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Biochemistry

जैव परत Interferometry परख द्वारा छोटे अणुओं के साथ एक आयन चैनल प्रोटीन के संपर्क कैनेटीक्स पर कब्जा

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56846
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of General Surgery, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 3Hongqiao International Institute of Medicine, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Summary

यहां प्रोटोकॉल छोटे अणु लिपिड ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (रंज2) के साथ शुद्ध hEAG1 आयन चैनल प्रोटीन की बातचीत का वर्णन । माप दर्शाता है कि BLI उपंयास छोटे अणु आयन चैनल ligand स्क्रीनिंग के लिए एक संभावित तरीका हो सकता है ।

Abstract

बायो-लेयर interferometry (BLI) की परख प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-छोटे अणु इंटरैक्शन को मापने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है । यहां, हम पहले इस उपंयास लेबल के आवेदन का वर्णन मुक्त तकनीक छोटे अणु रंज2के साथ मानव EAG1 (hEAG1) चैनल प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए । hEAG1 चैनल के कैंसर में अपनी ंयायपालिका अधिक व्यक्त की वजह से संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है और कुछ लाभ के समारोह मस्तिष्क संबंधी रोगों के कुछ प्रकार में शामिल उत्परिवर्तनों । हम एक स्तनधारी स्थिर अभिव्यक्ति प्रणाली से hEAG1 चैनल प्रोटीन शुद्ध और BLI द्वारा रंज2 के साथ बातचीत मापा । hEAG1 प्रोटीन और रंज2 के बीच बंधन के कैनेटीक्स के सफल माप दर्शाता है कि BLI परख एक संभावित उच्च प्रवाह दृष्टिकोण आयन चैनल औषध विज्ञान में उपंयास छोटे अणु ligand स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया है ।

Introduction

छोटे अणुओं के साथ सेल सतह सुलभ आयन चैनल प्रोटीन लक्ष्यीकरण ligand स्क्रीनिंग और जैविक दवा डिस्कवरी1,2,3के लिए एक जबरदस्त क्षमता प्रदान करता है । इस प्रकार, एक उपयुक्त उपकरण आयन चैनल और छोटे अणुओं और उनके इसी समारोह के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । पैच-दबाना रिकॉर्डिंग आयन चैनल कार्यात्मक परख में एक अनूठा और अपूरणीय तकनीक होने का प्रदर्शन किया गया है । हालांकि, निर्धारित करना है कि छोटे अणुओं सीधे लक्ष्य आयन चैनल अंय प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता है । परंपरागत रूप से, रेडियोधर्मी ligand बाध्यकारी परख के लिए छोटे अणु और अपने लक्ष्य आयन चैनल प्रोटीन के बीच बाध्यकारी के कैनेटीक्स का पालन किया गया । हालांकि, इस तकनीक का उपयोग रेडियोधर्मी लेबलिंग और पता लगाने में इसकी आवश्यकता की वजह से सीमित है । इसके अलावा, आवश्यक कदम के अध्ययन में छोटे ligand लेबल के लिए विशिष्ट ligand ज्ञात बिना आयन चैनलों के कई प्रकार में इसका इस्तेमाल रोकता है । कुछ लेबल-फ्री तकनीक जैसे एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, एक्स-रे विवर्तन, अतिसूक्ष्म thermophoresis (MST)4 और सरफेस plasmon अनुनाद (SPR) में प्रोटीन-छोटे अणु इंटरैक्शन को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । लेकिन परख के इन प्रकार आमतौर पर मुश्किल की वजह से पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं कर सकते है पूर्ण लंबाई प्रोटीन, गतिशीलता के कम संकल्प, कम प्रवाह, और उच्च लागत5। इन तकनीकों के विपरीत, जैव परत Interferometry (BLI) एक उपंयास लेबल मुक्त पद्धति के रूप में उभर रहा है प्रोटीन का पता लगाने के लिए इन खामियों को दूर करने के लिए-छोटे अणु बातचीत के सतहों पर एक छोटी मात्रा में प्रोटीन का नमूना मैटीरियल 6,7-सेंसर और ऑप्टिकल बदलते संकेतों को मापने. एक होनहार के रूप में, BLI तकनीक पहले से ही प्राकृतिक पानी में घुलनशील प्रोटीन के साथ छोटे अणुओं की बातचीत का पालन करने के लिए प्रदर्शन किया है एक मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी CR80208 और विस्तृत परख प्रक्रिया में बताया गया है एक previous article9. हालांकि नए चिकित्सीय लक्ष्य खोज के लिए आयन चैनल प्रोटीन की महत्वपूर्ण भूमिका को मांयता दी गई है, आयन चैनल प्रोटीन-छोटे अणु संपर्क परख BLI पर आधारित नहीं बताया गया है ।

