner)." Eksportere Avkastningen data, "Paletten for verktøyet", "ROI verktøy" Klikk på ikonet blyant/linjalen for å opprette et regneark av målinger. Bruk "Avg Radiance" måling i videre analyse i data analyse og statistikk program av valget.
- Utføre flekk av delene som beskrives11.
Merk: Injeksjon ikke transfect hele nyre like så seksjoner vil fange ulike transfection effektivitet11. Co injeksjon av perler som fluorescerende latex mikrosfærer kan bidra til å identifisere regionene ventet å bli transgene-positive (figur 3D)11. Optimalisering av fargeprotokoll er ekstremt viktig. - Utføre Western blot å identifisere genet av interesse i transfekterte nyrene.
Merk: Av organer for protein ekstrakter må gjøres på is. Igjen, ikke bruk en liten bit av orgelet som dette området ikke kan ha vært transfected godt. Hva er ujevnt fordelt i hele orgel så kombinere ulike områder og samle dem. Nyresvikt bekkenet etter injeksjon av en plasmider produsere hormon erytropoietin resulterte i en beskjeden økning i hematokrit, så det er forventet at utskilles transgene produkter skal finnes i sirkulasjon11. - For langsiktige høyt nivå uttrykk for effekter av transgener, Kombiner en integrere vektor-system med suppressive stoffer som cyklofosfamid. Immunforsvaret til av transgene skjer over først flere uker etter injeksjon og robust11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgi og injeksjon teknikken er enkelt å utføre en gang mestret, krever ingen hovedutstyr eller dyre materialer. Hvis ny å flanke-snitt nyre surgery, skal en treningsdag på flere mus planlagt euthanasia tillates der mus ikke er gjenopprettet etter kirurgi fordi det første forsøket på denne operasjonen kan ta mye lengre tid enn normalt. Alternativt, etterforskere kjent med lignende teknikker kan finne det ganske enkelt. Nøye følge eksemplet i figur 1 og malerisk instruksjonene i figur 2. Til riktig sted i snitt, kan kirurgen bruke fingrene til å presse på musen er mage mens den legger på siden. Nyre er visualisert ved en liten klump som stiger nær bokryggen med lett abdominal press, og i snitt bør gjøres over dette området (figur 1 og figur 2). Det er viktig å gjøre i snitt gjennom hud og muskel lagene riktig størrelse (figur 1). Hvis snittet er for stor, vil nyre gli tilbake i bukhulen lett, gjør injeksjon vanskelig. Hvis snittet er for lite, vil det være vanskelig å presse nyre av bukhulen og organskade kan oppstå. Et annet viktig poeng er plasseringen av nålen i nyresvikt bekkenet. Kirurgen bør presse nyre ned med stengt tang, deretter inn nålen nyresvikt pelvis i en vinkel parallelt arbeidsgruppen overflaten slik at de fleste av injeksjon går direkte inn i nyre parenchyma (figur 2). Det er viktig at injeksjon utføres så raskt som mulig å indusere etter trykket kreves for nyre transfection.
Mus i ulike stammer, alder, vekt eller sex har forskjeller i plasseringen av nyrene og mengden fett rundt nyrene så justeringer kan være nødvendig å arbeide med musene rundt. Hvis mulig, bør første kirurgisk forsøk som mus, gjenopprettes inneholde en umiddelbar avlesning av nyre-spesifikke genuttrykk, som luciferase imaging (figur 3A). Hvis unge mus brukes, er det forventede resultatet at alle mus har en utstråling som er innenfor en størrelsesorden (figur 3B). Noen ganger, selv etter en andre injeksjon av luciferin er det tydelig av imaging at mus eller mus ikke kan bli transfekterte på et nivå som er sammenlignbare med andre eller at noen injisert mus er selv helt mangler i genuttrykk. Slike mus kan ekskluderes fra studien på grunn av mislykkede transgene levering. Hvis mange av musene mangler genuttrykk, bør deretter kirurgen redusere tiden for injeksjon av DNA løsningen. Indusere nødvendig skaden gjennom høytrykk av injeksjon er den mest sannsynlige skyldige for konsekvent mangel av genuttrykk. Mus skal nøye overvåket etter kirurgi for potensielle helseproblemer (se tabell 1 for potensielle helsemessige problemer med tilhørende løsninger og kontakt med institusjonens veterinary lag etter behov). Etter en første treningsperiode, bør operasjonen selv ta mindre enn ti minutter. Kirurgisk perioden bør gjøres så kort som mulig ved å operere på en mus for å hindre uttørking av vev under operasjonen. Mesteparten av tiden investeringen i denne fremgangsmåten er induksjon av og utvinning fra ketamin/xylazine bedøvende. To erfarne personell jobbe som team bør forvente å utføre opptil ti surgeries per dag, med femten en rimelig anstrengelse.
Forskere bør forvente et lavt antall celler stain svært positivt for transgene innen få dager etter injeksjon. Disse positive cellene vil være lokalisert i flekker omkringliggende områder der injeksjon væsken infiltrert nyrene (Figur 3 c-D). Noen deler av nyre blir helt negativ for transfekterte celler. Slike negative områder vil også være mangler erytrocytter og har helt normal histology siden injeksjon ikke kom frem til disse områdene. Farging protokoller og arrangører bør optimeres nøye for å fange genuttrykk. Etterforskerne bør forvente at cellen typer transfekterte vil være variabel, gene expression nivåer i den lave andelen av celler transfekterte er høy og lokalisering av proteiner i cellene kanskje ikke som forventet på grunn av høye uttrykk (figur 3D).
