Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56846
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of General Surgery, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 3Hongqiao International Institute of Medicine, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Summary

פרוטוקול כאן מתאר את האינטראקציות של מטוהרים hEAG1 יון ערוץ חלבון עם מולקולה קטנה השומנים ליגנד phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2). המדידה מדגים כי מתה על יכול להיות שיטה אפשרית להקרנה ליגנד ערוץ הרומן יון מולקולה קטנה.

Abstract

וזמינותו אינטרפרומטריה (בלי) ביו-שכבה הוא כלי רב ערך למדידת חלבון ואינטראקציות מולקולת חלבון-קטן. כאן, נתאר תחילה את היישום של טכניקה זו ללא תווית הרומן ' את האינטראקציה של האדם EAG1 (hEAG1) חלבונים ערוץ עם פיפ מולקולה קטנה2. hEAG1 ערוץ הוכר מטרה טיפולית פוטנציאל בגלל שלה ביטוי aberrant סרטן, מוטציות רווח-של-פונקציה מספר מעורבים בסוגים מסוימים של מחלות נוירולוגיות. אנו מטוהר hEAG1 חלבונים ערוץ ממערכת בתרבית של הביטוי יציב, מדדו את האינטראקציה עם פיפ2 מאת רבנות בלי. מדידת מוצלחת קינטיקה של האיגוד בין חלבון hEAG1 ו- PIP2 מדגים כי וזמינותו רבנות בלי היא גישה תפוקה גבוהה פוטנציאליות בשימוש להקרנה ליגנד מולקולה קטנה הרומן בפרמקולוגיה ערוץ יון.

Introduction

פילוח החלבונים ערוץ יון הנגיש על-פני התא עם מולקולות קטנות מציע פוטנציאל עצום ליגנד ההקרנה של תרופות ביולוגיות גילוי1,2,3. לפיכך, מתאימה לכלי יש צורך ללמוד את האינטראקציה בין תעלת יונים, מולקולות קטנות, תפקידם המתאימים. ההקלטה תיקון-קלאמפ הוכח להיות טכניקה ייחודית ובלתי ניתנים להחלפה ביון ערוץ assay פונקציונלי. עם זאת, קביעה אם מולקולות קטנות ישירות למטרה תעלות יונים לדרוש טכנולוגיות אחרות. באופן מסורתי, וזמינותו מחייבת ליגנד רדיואקטיבי שימש כדי לבחון את קינטיקה של האיגוד בין מולקולה קטנה שלה חלבון ערוץ יון היעד. עם זאת, השימוש בטכניקה זו הוא מוגבל בשל דרישה שלה ב תיוג רדיואקטיבי וזיהוי. יתר על כן, השלב מוקדם לה תווית של ליגנד קטן במחקר מונע שלה באמצעות בסוגים רבים של תעלות יונים ללא ידוע ליגנד מסוים. כמה טכניקות ללא תווית כגון NMR ספקטרוסקופיה, קרני רנטגן, microscale thermophoresis (MST)4 , משטח פלזמון תהודה (SPR) שימשו כדי למדוד את האינטראקציות מולקולת חלבון-קטן. אבל אלו סוגים של מבחני בד כ אינו יכול לספק מידע מספיק בגלל הקושי להשיג את החלבון באורך מלא, ברזולוציה נמוכה של dynamics, תפוקה נמוכה, עלות גבוהה5. לעומת שיטות אלה, ביו-שכבה אינטרפרומטריה (רבנות בלי) מתגלה כקבוצה מתודולוגיה הרומן ללא תווית להתגבר על החסרונות האלה לגילוי אינטראקציות חלבון-קטן מולקולה על ידי שיתק של כמויות זעירות של חלבון מדגם של משטחי ביוסנסור ומדידת השינויים אופטי אותות6,7. כפלטפורמה ביוסנסור מבטיח, מתה על הטכניקה מתבצעת כבר כדי לבחון את האינטראקציה של מולקולות קטנות עם מים טבעיים חלבונים מסיסים כגון נוגדן חד שבטי האדם CR80208 , ההליך assay מפורט ודווח ב במאמר הקודם9. למרות התפקיד של יון חלבון ערוץ עבור גילוי מטרות טיפולית חדש זוהה, יש יון ערוץ מולקולת חלבון-קטן אינטראקציה וזמינותו בהתבסס על רבנות בלי לא תוארו.