मानव ईथर जाओ-जाओ चैनल (hEAG1) कैंसर की कोशिकाओं और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विभिंन प्रकार में व्यक्त कर रहे है जो चैनल बनाता है कई कैंसर और न्यूरॉन विकारों के एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य10,11, 12,13,14. हमारी प्रयोगशाला में electrophysiological अध्ययन ने hEAG1 चैनल15पर phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (रंज2) के निरोधात्मक प्रभाव की पुष्टि की है । हमारे परिणामों के आधार पर, BLI तकनीक का उपयोग करके hEAG1 के साथ सीधे बातचीत रंज2 परीक्षण आयन चैनल प्रोटीन के अन्य प्रकारों के लिए एक मॉडल के रूप में किया जा सकता है विशेष रूप से उन चैनलों के लिए विशेष लाइगैंडों कमी छोटे अणु यौगिक बातचीत. BLI परख के निर्देशों के अनुसार, हम biotinylated hEAG1 प्रोटीन तैयार किया और उंहें streptavidin (एसए) की सतह पर मैटीरियल के बाद उंहें रंज2 समाधान के लिए उनके प्रत्यक्ष बंधन के बीच का पालन करने के लिए बातचीत के बाद युक्तियां प्रोटीन और लिपिड । hEAG1 प्रोटीन लेपित सतह को रंज2 के लगाव के बाद, सतह पर परत की मोटाई बढ़ जाती है, जो सीधे वर्णक्रमीय बदलाव को संबद्ध और वास्तविक समय16में मापा जा सकता है । बाध्यकारी कैनेटीक्स को संबद्धता चरण में सकारात्मक बदलाव और पृथक्करण चरण में ऋणात्मक बदलाव के कारण निर्धारित किया जा सकता है । इस सिद्धांत के अनुसार, हम HEK से कार्यात्मक hEAG1 आयन चैनल प्रोटीन शुद्ध-239T स्थिर अभिव्यक्ति प्रणाली अपनत्व शुद्धि विधि का उपयोग करके बनाए रखने के लिए इन विट्रो कार्यात्मक राज्य में, तो के बंधन की कैनेटीक्स मापा अलग एकाग्रता2रंज, और electrophysiological माप15में मनाया के रूप में एक semblable काइनेटिक डेटा झुकेंगे । BLI और electrophysiological माप से परिणामों के बीच करीब पत्राचार पहली बार आयन चैनल झिल्ली प्रोटीन के लिए एक उपयुक्त विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में BLI की उपयुक्तता के लिए प्रदर्शन छोटे अणु संपर्क ।

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Protocol

नोट: HEK-293T सेल लाइन लगातार व्यक्त झंडा-टैग hEAG1 चैनल प्रोटीन transfecting द्वारा निर्मित है एक pCDH lentiviral प्लाज्मिड के बाहर सी पर एक ध्वज के साथ hEAG1 के डीएनए अनुक्रम युक्त HEK-293T कोशिकाओं के बाद में-टर्मिनस puromycin-प्रतिरोधी चयन के रूप में पहले वर्णित15।