Figur 3. Etter nyresvikt bekkenet injeksjon resulterer i nyre-spesifikke genuttrykk luciferase og TdTomato. (A) FVB 7-8 uke gammel mannlig mus fikk etter nyresvikt bekkenet injeksjoner av 20 µg av pTEeL, en plasmider uttrykke forbedret firefly luciferase fra EF-1α Promotøren. Mus 2, 3 og 5 var også injisert med 20 µg av fluorescerende reporter plasmider. (B) dot handlingen i den utstråling fra mus vises i (A). (C og D) Mus fikk enten etter levering buffer alene (C) eller (D) fluorescerende mikrosfærer (lyse grønne prikker) og pEF1α-TdTomato uttrykke røde lysrør reporteren TdTomato fra EF-1α Promotøren. Proksimale tubuli var farget av Lotus tetragonolobus agglutinin (LTA, grønn) og transfekterte celler vises etter farging med anti-RFP antistoff å forsterke TdTomato signalet (rød). Kjerner er farget av DAPI (blå). Bildene som vises i (C) og (D) er 13,2 mm x 17,5 mm. feilfelt representerer standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En robust metode for å oppnå reproduserbar genuttrykk spesielt i nyret er beskrevet i denne protokollen. Vi har funnet prosentandelen av mus transfekterte av denne teknikken til å være i størrelsesorden 50-100%, avhengig av musen alder og følsomheten til presentasjon av transgene i hendene på en middels erfaren kirurg. Luciferase genuttrykk var bakgrunnen for månedene i mus mottar piggyBac transposons og opprettholdt helt i flere uker i immunsupprimerte mus mottar de samme transposons11. Mens mange celler farget lys for transgene i områder nær injeksjonsstedet, hva virkningsgraden var relativt lav (figur 3D). Det viktigste materialet for å oppnå ønsket resultat er injeksjon sprøyten selv. Dette må være en 29G x ½" insulinsprøyte med en vedlagt p og ingen sikkerhet å hindre injeksjon. Injeksjon må være rask, innen tre s. Plasmider DNA preparatet bør være rene, med svært lav endotoxin og bakteriell genomisk DNA nivåer19.
Det er tenkelig at injeksjoner av andre stoffer, som RNA, virus eller protein, kan gjøres på en lignende måte. Nyresvikt bekkenet var overlegen som en rute med oppføringen til andre injeksjon nettsteder testet, for eksempel nyre blodåre eller direkte injeksjon av nyre parenchyma. Disse injeksjoner førte til blødning og lavere gene expression11. Nyresvikt bekkenet er en elastisk struktur noen ganger nødvendig å holde urin tilbakestrømming, kan det være bedre kunne strekke og imøtekomme nålen. Lekkasje av DNA løsning eller urin fra hullet opprettet av insulin sprøyten er ikke observert, antyder at nyresvikt bekkenet er reparert raskt. Den eksakte mekanismen som injisert væsken transfects nyre har ikke blitt studert grundig som det har for leveren, for eksempel. Fremtidige elektronmikroskop studier kan belyse denne mekanismen ytterligere. Retrograd natur injeksjon prioriteres etter halen blodåre injeksjon metoden reverserer strømmen av hepatic blodåre20 og andre vellykkede metoder for nyre transfection har injisert via den nyre blodåre12, 13 , 14 , 21. nyreskader er trolig nødvendig for optimal transfection effektivitet så vi hypothesize at hva skjer via skade til cellemembranen forårsaket av rask, stort volum injeksjon. Podocytes tubuli og samle kanaler alle har direkte grensesnitt med urin plass som sin viktigste funksjon er å filtrere og konsentrere urinen.
Selv om reproduserbare og nyre-spesifikke, er denne metoden begrenset av relativt lav transfection effektiviteten observert (figur 3D). Etter nyresvikt bekkenet injeksjon er ikke en erstatning for oppretting av transgene dyr kjøring av transgene fra en nyre-spesifikke promoter, der hver celle i en bestemt undertype i dyret ville uttrykke genet av interesse. Snarere denne metoden er best tilpasset til genet overføring tilnærminger for sykdommer som et lite antall korrigerte celler ville ha en dramatisk effekt på fenotypen, for utskillelse av hormoner eller andre stoffer som normalt produsert av nyre eller oppretting av en befolkningen i sjeldne celler som vil ha noen positiv effekt på nyrene å reparere eller generere den på nytt. Alternativt, det kan også brukes i motsatt vei å utvikle en ny modell av nyre skader ved å innføre en transgene med en negativ innflytelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke å avsløre og erklære noen interessekonflikt.
Acknowledgments
En karriere Development Award fra Institutt for Veteraner saker [BX002797] støttede L.E.W. og National Institutes of Health [R01-DK095867] og American Heart Association [15GRNT25700209] støttet JC National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] og Vanderbilt Center for nyresykdom støttet M.H.W. Dette materialet er resultatet av arbeidet støttes og bruk av VA Tennessee Valley Healthcare system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic - Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia - Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads - 15" x 21" - need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic - Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).
- Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues. PLoS One. 11 (1), e0148233 (2016).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).
- Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver. Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).
- Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs. Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).
- Alino, S. F., et al. Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization. J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), (2013).
- Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904 (2017).
- Liang, A., et al. Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis. Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).
- Liang, M., et al. Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).
- Corridon, P. R., et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).
- Wallace, D. P., et al. Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging. Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).
- Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
- Yeikilis, R., et al. Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats. World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).
- Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. (41), (2010).
- Wooddell, C. I., et al. Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent. Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).
- Crespo, A., et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