האדם ערוצי א' אתר גו-גו (hEAG1) באים לידי ביטוי בסוגים שונים של תאים סרטניים, מערכת העצבים המרכזית, מה שהופך את ערוץ פוטנציאל טיפולי היעד של רבים סרטן, הפרעות עצביים10,11, 12,13,14. המחקר אלקטרופיזיולוגיות במעבדה שלנו אישרה את ההשפעה המעכבת של phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2) ערוץ hEAG115. בהתבסס על התוצאות שלנו, בדיקות פיפ2 ישירות אינטראקציה עם hEAG1 על-ידי שימוש בטכניקה רבנות בלי יכול להיות כמודל עבור סוגים אחרים של יון ערוץ מולקולת חלבון-קטן אינטראקציה מורכבת במיוחד עבור ערוצים אלה חסר ליגנדים ספציפיים. בהתאם להנחיות של רבנות בלי assay, אנו מוכנים biotinylated hEAG1 חלבונים, ותשמרו אותם על פני השטח של streptavidin (SA) טיפים ביוסנסור ואחריו אינטראקציה עם אותם לפתרונות2 פיפס להתבונן שלהם קישור ישיר בין חלבון, את השומנים. לאחר מגדילה הקובץ המצורף של פיפ2 משטח מצופה hEAG1 חלבון, עובי השכבה על פני השטח, אשר ישירות מופיע משמרת רפאים, ולא ניתן למדוד בזמן אמת16. קינטיקה האיגוד יכול להיקבע בשל תפנית חיובית בשלב ההתאגדות ואת משמרת שלילית בשלב דיסוציאציה. לפי עיקרון זה, אנחנו מטוהרת החלבון ערוץ יון hEAG1 תפקודית ממערכת ביטוי יציב HEK-239T על-ידי בשיטת טיהור זיקה לשמור במבחנה למצב התפקודי, ואז למדוד את קינטיקה של איגוד של ריכוז שונים פיפ2, הניבו נתונים קינטי semblable כפי שנצפתה מדידות אלקטרופיזיולוגיות15. ההתכתבות קרוב בין תוצאות רבנות בלי מדידות אלקטרופיזיולוגיות להדגים בפעם הראשונה ההתאמה של רבנות בלי ככלי אנליטי המתאים לאינטראקציה יון ערוץ ממברנה מולקולת חלבון-קטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: שורת התאים HEK-293T ללא הרף ביטוי מתויג דגל hEAG1 ערוץ חלבון נבנה על ידי transfecting pCDH lentiviral פלסמיד המכיל רצף הדנ א של hEAG1 עם דגל-קרבוקסילי דיסטלי לתאים HEK-293T ואחריו הבחירה עמידים puromycin תיאר כאמור15.