1. ध्वज की अपनत्व शुद्धि-tagged hEAG1 Channel HEK-293T कोशिकाओं से प्रोटीन

  1. गल कोशिकाओं को छुरा तेजी से गर्म पानी (37 डिग्री सेल्सियस) में तरल नाइट्रोजन से hEAG1 चैनलों व्यक्त । एक 10 सेमी डिश में कोशिकाओं (के बारे में 5 एक्स 106 जमे हुए कोशिकाओं) बीज । Dulbecco के संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम 8 मिलीलीटर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, 100 μg/एमएल streptomycin, 4 मिमी L-glutamine के साथ पूरक है और अगले दिन मध्यम बदल में रातोंरात सेल बढ़ाएँ ।
  2. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इन HEK-293T कोशिकाओं के GFP प्रतिदीप्ति की जांच करें सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत छुरा hEAG1 प्रणाली में संवर्धन चैनलों व्यक्त करते हैं । तेजी से कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 0.25% trypsin की 1 मिलीलीटर के साथ बढ़ती कोशिकाओं को trypsinize और पाचन समाप्त करने के लिए सीरम युक्त संस्कृति द्रव के 2 मिलीलीटर thenadd । एक 15 सेमी डिश के लिए सेल सस्पेंशन के 400 μL को पूरा DMEM मीडियम के 15 एमएल वाले ट्रांसफर करें । कुल में ४ १५ सेमी व्यंजन तैयार करें ।
  3. फसल इन कोशिकाओं के बाद 2-3 दिनों संस्कृति जब कोशिकाओं के बारे में 90% प्रवाह पर पहुंच ।
    1. कोशिकाओं से विकास के माध्यम निकालें और उन्हें दो बार फॉस्फेट की 4 मिलीलीटर के साथ धोने (1x पंजाबियों, पीएच = 7.4) ।
    2. धोने के बाद पंजाबियों को त्यागें ।
    3. सेल परिमार्जन का उपयोग करके प्रत्येक डिश के लिए 2 मिलीलीटर 1x पंजाबियों में कोशिकाओं परिमार्जन और 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्क्रैप कोशिकाओं हस्तांतरण ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 420 एक्स जी में 5 मिनट के लिए सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।
    5. supernatant का त्याग कर दें ।
    6. lysis बफर के कुल 4 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड (10 मिमी HEPES, 1.5 मिमी MgCl2, 10 मिमी NaCl, 1% NP-40, पीएच 7.0, पूर्ण छेड़ने अवरोधक निहित) बर्फ पर 30 मिनट के लिए, और भंवर अच्छी तरह से lysate हर 10 मिनट.
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x जी में 10 मिनट के लिए सेल lysate केंद्रापसारक ।
    8. supernatant को 5 एमएल ट्यूब पर ट्रांसफर करें और तुरंत इस्तेमाल के लिए बर्फ पर रखें ।
  4. विरोधी फ्लैग M2 संबध राल तैयार करें ।
    1. अच्छी तरह से राल निलंबित (स्टोर बफर में एक 50% निलंबन के रूप में आपूर्ति) कोमल उलटा करके सुनिश्चित करें कि विरोधी फ्लैग M2 संबंध जेल की बोतल जेल मोतियों की एक वर्दी निलंबन है ।
    2. तुरंत निलंबन के 400 μL एक ठंडा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण ।
    3. 4 ° c पर 8, 000 x g पर 30 s के लिए निलंबन केंद्रापसारक और supernatant ध्यान से बाहर स्टोर बफर धोने के लिए त्यागें ।
    4. राल के लिए 500 μL 1x पंजाबियों जोड़ें और गोली 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ निलंबित । फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 8, 000 x g पर 30 एस के लिए निलंबन के केंद्रापसारक और supernatant पंजाबियों ध्यान से त्यागें । संग्रहीत बफ़र को साफ़ करने के लिए ये वाश चरण दोहराएँ ।
  5. जोड़ें 500 μL प्रोटीन निकालने राल गोली करने के लिए कदम 1.3.8 में तैयार supernatant गोली निलंबित और एक नया ठंडा 5 एमएल ट्यूब को निलंबन स्थानांतरण । इस कदम को फिर से यकीन है कि कोई जेल मोती छोड़ कर दोहराएं । मिश्रण करने के लिए छोड़ दिया प्रोटीन निकालने जोड़ें ।
  6. 8 rpm पर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर पर रात भर मिश्रण गर्मी को झंडा फ्यूजन प्रोटीन पर कब्जा ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1, 000 x g पर 10 मिनट के लिए 12 एच मशीन के बाद मिश्रण केंद्रापसारक ।
  8. supernatant त्यागें और गोली धो 1x पंजाबियों के 500 μL के साथ तीन बार । यह तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर रखो ।
  9. रेफरेंस में फ्लैग hEAG1 प्रोटीन को 3x फ्लैग पेप्टाइड के साथ निकाला गया ।
    1. 3x फ्लैग रेफरेंस सॉल्यूशन तैयार करें । 500 μL स्टॉक समाधान में 3x झंडा पेप्टाइड भंग (0.5 एम Tris-एचसीएल, 1 एम NaCl, पीएच = 7.5) 8 μg/μL की एकाग्रता में ।
    2. 10 μL 3x फ्लैग रेफरेंस सॉल्यूशन को पंजाब के 390 μL में जोड़ें एक 200 एनजी/μL अंतिम एकाग्रता समाधान ।
    3. 3x फ्लैग रेफरेंस सॉल्यूशन के 400 μL को जेल की मोतियों से जोड़कर स्टेप 1.8 पर तैयार किया ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 8 rpm में शेखर पर नमूना मशीन ।
    5. 30 एस के लिए राल के केंद्रापसारक पर 8, 000 x जी
    6. supernatant एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और यह तत्काल उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

2. एकाग्रता परख और बीसीए प्रोटीन परख किट और पश्चिमी सोख्ता द्वारा शुद्ध फ्लैग फ्यूजन hEAG1 की पुष्टि

  1. शुद्ध प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण का उपयोग कर बीसीए प्रोटीन परख किट के अनुसार है निर्माण अनुदेश ।
  2. पश्चिमी विश्लेषण के लिए 30 μL नमूना का प्रयोग करें ब्याज प्रोटीन की पुष्टि के लिए एक विरोधी ध्वज एंटीबॉडी के रूप में पहले वर्णित के रूप में15का उपयोग करके शुद्ध किया गया था ।

3. BLI परख के लिए बायोटिन के साथ शुद्ध चैनल प्रोटीन लेबलिंग

  1. पंजाब में 5 मिलीग्राम/एमएल बायोटिन स्टॉक समाधान तैयार करें । प्रत्येक परीक्षण के लिए (दो उपसेंसरों), एक 3 जोड़ने के लिए बायोटिन की अधिक दाढ़ 20 μg शुद्ध प्रोटीन के लिए एक बेहतर एन-टर्मिनल biotinylation पंजाब में शुद्ध प्रोटीन के प्राप्त करने के लिए ।
  2. बर्फ पर अंधेरे में नमूना कम से कम 30 मिनट के लिए मशीन ।
  3. नमूना कमजोर पड़ने (एसडी) बफर तैयार: 0.02% polysorbate 20 और 0.1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA, पीएच 7.4) के साथ पंजाबियों ।
  4. ultrafiltration करने के लिए एसडी बफर के लिए शुद्ध चैनल प्रोटीन के बफर बदलने के लिए प्रदर्शन करते हैं । 30 केडीए के आणविक वजन कटऑफ के साथ ultrafiltration डिवाइस का उपयोग करके असीम बायोटिन निकालें, एसडी बफर जोड़ने और 12,000 x g पर नमूना केंद्रापसारक, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ।
  5. ultrafiltration डिवाइस के केंद्रापसारक ट्यूब से ultrafiltrate निकालें, फ़िल्टर डिवाइस में 200 μL एसडी बफर जोड़ें और 12,000 x g पर नमूना केंद्रापसारक, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए । इस कार्रवाई को कम से तीन बार दोहराएं ।
  6. संग्रहीत करने के लिए बफर नमूना जमा, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में फिल्टर डिवाइस डालें और उंहें 2,000 x g पर केंद्रापसारक, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर । तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर नमूना रखें ।