1. זיקה טיהור של חלבון hEAG1 ערוץ מתויג דגל מתאי HEK-293T

  1. הפשרת תאים stably לבטא hEAG1 ערוצים מכל חנקן נוזלי לתוך המים החמים (37 מעלות צלזיוס) במהירות. זרע התאים (בערך 5 x 106 קפוא תאים) בקערה 10 ס מ. לגדול התא לילה ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) בינוני בתוספת 8 מ ל 10% עוברית שור סרום (FBS), 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/mL 100, 4 מ מגלוטמין ושינה המדיום למחרת.
  2. לבדוק את ה-GFP זריחה של תאים אלה HEK-293T באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא האחוז הגבוה של תאים stably אקספרס hEAG1 הערוצים למערכת culturing. אקספוננציאלית trypsinize התאים גדל עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, thenadd 2 מ"ל של סרום המכיל נוזל תרבות לסיים את העיכול. העברת μL 400 של השעיה תא צלחת 15 ס מ המכיל 15 מ"ל של מדיום DMEM מלאה. הכינו ארבע המנות 15 ס מ סך הכל.
  3. קציר תאים אלה לאחר 2-3 ימים התרבות התאים מגיעות כ- 90% confluency.
    1. הסר את מדיום הגידול של התאים ולשטוף אותם פעמיים עם 4 מ"ל של פוספט buffered מלוחים (1 x PBS, pH = 7.4).
    2. להתעלם PBS לאחר הרחצה.
    3. לגרד את התאים לתוך 2 מ"ל PBS 1 x עבור כל מנה באמצעות תא פרק של העברת תאי שרוטים עם 1 מ"ל פיפטה לתוך צינור 15 מ"ל.
    4. Centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב 420 g x-4 מעלות צלזיוס.
    5. Decant ולמחוק את תגובת שיקוע.
    6. Resuspend בגדר תא ב הכולל 4 מ"ל של פירוק מאגר (10 מ מ HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 מ מ NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, מעכבי פרוטאז המלא הכיל) במשך 30 דקות על קרח, ו מערבולת ביסודיות lysate כל 10 דקות.
    7. Centrifuge תא lysate 10 דקות ב g x 12,000-4 מעלות צלזיוס.
    8. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת 5 מ ל ולשמור אותו בקרח לשימוש מיידי.
  4. הכנת אנטי-דגל M2 זיקה שרף.
    1. ביסודיות להשעות את השרף (שסופקו כמו השעיה 50% במאגר החנות) על-ידי היפוך עדין כדי לוודא שהבקבוק של אנטי-דגל M2 זיקה ג'ל הוא השעיה אחיד של חרוזי ג'ל.
    2. מיד העברה μL 400 של השעיה צינור mL 1.5 צוננת.
    3. Centrifuge התליה עבור 30 s-8, 000 x g ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע בקפידה כדי לשטוף את המאגר החנות.
    4. להוסיף 500 μL 1 x PBS שרף, להשעות את גלולה עם פיפטה 1 מ"ל. ואז centrifuge את המתלים עבור 30 s-8, 000 x g ב 4 ° C וזורקים את PBS supernatant בזהירות. חזור על אלה שטיפת צעד כדי לנקות את המאגר השמור.
  5. להוסיף 500 μL חלבון תמצית תגובת שיקוע מוכן בשלב 1.3.8 כדי בגדר שרף להשעות את צניפה ולהעביר את המתלים ל צינור מ ל צוננת. חזור על שלב זה שוב כדי לוודא אין חרוזי ג'ל שמאלה. להוסיף את תמצית חלבון השמאלי התערובת.
  6. דגירה את התערובת למשך הלילה על מטרף-סל ד 8-4 ° C כדי ללכוד את חלבון כימרי דגל.
  7. Centrifuge את התערובת לאחר 12 שעות הדגירה במשך 10 דקות ב- 1, 000 x ג'י ב- 4 מעלות צלזיוס.
  8. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר שלוש פעמים עם 500 μL ל- 1 x PBS. . לשמור את זה על הקרח לשימוש מיידי.
  9. • תנאי hEAG1 הדגל חלבונים עם 3 x דגל פפטיד.
    1. להכין פתרון • תנאי דגל X 3. להמיס פפטיד 3 X דגל בפתרון מניות μL 500 (0.5 מ' טריס-HCl, 1 M NaCl, pH = 7.5)-ריכוז של 8 μg/μL.
    2. להוסיף 10 μL 3 x דגל • תנאי פתרון μL 390 ל- PBS כפתרון הריכוז הסופי 200 ng/μL.
    3. להוסיף μL 400 בפתרון • תנאי דגל x 3 חרוזים ג'ל מוכן בשלב 1.8.
    4. דגירה המדגם-ניעור ב 8 rpm עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס.
    5. Centrifuge השרף ב-30 s-8, 000 x g.
    6. להעביר את תגובת שיקוע צינור mL 1.5 טריים ואחסן אותו ב 4 ° C לשימוש מיידי.

2. ריכוז Assay ופיוז'ן אישור של דגל מטוהר hEAG1 על ידי BCA חלבון Assay ערכת המערבי סופג

  1. לקבוע את הריכוז של חלבון מטוהרים באמצעות ערכת assay חלבון BCA לפי ההוראה של הייצור.
  2. השתמש 30 מדגם μL עבור ניתוח המערבי כדי לאשר שהחלבון עניין היה מטוהר באמצעות נוגדן אנטי-דגל כמו שתואר לעיל15.

3. תיוג את החלבון ערוץ מטוהרים עם ביוטין עבור וזמינותו רבנות בלי

  1. להכין 5 מ"ג/מ"ל ביוטין פתרון מניות ב- PBS. עבור כל בדיקה (שני ביולוגיים), להוסיף את עודף טוחנת 3-fold של ביוטין חלבון 20 μg מטוהרים להשיג biotinylation N-מסוף עדיפה של החלבון מטוהרים ב- PBS.
  2. דגירה המדגם בחושך על קרח במשך לפחות 30 דקות.
  3. הכנת המאגר דילול (SD) לדוגמה: PBS עם 0.02% polysorbate 20 ו- 0.1% שור אלבומין (BSA, pH 7.4).
  4. לבצע אולטראפילטרציה לשנות את המאגר של החלבון ערוץ מטוהרים למאגר SD. להסיר את ביוטין לא מאוגד על-ידי שימוש בהתקן אולטראפילטרציה עם הפסקת משקל מולקולרי של 30 kDa, הוספת המאגר SD ו צריך שתוציאו את הדגימה-12,000 x g, 10 דקות ב 4 º C.
  5. להסיר את ultrafiltrate מהצינור צנטריפוגה של התקן אולטראפילטרציה, להוסיף 200 מאגר SD μL לתוך המכשיר מסנן, צריך שתוציאו את הדגימה ב g x 12,000, 10 דקות ב 4 º C. חזור על פעולה זו לפחות שלוש פעמים.
  6. כדי לאסוף את המאגר החליפו לדוגמה, הפוך הכנס את ההתקן מסנן לתוך צינור 1.5 mL צריך שתוציאו אותם ב- g 2,000 x, עבור 5 דקות ב 4 º C. שמור את הדגימה על הקרח לשימוש מיידי.

4. הכנה של פיפ2 פתרון Assay

  1. הכן את הפתרון מניות של פיפ2 (1 מ מ) יונים H2O על ידי sonicating במשך 30 דקות על קרח כפי שתואר לעיל17. לאחסן את הפתרון צלוחיות זכוכית ב-20 ° C, למהול אותו ריכוזי הסופי מיד לפני ניסויים על-ידי vortexing נמרצת.

5. מתה על Assay

  1. להפעיל את הציוד, לבדוק את החלון "מצב כלי" כדי לאשר שהמכונה הוא במצב "מוכן" כדי prewarm את הציוד לפחות למשך 30 דקות לפני המחקר רבנות בלי.
  2. תוודא שהדלת של המכשיר סגורה לפני פתיחת התוכנה רכישת נתונים ובחר "חדש קינטיקה הניסוי" אשף הניסוי.
  3. הגדר את הבארות כדי לשמש בצלחת 96-ובכן על ידי קליק ימני כדי לבחור מאגר העומס, לדוגמה. לדוגמה-וולס, היחידה של ריכוז biotinylated דגל חלבון כימרי hEAG1 צריך להיות קלט כמו טוחנת (10 μg, 0.09 μM).
  4. הגדר את השלבים assay כולל בסיסית, טעינה, דיסוציאציה וארגון. בחר שלב assay, לחץ פעמיים על העמודה המתאימה. עותק של הגדרת assay מוגדר עבור פקד חיישנים. הגדר את סל ד 1,000. לבחור 1 דקות עבור שלב בסיסי של 5 – 10 דקות טעינה, שיוך של דיסוציאציה, בהתאמה. לבצע את הבדיקה בטמפרטורת החדר (בערך 24 מעלות צלזיוס).
    הערה: ישנם שני הליכים הראשי: assaying את האינטראקציה עם תרכובות מולקולה קטנה וטעינה החלבון ערוץ biotinylated את החיישנים. הם יכולים להיות המשיך ברציפות (בסיסית, וטעינה, בסיסית, שיוך של דיסוציאציה). לחלופין, הם יכולים להיות המשיך בנפרד כדי שתימנעו מלבזבז את תרכובות הבדיקה כאשר ההעמסה הראשון חלק לא מוצלח.
  5. לחץ על העמודות אשר מכילים את החיישנים ולחץ על "מילוי" כדי לציין את מיקומם של חיישנים במגש חיישן.
  6. סקור כל המתוכנן צעדים כדי לבדוק טעויות וכדי לחזור לתקנם.
  7. להגדיר את המיקום של קבצי נתונים ולחץ על "לך" להתחיל וזמינותו.
    הערה: החיישנים צריכים prewetted לפחות 10 דקות במאגר SD, אם צעד זה נעשה, אז צריך ניתן לדלג את ההגדרה "ניסוי התחלה מושהית". אם לא, לקבוע השהיה s 600 לפני prewetting את החיישנים.
  8. לשים צלחת 96-ובכן השחור בתחתית המגש והכנס את הפינה A1 של הצלחת לתוך החריץ על המגש להושיב את הצלחת. בשביל הבארות לטעון את החיישנים, 200 μL assay מאגר לכל טוב להוסיף לתוך בארות 2 בשורה A ו- 2 וולס בשורה B של צלחת 96-ובכן.
  9. להכין עוד צלחת 96-ובכן שחור כמו הצלחת לדוגמה ולמלא הבארות באמצעות מאגר SD μL 200 בשורה B כפתרון שליטה או biotinylated hEAG1 חלבון (10 μg) בשורה A כפי שהוקצו במהלך תכנות בשלב 5.3.
    הערה: להימנע היכרות עם בועות.
  10. פתח את הדלת של המכשיר הכנס את המגש חיישן, לטעום את הצלחת לתוך בעל לוחית ימינה ושמאלה, בהתאמה. בדוק הצלחת מגש על מדגם של חיישן ממוקמות כהלכה המבוססת על הצורה של לוחית שמאל ו- the marker "A1" בפינה הימנית העליונה של לוחית נכון. . סגור את הדלת ולהתחיל וזמינותו.