4. परख के लिए रंज2 समाधान की तैयारी

  1. के रूप में पहले वर्णित17बर्फ पर 30 मिनट के लिए sonicating द्वारा में रंज2 (1 मिमी) के शेयर समाधान तैयार ज2हे । -20 डिग्री सेल्सियस पर गिलास शीशियों में समाधान की दुकान और जोरदार भंवर द्वारा प्रयोगों से पहले तुरंत अंतिम सांद्रता के लिए यह पतला ।

5. BLI परख

  1. उपकरण पर बारी और मशीन की पुष्टि करने के लिए "साधन स्थिति" खिड़की की जांच करने के लिए BLI अध्ययन से पहले 30 मिनट से कम समय में उपकरण गर्म करने के लिए "तैयार" राज्य है ।
  2. सुनिश्चित करें कि उपकरण का दरवाज़ा डेटा प्राप्ति सॉफ़्टवेयर खोलने से पहले बंद कर दिया गया है और प्रयोग विज़ार्ड में "नया कैनेटीक्स प्रयोग" चुनें ।
  3. ठीक क्लिक करके 96-well प्लेट पर इस्तेमाल किया जा कुओं को परिभाषित करने के लिए बफर, लोड, और नमूना चुनें । कुओं के नमूने के लिए, biotinylated झंडा फ्यूजन hEAG1 प्रोटीन की एकाग्रता की इकाई दाढ़ (10 μg, ०.०९ माइक्रोन) के रूप में इनपुट होना चाहिए ।
  4. आधारभूत, लोडिंग, एसोसिएशन और पृथक्करण सहित परख कदम को परिभाषित करें । एक परख कदम और संबंधित कॉलम पर डबल क्लिक करें चुनें । परख परिभाषा का एक डुप्लिकेट नियंत्रण सेंसर के लिए सेट किया गया है । rpm को 1,000 के रूप में सेट करें । आधारभूत चरण के लिए 1 ंयूनतम चुनें और 5-लोड हो रहा है, संघ, और पृथक्करण, क्रमशः के लिए 10 मिनट । कमरे के तापमान (के बारे में 24 डिग्री सेल्सियस) पर परीक्षण करते हैं ।
    नोट: दो मुख्य प्रक्रियाएं हैं: सेंसर करने के लिए biotinylated चैनल प्रोटीन लोड हो रहा है और छोटे अणु यौगिकों के साथ बातचीत परख. वे लगातार दीं जा सकता है (आधारभूत, लोडिंग, आधारभूत, संघ और पृथक्करण) । वैकल्पिक रूप से, वे परीक्षण यौगिकों बर्बाद कर से बचने के लिए अलग से आगे बढ़ाया जा सकता है जब पहली लोडिंग भाग असफल ।
  5. उन स्तंभों पर क्लिक करें जिनमें सेंसर होते हैं और सेंसर ट्रे में सेंसर के स्थान इंगित करने के लिए "भरण" क्लिक करें.
  6. गलतियों की जांच करने और उंहें सही करने के लिए वापस जाने के लिए सभी योजनाबद्ध चरणों की समीक्षा करें ।
  7. डेटा फ़ाइलों का स्थान निर्धारित करें और "जाओ" पर क्लिक करने के लिए परख शुरू करते हैं ।
    नोट: इस कदम किया गया है, तो फिर "विलंबित प्रयोग शुरू" सेटिंग छोड़ दिया जाना चाहिए सेंसर, एसडी बफर में कम से कम 10 मिनट के लिए गीला की जरूरत है । यदि नहीं, तो सेंसर को गीला करने से पहले एक 600 s विलंब सेट करें ।
  8. ट्रे के तल में एक काला 96-well थाली रखो और थाली के A1 कोने ट्रे पर पायदान में थाली सीट डालने के लिए । कुओं के लिए सेंसर लोड करने के लिए, 200 परख के μL बफर प्रति अच्छी तरह से पंक्ति में 2 कुओं में एक और 96-अच्छी तरह से प्लेट की पंक्ति बी में 2 कुओं में जोड़ें ।
  9. नमूना प्लेट के रूप में एक और काला 96-अच्छी प्लेट तैयार करें और पंक्ति में 200 μL एसडी बफर के साथ कुओं को भरने के रूप में नियंत्रण या biotinylated hEAG1 प्रोटीन समाधान (10 μg) चरण 5.3 में प्रोग्रामिंग के दौरान असाइन किया गया के रूप में पंक्ति में ।
    नोट: बुलबुले शुरू करने से बचें ।
  10. साधन के दरवाजे खोलें और सेंसर ट्रे और नमूना प्लेट क्रमशः बाएँ और दाएँ प्लेट धारक में डालें । जांच करें कि सेंसर ट्रे और नमूना थाली सही प्लेट धारक के शीर्ष दाएं कोने पर बाईं थाली धारक और "A1" मार्कर के आकार के आधार पर ठीक से तैनात हैं । दरवाजा बंद करके परख शुरू कर दीजिये ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और परख डेटा युक्त फ़ोल्डर लोड । प्रसंस्करण मेनू इंटरफ़ेस में प्राप्त करने के लिए "प्रसंस्करण" पर क्लिक करें और हम रंगीन कच्चे काइनेटिक घटता देख सकते हैं ।
  2. Step1के अंतर्गत: "डेटा चयन", "सेंसर चयन" क्लिक करें । "सेंसर ट्रे #1" पर, क्लिक करें सेंसर कुओं केवल एसडी बफर और सही क्लिक के साथ गीला "सेंसर प्रकार बदलें" करने के लिए "संदर्भ सेंसर". ' नमूना प्लेट मानचित्र "पर, सभी गैर विशिष्ट बंधन कुओं और सही करने के लिए" अच्छी तरह से संदर्भ "को बदलने के लिए ठीक क्लिक करें" निर्दिष्ट "।
  3. चरण 2 और पॉइंट "दोहरे संदर्भ" के "घटाव" से पहले बॉक्स में टिक करें ।
  4. चरण 3में: "Y अक्ष संरेखित करें", संरेखण चरण के रूप में "आधार रेखा" चुनें । "समय सीमा" के लिए, उस आधार रेखा के अंतिम 10 s दर्ज करें (यानी से: 0.1 To: ५९.८) ।
  5. चरण 4में: "अंतर-चरण सुधार", संबद्धता और पृथक्करण चरणों के बीच संकेत परिवर्तन कम करने के लिए "आधार रेखा से संरेखित करें" चुनें ।
  6. चरण 5में: "प्रक्रिया", अधिकांश मामलों में Savitzky-Golay फ़िल्टरिंग फ़ंक्शन का चयन करें और "प्रक्रिया डेटा" आगे बढ़ें ।
  7. आगे डेटा विश्लेषण के लिए कच्चे डेटा सहेजें चरण 7 में अंय सॉफ्टवेयर का उपयोग: "परिणाम सहेजें" ।
  8. क्लिक करें "विश्लेषण । वक्र फिटिंग "।
    1. "के लिए कदम का विश्लेषण", चुनें "एसोसिएशन । पृथक्करण ". "मॉडल" के लिए, 1:1 चुनें.
      नोट: हम 1:1 मॉडल चुनें क्योंकि यह अच्छी तरह से हमारे मूल डेटा पर फिट है और 1:2 या 2: अपने उच्च स्वतंत्रता के कारण मॉडल के तहत फिटिंग से अधिक की संभावना से परहेज । लेकिन अंय विकल्प यहां उपलब्ध है और उपयुक्त analyte के विभिंन बाध्यकारी मॉडलों के लिए अंय फिटिंग विश्लेषण के लिए चुना जा सकता है ।
    2. "फिटिंग" के लिए, ग्लोबल (पूर्ण) चुनें । "समूह द्वारा" के लिए, "रंग" का चयन करें । का चयन करें "सेंसर द्वारा अनलिंक" Rmax अधिकतम संकेत प्रतिक्रिया (Rmax) की स्वतंत्र फिटिंग की अनुमति के लिए ।
    3. रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए "फ़िट घटता!" क्लिक करें । पहाड़ी समीकरण और एकल घातीय समारोह हमारे अध्ययन में इस्तेमाल किया गया ।
    4. क्लिक करें "डेटा निर्यात । रिपोर्ट सहेजें "फिटिंग परिणाम को बचाने के लिए । या क्लिक करें "डेटा निर्यात । निर्यात फिटिंग परिणाम "आगे रेखांकन और अंय सॉफ्टवेयर के साथ डेटा विश्लेषण के लिए कच्चे डेटा को बचाने के लिए ।

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Representative Results

हम HEK से झंडा संलयन hEAG1 चैनल प्रोटीन शुद्ध-293T कोशिकाओं छुरा से व्यक्त hEAG1 । इस फ्यूजन प्रोटीन के समारोह पैच-क्लैंप विधि का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया है और गुणवत्ता और शुद्ध प्रोटीन की विशिष्टता पश्चिमी दाग (चित्रा 1) द्वारा पुष्टि कर रहे हैं । शुद्ध चैनल प्रोटीन biotinylated है लिपिड के साथ एक बातचीत परख करने के लिए (रंज2) वास्तविक समय BLI परख का उपयोग करके । BLI बाइंडिंग परख कॉंफ़िगरेशन चित्रा 2में दिखाया गया है । hEAG1 और PIP2 के बीच एक ठेठ बाइंडिंग वक्र चित्रा 3में दिखाया गया है । इस मामले में, 3 माइक्रोन pip2 पंजाबियों बफर में भंग कर दिया है (रंज2 के विन्यास अनुपूरक चित्रा 1में दिखाया गया है), और संकेत गैर-विशिष्ट बंधन को घटाना करने के लिए एक डबल संदर्भ घटाव प्रोटोकॉल का उपयोग कर विश्लेषण किया है ( सेंसर और रंज2) के बीच बंधन, पृष्ठभूमि (biotinylated hEAG1 प्रोटीन और पंजाबियों के बीच बातचीत), और संकेत बहाव संवेदक परिवर्तनशीलता की वजह से (सेंसर और पंजाब के बीच बाध्यकारी). और बाइंडिंग ट्रेस वैश्विक रूप से फ़िट है और एक अच्छी तरह से फिटिंग ओवरले (अनुपूरक चित्र 2) दिखाया गया है. इसके अलावा, हम पिप2 के कैनेटीक्स को pip 2 के विभिन्न सांद्रता में प्रोटीन के द्वारा शुद्ध hEAG1 चैनल कॉम्प्लेक्स के लिए मापने । विश्लेषण के बाद, हम electrophysiological माप15से प्राप्त आईसी50 मूल्य के समान है जो 0.35 ± 0.04 माइक्रोन, के एक पृथक्करण निरंतर (कश्मीरडी) मूल्य मिलता है । इन परिणामों का प्रदर्शन किया है कि BLI परख आयन चैनल झिल्ली प्रोटीन और लिपिड संपर्क विश्लेषण के लिए उपयुक्त है ।

Figure 1
चित्र 1: GFP इमेजिंग, पैच दबाना, और पश्चिमी ब्लाट द्वारा HEK-293T कोशिकाओं से रिकॉमबिनेंट hEAG1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति, समारोह, और विशिष्टता की पहचान, क्रमशः । (क) स्थिर अभिव्यक्ति hEAG1 HEK-293T प्रणाली सफलतापूर्वक लगभग सभी कोशिकाओं में puromycin अभिव्यक्ति द्वारा सबूत के रूप में अभिकर्मक-hEAG1 pCDH प्रणाली के साथ lentivirus के बाद मोनोक्लोनल GFP-प्रतिरोधी चयन द्वारा स्थापित किया गया है. (B) पल्स प्रोटोकॉल (शीर्ष) और एक प्रतिनिधि पूरे सेल पैच से आरोपित वर्तमान निशान-एक स्थिर कक्ष में hEAG1 चैनलों से रिकॉर्डिंग दबाना वर्तमान-80 एमवी को ध्रुवीकरण के द्वारा पीछा 10 एमवी के कदम के साथ-80 एमवी के पकड़े वोल्टेज से वोल्टेज ध्रुवीकरण द्वारा किया जाता है । कोशिकाओं को सामांय कश्मीर+ चैनल रिकॉर्डिंग समाधान में मशीन है के रूप में पहले15वर्णित है । वोल्टेज पर निर्भर जावक पोटेशियम धाराओं का सुझाव है कि कार्यात्मक hEAG1 चैनल अत्यधिक HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं । (ग) hEAG1 चैनल प्रोटीन के पश्चिमी दाग शुद्ध प्रोटीन के नमूनों से । विरोधी झंडा एंटीबॉडी ~ 110 केडीए के एक एकल प्रोटीन बैंड पहचानता है, एक ध्वज की पूर्ण लंबाई-hEAG1 चैनल अभिव्यक्ति टैग का प्रदर्शन किया । हान एट अल से यह आंकड़ा 1C संशोधित किया गया है । 15. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक योजनाबद्ध BLI बाइंडिंग परख प्रोटोकॉल दिखा आरेख । चार सेंसरों में समानांतर में उपयोग किया जाता है biotinylated चैनल प्रोटीन या उनके भंग एसडी बफर चैनल प्रोटीन और संदर्भ लोड करने के लिए. उसके बाद, इन चार सेंसरों परख चरण के लिए स्थानांतरित कर रहे है एसोसिएशन और फॉस्फोलिपिड या उसके समाधान बफर के साथ संबद्धता का पता लगाने । चैनल प्रोटीन, फॉस्फोलिपिड, और बफर की स्थिति संकेत के रूप में रंग रहे हैं । क्षैतिज लाल बिंदीदार रेखा BLI अध्ययन के दो प्रमुख कदम: लोड हो रहा है चरण और बातचीत परख चरण इंगित करता है । यह आंकड़ा 2 हान एट अल से संशोधित किया गया है । 15. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक ठेठ BLI अध्ययन में कच्चे डेटा और संसाधित डेटा दिखा स्क्रीन कब्जा. (एक) ठेठ लोडहोरहा है और equilibration घटता equilibration कदम (60 एस) एसडी बफर (आधारभूत) के साथ, hEAG1 प्रोटीन (लोड हो रहा है) और संदर्भ वक्र equilibrated के साथ लोड हो रहा कदम दिखा रहा है और hEAG1 प्रोटीन (लोड हो रहा है) के साथ भरी हुई, एक साथ दो व्यक्तिगत सेंसर सुझावों का मापन. (B) अनुलंब लाल रेखाएं इंगित करती है कि सेंसर को लिपिड समाधान से परख कार्रवाई के दौरान बफ़र समाधान में स्थानांतरित करता है । (C) गैर-विशिष्ट बाइंडिंग संकेतों को घटाना करने के लिए दोहरे संदर्भ घटाव को संसाधित करने के बाद संबद्धता और पृथक्करण चरणों में मूल ऑप्टिकल संकेत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: hEAG1 चैनल प्रोटीन दिखा BLI परख से परिणाम सीधे रंज2के साथ बातचीत । (A) स्क्रीन पर कब्जा hEAG1 प्रोटीन के कच्चे डेटा एकाग्रता पर रंज2 के साथ बाध्यकारी-निर्भरता तरीके से (0.03-3 माइक्रोन) दिखा । रंज2 के संचित सांद्रता चिह्नित के लिए इसी ' डेटा निशान । (ख) कच्चे एक प्रतिनिधि परख में रंज2 के विभिंन सांद्रता में ऑप्टिकल हस्तक्षेप में परिवर्तन दिखा प्रसंस्करण डाटा । (ग) पहाड़ी समीकरण के साथ वक्र फिट ऑप्टिकल हस्तक्षेप संकेत के चरम मूल्य से प्राप्त संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (कश्मीरडी) के निर्धारण के लिए अलग रंज2 सांद्रता पर मापा संपर्क hEAG1 चैनल प्रोटीन और रंज के बीच2 (n = 3) । हान एट अल से चित्रा 4B और 4c संशोधित किया गया है । 15. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक आंकड़ा 1: लंबी श्रृंखला phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (पिप2) का विंयास । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: चित्रा 3 के BLI परख से सज्जित ओवरले के स्क्रीन पर कब्जा । डेटा संसाधित और सज्जित है और केवल संघ और पृथक्करण चरणों दिखाया गया है । संसाधित डेटा वक्र नीला है और रेखीय फिटिंग वक्र लाल है । फिट की अच्छाई: आर2 = ०.९८४७८९, एक्स2 = ०.०१९१०९ । अधिक से अधिक बाध्यकारी पैरामीटर (Rmax) = ०.२८७५ एनएम (± ०.०००६) । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

झिल्ली आयन चैनलों मानव रोगों की एक किस्म के उपचार के लिए वर्तमान में जाना जाता दवाओं के 13% से अधिक की प्राथमिक चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में सत्यापित किया गया है हृदय और तंत्रिका विज्ञान विकारों18सहित । पैच-दबाना रिकॉर्डिंग, छोटे अणुओं के साथ आयन चैनलों के कार्यात्मक को मापने के लिए गोल्डन मानक, व्यापक रूप से आयन चैनल लाइगैंडों स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, इस तरह के electrophysiological दृष्टिकोण यह प्रदर्शित नहीं कर सकते कि छोटे अणु चैनल के लिए सीधे बांधता है या नहीं19, क्योंकि छोटे अणुओं अंय प्रोटीन या सेलुलर रास्ते पर कार्रवाई कर सकता है कि चैनल के साथ बातचीत । व्यापक रूप से इस्तेमाल किया रेडियोधर्मी ligand बाध्यकारी परख और अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया लेबल मुक्त करने के लिए की तुलना में सेंसर तरीके, BLI रिश्तेदार सरल व्यवस्था के मामले में महत्वपूर्ण लाभ है, अप्रतिबंधित एसोसिएशन चरण, उच्च भर में, परख डिजाइन के करीब में vivo प्रणाली और एक छोटी राशि के मैटीरियल प्रोटीन की जरूरत (कुछ μg), और यह काइनेटिक डेटा5,6,20में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।

आदेश में अधिक से अधिक vivo स्थिति में अनुकरण करने के लिए, हम स्तनधारी छुरा अभिव्यक्ति प्रणाली से कार्यात्मक hEAG1 चैनल प्रोटीन शुद्ध । दोनों शुद्धि और अनुयाई स्तनधारी कोशिकाओं से व्यक्त आयन चैनल प्रोटीन की पहचान के लिए एक आसान और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । झिल्ली प्रोटीन के सफल शुद्धि के लिए कुछ महत्वपूर्ण सुझाव हैं: 1) शुद्धिकरण की प्रक्रिया या तो स्केल किया जा सकता है नीचे या स्केल-स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणालियों में ब्याज प्रोटीन की अभिव्यक्ति बहुतायत के अनुसार; 2) हम hEAG1 चैनल के सी टर्मिनस पर एक ध्वज टैग जुड़े विरोधी फ्लैग संबध मोतियों के साथ इस प्रोटीन की शुद्धि की सुविधा वाणिज्यिक किट और शुद्धि प्रोटोकॉल का उपयोग कर । एक electrophysiological माप प्रदर्शन किया है कि फ्यूजन झंडा इस चैनल के समारोह पर कोई प्रभाव नहीं है15; 3) विरोधी झंडा मोती और प्रोटीन के मिश्रण की मशीन धीरे झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात निकालने फ्लैग फ्यूजन प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए उपयोगी है; ) 4 समानता शुद्धि का उपयोग करना, हम एक बार परख प्रक्रिया के लिए 90% सेल प्रवाह के ऊपर के साथ ४ १५ सेमी व्यंजन से पर्याप्त hEAG1 आयन चैनल प्रोटीन प्राप्त कर सकते हैं ।

शुद्ध hEAG1 चैनल प्रोटीन अतिरिक्त बायोटिन (3-10 गुना) का उपयोग करके biotinylated और आगे BLI परख के लिए एसडी बफर के साथ समाधान बफर का आदान प्रदान कर रहे हैं । अतिरिक्त बायोटिन अधिक से अधिक एक झिल्ली चैनल प्रोटीन को संशोधित कर सकते है करने के लिए की सतह पर लेपित दक्षता वृद्धि हुई है, और BSA और Polysorbate 20 के कम सांद्रता युक्त एसडी परख बफर विशिष्ट बाध्यकारी9कम कर सकते हैं । इन प्रमुख आपरेशनों आगे बढ़ने के बावजूद, गैर आदर्श बातचीत अभी भी मौजूद सकता है विशेष रूप से जब छोटे अणु, जो गैर विशेष रूप से एसए सेंसर और परिणाम की सतह के लिए बाध्य कर सकता है की उच्च एकाग्रता के साथ एक बाध्यकारी अध्ययन प्रदर्शन चित्रा 4aमें दिखाया cyanine वक्र के रूप में झूठी-सकारात्मक बातचीत. इस प्रकार, एक दोहरे संदर्भ घटाव प्रोटोकॉल अभी भी गैर-संवेदक और छोटे अणु के बीच बातचीत सहित विशिष्ट bindings, छोटे अणु समाधान के साथ biotinylated hEAG1 प्रोटीन से घटाकर विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, और छोटे अणु समाधान के साथ सेंसर । इस दोहरे संदर्भ घटाव आपरेशन एक बार परख के लिए चार उपसेंसरों की जरूरत है । दो biotinylated झिल्ली प्रोटीन के साथ लेपित किया जाएगा और छोटे अणु और उसके बफर के साथ बातचीत परख आगे सेंसर । अंय दो सेंसरों एसडी बफर के साथ गीला हो जाएगा और छोटे अणु और उसके बफर के साथ बातचीत । केवल झिल्ली के संपर्क में प्रोटीन मैटीरियल वाला सेंसर और छोटा अणु सकारात्मक संकेत दिखाता है और बाकी तीन इंटरैक्शन संकेतों के नियंत्रण (चित्र 2) के रूप में काम करते हैं. इस प्रक्रिया का उपयोग करके, के रूप में चित्रा 3 और चित्रा 4में दिखाया गया है, हमारे परिणाम स्पष्ट रूप से hEAG1 चैनल प्रोटीन और रंज2 के बीच मजबूत बातचीत का प्रदर्शन और एक एकाग्रता निर्भरता प्रोफ़ाइल दिखाते हैं । यह कहा जाना चाहिए कि हमारे माप में कई सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, वहां कुछ अंय झिल्ली लिपिड जो शुद्ध चैनल प्रोटीन को बांध सकता है । इसके अलावा, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि क्या लंगर शुद्ध प्रोटीन अपने मूल अनुरूपता और गतिविधि रखने के लिए । यह बहुत छोटे अणु लिपिड के वास्तविक विन्यास को मापने के लिए जब वे प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए मुश्किल है । हालांकि विस्तृत प्रक्रियाओं अज्ञात हैं, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि BLI द्वारा बाध्यकारी कैनेटीक्स electrophysiological रिकॉर्डिंग द्वारा व्युत्पन्न उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं, जो उपंयास BLI आयन चैनल प्रोटीन के लिए आवेदन एक में छोटे अणु बातचीत बनाता है अनुपूरक तरीके से ।

संक्षेप में, हमारे अध्ययन की पुष्टि करता है कि यह कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली से शुद्ध करने के लिए अपनी लाइगैंडों के साथ सीधा संपर्क का पता लगाने के द्वारा एक विश्वसनीय रणनीति है । झिल्ली प्रोटीन के लिए BLI के सफल आवेदन-छोटे अणु संपर्क आयन चैनल दवा खोज में छोटे अणु स्क्रीनिंग और तंत्र अन्वेषण की सुविधा होगी ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम बायो-आईडी सेंटर और SJTU क्रॉस-अनुशासनात्मक अनुसंधान निधि में मेडिसिन एण्ड इंजीनियरिंग (YG2016QN66), चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१२७१२१७), और चीन के नेशनल बेसिक रिसर्च प्रोग्राम (2014CB910304) द्वारा समर्थित था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose Medium HyClone SH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x) HyClone SH30256.01
Fetal Bovine Serum Gibco 10270
Penicillin/Streptomycin Gibco 1697550
Cell Culture Dish Corning 430599 150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 Substitute Amresco E109
Sodium chloride BBI Life Sciences A610476
Potassium chloride BBI Life Sciences A610440
Bovine Serum Albumin BBI Life Sciences A600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate BBI Life Sciences A600560
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
3x FLAG peptide Sigma F4799
Octet-RED96 Pall/FortéBio 30-5048
Data Acquisition software Pall/FortéBio Version 7.1
Data Analysis software Pall/FortéBio Version 7.1
Biosensor/Streptavidin Pall/FortéBio 18-5019
Microtiter plate Greiner Bio-one 655209
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin ThermoFisher 21338
Centrifugal Machine ThermoFisher 75004250
PageRuler Prestained Protein Ladder ThermoScientific 318120
Ultrafiltration device MILLIPORE UFC503008 NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) Sigma P9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody Sigma F1804 1:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-2005 1:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay Kit Beyotime P0010
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04693159001
Amersham Imager 600 Imaging System GE Healthcare Bio-Sciences
Western blot system BIO-RAD

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References

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जैव रसायन अंक 133 बायो लेयर Interferometry (BLI) आयन चैनल प्रोटीन छोटे अणु प्रोटीन संबध शुद्धिकरण स्तनधारी स्थिर अभिव्यक्ति प्रणाली ह्यूमन EAG1 (hEAG1) चैनल ड्रग डिस्कवरी चिकित्सीय लक्ष्य ligand स्क्रीनिंग
जैव परत Interferometry परख द्वारा छोटे अणुओं के साथ एक आयन चैनल प्रोटीन के संपर्क कैनेटीक्स पर कब्जा
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Han, B., Zhang, M., Sun, P., Hou, S. … More

Han, B., Zhang, M., Sun, P., Hou, S. Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay. J. Vis. Exp. (133), e56846, doi:10.3791/56846 (2018).

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