6. ניתוח נתונים

  1. פתח את תוכנת ניתוח נתונים וטען את התיקייה המכילה את הנתונים וזמינותו. לחץ על "עיבוד" להיכנס לממשק תפריט עיבוד, אנו יכולים לראות. את עקומות קינטי raw צבעוני.
  2. תחת שלב 1: 'בחירת הנתונים', לחץ על "חיישן בחירה". על "חיישן מגש #1", לחץ על הבארות חיישן בלבד שנרטבו עם מאגר SD, קליק ימני על "שינוי סוג חיישן" "הפניה חיישן". על ' מפה צלחת לדוגמה ", לייעד את כל איגוד שאינם ספציפיים הבארות, לחץ לחיצה ימנית כדי"שינוי טוב סוג"כדי"הפניה טוב".
  3. סמן בתיבת לפני "חיסור" של שלב 2 והצבע "הפניה כפולה".
  4. בשלב3: "ליישר ציר Y", בחר "בסיסית" כשלב יישור. עבור "טווח הזמן", הזן 10 האחרונים s של הבסיס הזה (קרי מ: 0.1: 59.8).
  5. בשלב4: הבין-"שלב תיקון", בחר "יישר בסיסית" כדי למזער את האות משמרות בין השלבים דיסוציאציה וארגון.
  6. שלב5: "תהליך", בחר פונקציית סינון Savitzky-Golay ברוב המקרים והמשך "תהליך נתונים".
  7. שמירת נתונים גולמיים עבור ניתוח נתונים נוסף באמצעות תוכנות אחרות בשלב 7: "שמירת תוצאות".
  8. לחץ על "ניתוח | פריסטלטיות".
    1. "צעד כדי לנתח", בחרו "האגודה | דיסוציאציה". "מודל", בחר 1:1.
      הערה: אנו בוחרים דגם 1:1 כי הוא מצויד היטב על הנתונים המקורי שלנו, למנוע את האפשרות של מעל הולם תחת 1:2 או 2:1 מודל בשל החופש שלהם גבוהה. אך אפשרויות אחרות זמינים כאן ניתן לבחור כראוי לניתוח השני מתאים לדגמי קישור שונים של analyte.
    2. "התאמה", בחר עולמי (מלא). עבור "קבץ לפי", בחר "צבע". בחר "Rmax אינם מקושרים על ידי חיישן" כדי לאפשר התאמה עצמאית של התגובה האות מקסימלי (Rmax).
    3. לחץ על "התאם עקומות!" כדי להתחיל את ניתוח רגרסיה לא ליניארית. משוואת היל אקספוננט יחיד שימשו במחקר שלנו.
    4. לחץ על ' ייצוא נתונים | שמירת דוח"להציל את התאמת תוצאות. או לחץ על ' ייצוא נתונים | ייצוא תוצאות המדידה"כדי לשמור את הנתונים הגולמיים עבור יצירת גרפים נוספים וניתוח נתונים עם תוכנות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו טהור החלבון ערוץ דגל hEAG1 פיוז'ן מן hEAG1 stably overexpressed תאים HEK-293T. הפונקציה של חלבון כימרי זה הוכח באמצעות פעולת תיקון-קלאמפ, איכות וספציפיות של חלבון מטוהרים מאושרות על-ידי תספיג חלבון (איור 1). החלבון ערוץ מטוהרים היא biotinylated כדי לבצע וזמינותו של אינטראקציה עם ליפידים (פיפ2) באמצעות וזמינותו רבנות בלי בזמן אמת. מתה על איגוד וזמינותו התצורה מוצג באיור2. עיקול איגוד טיפוסי בין hEAG1 ו- PIP2 מוצג באיור3. במקרה זה, μM 3 פיפס2 הוא מומס מאגר PBS (תצורת של פיפ2 מוצג משלים באיור1), ואת האות היא נותחה באמצעות פרוטוקול חיסור הפניה כפולה כדי לחסר את האיגוד לא ספציפית ( מחייב בין חיישן פיפ2,) רקע (את האינטראקציה בין חלבון hEAG1 biotinylated PBS), אות סחיפה (האיגוד בין חיישן PBS) הנגרמת על ידי חיישן השתנות. וה -המעקב אחר של האיגוד ברחבי העולם להתאים שמוצג כיסוי היטב הולם (משלים איור 2). בנוסף, אנו מודדים את קינטיקה של איגוד של פיפ2 לערוץ hEAG1 מטוהרים מורכבים מאת המקננת החלבונים בריכוזים שונים של פיפ2. אחרי ניתוח, אנחנו מקבלים ערך (דK) קבוע דיסוציאציה של 0.35 ±0.04 μM, אשר דומה לערך50 IC המתקבל מדידות אלקטרופיזיולוגיות ה-15. תוצאות אלו הפגינו וזמינותו רבנות בלי מתאים לניתוח יון ערוץ קרום חלבונים ושומנים אינטראקציה.

Figure 1
איור 1: זיהוי של הביטוי, פונקציה, יחודיות של חלבון רקומביננטי hEAG1 מתאי HEK-293T על-ידי הדמיה GFP, תיקון קלאמפ, תספיג, בהתאמה. (א) מערכת HEK-293T hEAG1 ביטוי יציב בהצלחה נוסדה על-ידי בחירה puromycin עמידים monoclonal לאחר תרביות תאים במערכת lentivirus hEAG1-pCDH כפי שמעידים GFP ביטוי כמעט כל התאים. הדופק (B) פרוטוקול (למעלה) ואת נקודות המגע המוצגים עקבות הנוכחי של נציג תאים כל תיקון-מלחציים הקלטה מערוצים hEAG1 בתא יציב בא הנוכחי הוא שהפיק depolarizing המתחים מן המתח החזקה של-80 mV ל-70 mV עם השלב של 10 mV ואחריו רה-פולריזציה ל-80 mV. התאים מודגרת בערוץ K+ נורמלי הקלטה פתרונות כפי שתואר לעיל15. הזרמים אשלגן החוצה תלויי-מתח מציעים ערוצי hEAG1 פונקציונלי מאוד מבוטאים בתאים HEK293T. (ג) תספיג חלבון ערוץ hEAG1 מדגימות חלבון מטוהרים. נוגדן אנטי-דגל מזהה להקת חלבון יחיד kDa ~ 110, הוכחת באורך מלא מתויג דגל hEAG1 ערוץ ביטוי. זו דמות 1C שונתה של האן. et al. 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תרשים סכימטי מציג פרוטוקול מתה על איגוד וזמינותו. ארבעה חיישני משמשים במקביל biotinylated-ערוץ חלבונים או מאגר SD מומס שלהם כדי לטעון את החלבונים ערוץ והפניות. לאחר מכן, חיישנים ארבע אלה מועברים assay שלב כדי לזהות את העמותה ואת השיוך עם פוספוליפידים או המאגר הפתרון שלו. העמדות של ערוץ חלבונים, פוספוליפידים, מאגר נצבעים כמצוין. קו מקווקו אופקי אדום מציין שני השלבים העיקריים של רבנות בלי מחקר: טעינת שלב ושלב assay אינטראקציה. זה איור 2 שונתה של האן. et al. 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: לכידות מסך מציג את הנתונים הגולמיים והנתונים מעובדים במחקר רבנות בלי טיפוסי. (א) טיפוסי וטעינה של equilibration ' עקומות ' מציג את השלב equilibration (60 s) עם SD-מאגר (בסיסית), שלב ההעמסה עם חלבונים hEAG1 (טעינת), העקומה הפניה equilibrated, נטען עם חלבונים hEAG1 (loading), בו זמנית מדידה של שתי עצות חיישן בודדים. (B) הקווים האדומים אנכי מציינים את העברת של חיישנים הפתרון השומנים בופר במבצע וזמינותו. (ג) המקורי אופטי אותות-שלבים דיסוציאציה וארגון לאחר עיבוד חיסור הפניה כפולה כדי לחסר את האותות מחייב שאינם ספציפיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נובעת assay רבנות בלי מראה hEAG1 ערוץ חלבון אינטראקציה ישירות עם פיפ2. לכידת מסך (A) מציג את הנתונים הגולמיים של hEAG1 חלבון מחייב עם פיפ2 -אופן ריכוז-תלות (3-0.03 μM). הריכוזים מצטבר של פיפ2 מסומן המתאים עקבות נתונים ביולוגיים. (B) עיבוד נתונים גולמיים מציג את השינויים בהפרעה אופטי בריכוזים שונים של פיפ2 וזמינותו נציג. התאמת עקומה (C) עם משוואת היל המתקבל הערך שיא של אות אופטי הפרעות נמדד ב- PIP2 ריכוזים שונים לקביעת קבועי דיסוציאציה של שיווי משקל (דK) של אינטראקציה בין hEAG1 ערוץ חלבון לבין פיפ2 (n = 3). דמות 4B ו- 4 C שונו מ האן. et al. 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלים איור 1: תצורת ארוכי שרשרת phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.

משלים איור 2: מסך לכידת הכיסוי מותאם של רבנות בלי וזמינותו של איור 3. הנתונים מעובדים, מצויד וכי רק שמוצג שלבים דיסוציאציה וארגון. העקומה נתונים מעובד הוא כחול והוא עקומת התאמה לא-ליניאריות אדום. מטיב ההתאמה: R2 = 0.984789, X2 = 0.019109. הפרמטר הכריכה מקסימלי (Rmax) = 0.2875 ננומטר (± 0.0006). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תעלות יונים ממברנה שאומתו כאתרי המטרות הטיפוליות העיקריות של למעלה מ- 13% של תרופות הידועות כרגע לטיפול במגוון מחלות אנושיות, כולל הפרעות נוירולוגיות וכלי דם18. תיקון-קלאמפ הקלטה, תקן הזהב למדידת עם פונקציונליות של תעלות יונים עם מולקולות קטנות, כבר בשימוש נרחב עבור יון ערוץ ליגנדים ההקרנה. עם זאת, גישות אלקטרופיזיולוגיות כזה שאי אפשר להדגים את אם מולקולות קטנות נקשר ערוץ ישיר או לא19, כי המולקולה קטנה יכולה לפעול על מסלולים המערכת המקיימים אינטראקציה עם הערוץ או חלבונים אחרים. לעומת שימוש נרחב ליגנד רדיואקטיבי איגוד וזמינותו ושיטות אחרות נפוצים ביוסנסור ללא תווית, רבנות בלי יש יתרונות משמעותיים מבחינת סידור פשוט יחסית, התאחדות בלתי מוגבלת שלב גבוה לאורך, עיצוב assay קרוב יותר ל המערכת ב- vivo וצורך כמות קטנה של חלבון קיבוע (כמה μg), וזה יכול לספק נתונים היסטוריים תובנות נתונים קינטי5,6,20.

על מנת מקסימאלית לדמות את המצב ויוו , אנחנו לטהר את החלבונים ערוץ hEAG1 תפקודית של מידע יונקים stably ביטוי המערכת. פרוטוקול קל ויעיל עבור טיהור והן זיהוי של החלבון ערוץ overexpressed יון של תאים בתרבית של חסיד מוצג. כמה טיפים חשובים לטיהור מוצלחת של החלבונים ממברנה: 1) תהליך טיהור יכול להיות מוקטנת או להמציא מדורגים על פי השפע בביטוי חלבונים עניין במערכות ביטוי יונקים; 2) אנו התמזגו תג דגל על C הסופית של ערוץ hEAG1 כדי להקל על הטיהור של חלבון זה עם חרוזים אנטי-דגל זיקה באמצעות פרוטוקול ערכת טיהור וניקוי מסחרי. מדידות אלקטרופיזיולוגיות הראו כי הפיוז'ן הדגל יש אין השפעה על הפונקציה של הערוץ הזה15; 3) דגירה של התערובת של אנטי-דגל חרוזים, תמצית חלבון בן לילה ב 4° C ברעידות בעדינות שימושי עבור לכידת חלבון כימרי את דגל; 4) באמצעות הטיהור זיקה, שאנחנו יכולים לקבל מספיק חלבונים ערוץ של יון hEAG1 ארבע מנות 15 ס מ עם מעל 90% תא confluency לתהליך assay פעם אחת.

החלבונים ערוץ hEAG1 מטוהרת הם biotinylated באמצעות שימוש עודף ביוטין (קיפול 3-10) והחלפת המאגר פתרון באמצעות מאגר SD עבור וזמינותו רבנות בלי נוספות. ביוטין עודף יכול לשנות מקסימאלית החלבון ערוץ ממברנה כדי להגביר את היעילות מצופה על פני ביוסנסור טיפים, המאגר assay SD המכילים ריכוזים נמוכים של BSA ו- Polysorbate 20 ניתן למזער איגוד לא ספציפית9. למרות הליך פעולות אלה מפתח, הגומלין לא אידאליות עדיין יכול להתקיים במיוחד בעת ביצוע מחקר מחייב עם ריכוז גבוה של מולקולה קטנה, אשר יכול הלא ספציפית שמאוגד אל פני השטח של חיישנים SA והתוצאה חיובי-false אינטראקציה כמו העקומה cyanine שמוצג באיור 4A. לפיכך, פרוטוקול חיסור הפניה כפולה הוא עדיין הכרחי לקבל את התוצאות אמין על-ידי חיסור איגודי שאינם ספציפיים לרבות את האינטראקציות בין חיישן מולקולה קטנה, biotinylated חלבון hEAG1 עם פתרון מולקולה קטנה, ו חיישנים עם פתרון מולקולה קטנה. זו פעולת חיסור הפניה כפולה צריך ארבע ביולוגיים פעם אחת וזמינותו. ביולוגיים שני מצופה biotinylated קרום חלבונים ו שתמשיך assay האינטראקציה עם מולקולה קטנה, המאגר שלו. החיישנים שני האחרים יהיו wetted עם SD מאגר ואינטראקציה עם מולקולה קטנה ומאגר שלה. רק את האינטראקציה של חלבון ממברנלי. מרותק למיטה ביוסנסור ומראה מולקולה קטנה האות חיובית ואת שאר אינטראקציה שלושה אותות עבודה כמו הפקדים (איור 2). באמצעות הליך זה, כפי שמוצג באיור 3 ו- 4 איור, התוצאות שלנו בבירור להדגים את הכוח הגרעיני החזק בין hEAG1 ערוץ חלבונים ו- PIP2 ולהציג פרופיל ריכוז-תלות. זה יש לציין כי ישנם מספר מגבלות במדידה שלנו. למשל, ישנם כמה שומנים ממברנה אחרים אשר יכולים לאגד חלבון מטוהרים ערוץ. גם, זה עדיין לא ברור כי אם החלבון מעוגן מטוהרים לשמור קונפורמציה ופעילות המקורי שלהם. קשה מאוד למדוד התצורות האמיתי של ליפידים מולקולה קטנה כאשר הן עוברות אינטראקציה עם החלבון. למרות תהליכי מפורט לא ידוע, המחקר שלנו להראות קינטיקה מחייב מאת רבנות בלי עקביים עם אלה נגזר על ידי הקלטה אלקטרופיזיולוגיות, מה שהופך את היישום מתה על הרומן לאינטראקציה יון ערוץ מולקולת חלבון-קטן ב באופן משלים.

לסיכום, המחקר שלנו מאשרת כי זה אסטרטגיה אמין וטיהור של חלבון ממברנלי פונקציונלי ממערכת בתרבית של הביטוי לזהות אינטראקציה ישירה עם ליגנדים שלה. יישום מוצלח של רבנות בלי לאינטראקציה מולקולת חלבון-קטן ממברנה יקל על חקר ההקרנה ומנגנון של מולקולה קטנה בגילוי תרופות ערוץ יון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן מחקרים בין-תחומית SJTU ב רפואה, הנדסה (YG2016QN66), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31271217) ו הלאומי בסיסי מחקר תוכנית של סין (2014CB910304) ומרכז ביו-ID.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose Medium HyClone SH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x) HyClone SH30256.01
Fetal Bovine Serum Gibco 10270
Penicillin/Streptomycin Gibco 1697550
Cell Culture Dish Corning 430599 150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 Substitute Amresco E109
Sodium chloride BBI Life Sciences A610476
Potassium chloride BBI Life Sciences A610440
Bovine Serum Albumin BBI Life Sciences A600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate BBI Life Sciences A600560
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
3x FLAG peptide Sigma F4799
Octet-RED96 Pall/FortéBio 30-5048
Data Acquisition software Pall/FortéBio Version 7.1
Data Analysis software Pall/FortéBio Version 7.1
Biosensor/Streptavidin Pall/FortéBio 18-5019
Microtiter plate Greiner Bio-one 655209
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin ThermoFisher 21338
Centrifugal Machine ThermoFisher 75004250
PageRuler Prestained Protein Ladder ThermoScientific 318120
Ultrafiltration device MILLIPORE UFC503008 NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) Sigma P9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody Sigma F1804 1:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-2005 1:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay Kit Beyotime P0010
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04693159001
Amersham Imager 600 Imaging System GE Healthcare Bio-Sciences
Western blot system BIO-RAD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  2. van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
  3. Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
  4. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
  5. Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
  6. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
  7. Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
  8. Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
  10. Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
  11. Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
  12. Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
  13. Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
  14. Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
  15. Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
  16. Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
  17. Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
  18. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
  19. Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
  20. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).

Tags

ביוכימיה גיליון 133 ביו-שכבה אינטרפרומטריה (רבנות בלי) חלבון ערוץ יון מולקולה קטנה חלבון זיקה טיהור ביטוי יציב בתרבית של המערכת EAG1 האנושית (hEAG1) ערוץ גילוי תרופות מטרות טיפוליות ליגנד ההקרנה
לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, B., Zhang, M., Sun, P., Hou, S. … More

Han, B., Zhang, M., Sun, P., Hou, S. Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay. J. Vis. Exp. (133), e56846, doi:10.3791/56846 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter