Summary
Yüksek çözünürlüklü ultrason, hamilelik durumunu, gebelik yaşını ve gebelik kayıplarını belirleyerek zamanlanmış hamile fareler gerektiren deneyleri kolaylaştırmaya yardımcı olabilir. Burada sunulan, fare gebeliklerini ve hamileliği taklit edebilecek potansiyel tuzakları (görüntü yapıtları) değerlendirme yöntemlerini gösteren bir protokoldür.
Abstract
Fare, birçok insan hastalığı ve biyolojik süreç için tercih edilmiş memeli hayvan modelidir. Gelişimsel biyoloji genellikle çeşitli zaman noktalarında gelişen süreçleri belirlemek için aşamalı hamile fareler gerektirir. Ayrıca, model farelerin optimal ve verimli üremesi, zamanlanmış gebeliklerin değerlendirilmesini gerektirir. En yaygın olarak, fareler bir gecede çiftleşir ve vajinal bir fişin varlığı belirlenir; ancak, bu tekniğin pozitif tahmin değeri yetersizdir ve farenin gerçekten hamile olup olmadığını bilmek için beklemek gerekir. Yüksek çözünürlüklü ultrason biyomikroskop görüntüleme için etkili ve verimli bir araçtır: 1) Bir farenin hamile olup olmadığı; 2) Fare hangi gebelik aşamasına ulaştı; ve 3) rahim içi kayıpların olup olmadığı. Embriyolara ve fetüslere ek olarak, araştırmacı bunları gravid uterusla karıştırmamak için karın boşluğundaki ortak eserleri de tanımalıdır. Bu makalede, açıklayıcı örneklerle birlikte görüntüleme için bir protokol sağlanabilir.
Introduction
Fare, birçok insan hastalığı ve biyolojik süreçler için tercih edilen memeli modelidir1,2,3,4. Gelişimsel biyoloji alanındaki araştırmalar genellikle çeşitli zaman noktalarında gelişen süreçleri belirlemek için aşamalı-hamile fareler gerektirir5,6,7,8. Ayrıca, model farelerin optimal ve etkili üremesi, özellikle araştırmacılar bir gen mutasyonunun gelişim üzerindeki etkilerini incelerken, zamanlanmış gebeliklerin değerlendirilmesini gerektirir. Tipik olarak, araştırmacılar bir gecede heterozipöz fareleri çiftleşir, ertesi sabah erken saatlerde vajinal bir fiş arar ve bir hamileliğin9. Rahim içi kaybın belirlenmesi tipik olarak yenidoğan bir çöpü Genotiplerin Mendelian oranları için kontrol etmek, daha sonra çeşitli gebelik aşamalarında hamile farelerden ödün vererek geriye doğru çalışmak ve embriyoları geriye doğru kurtarmakla başlar. Araştırmacılar kilo alımını pozitif gebeliğin bir ölçüsü olarak belirleyebilirler10,11; bununla birlikte, özellikle genetik olarak tasarlanmış farelerde, kilo alımının belirgin olmayabileceği rahim içi kayıp olduğunda çöpler çok küçük olabilir ve daha sonra resorbed olabilir (özellikle hamileliğin başlarında, ~E6.5–8.5). Fare, örneğin iyi huylu bir karın tümörü nedeniyle yanlış hamile görünebilir. Özünde, kişi "kör" çalışır.
Yüksek çözünürlüklü ultrason biyomikroskop, gravid uterusun doğrudan görselleştirilmesine ve fare embriyolarının geliştirilmesine izin verir12,13,14,15,16. Başlangıçta embriyonik fare kardiyovasküler fizyolojisini değerlendirmek için yöntemler geliştirmemize rağmen16,17, fare ürememizi kolaylaştırmak için bu görüntüleme yönteminin yararını tanıdık. Özellikle, artık bir farenin hamile olup olmadığını "görmek" için beklemek zorunda kalmadık, bariz kilo alımına veya bir çöp teslimatına dayanarak; Gravid durumunu belirleyebilir ve baraj hamile değilse fareleri hızlı bir şekilde yeniden eşleyebiliriz. Ayrıca, rahim içi kayıplar da kolayca görüntülenebilir ve fareden ödün vermeden bir kayıp zaman çizelgesi belirlenebilir (şematik için Şekil 1'e bakın). Zaman, değerli model fareler ve fonlar böylece kurtarılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokoldeki tüm adımlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takip eder ve New York Üniversitesi Grossman Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Zamanlanmış gebelikler için farelerin çiftleşmesi
- Bir kafesteki uygun dişi fareyi (genellikle bir heterozygote) gece çiftleşme için uygun erkek fare (genellikle bir heterozygote) ile eşleştirin.
- Ertesi sabah fareleri ayırın. Alternatif olarak, dişi ve erkek fareleri sürekli çiftleşir, böylece hamilelik şansını artırır.
NOT: Bununla birlikte, doğru zamanlanmış bir gebelik alternatif ile garanti edilemez ve fare embriyolarının ultrason ile evrelemesi, özellikle hastalık süreci intrauterin büyüme geriliği ile sonuçlandığında net değildir. Gen varyantını taşıyan embriyoların küçük olduğu varsayılırsa, gebelik yaşını ölçmek için daha büyük wildtype çöp eşlerini arayın.- İsteğe bağlı: Vajinal tıkacı arayın. Vajinal fiş yoksa, dişi fare çiftleşmemiştir. Vajinal bir fiş varsa, dişi farenin hamile kalmaması hala muhtemeldir.
- Gece çiftleşmeden sonraki günü E0.5 olarak zaman.
- Hamileliği belirlemek için E6.5–E.8.5'te görüntüleme gerçekleştirin ve fare hamile değilse fareleri yeniden eşleyin (bkz. adım 1.1).
NOT: Bu aşamada, dişi baraj açıkça göze hamile değildir; bu nedenle, ultrason görüntüleme erken belirleme ve yeniden çiftleşme sağlar.
2. Anestezi ve fare hazırlanması
- Hamile fareyi anestezik indüksiyon odasına yerleştirin.
- İndüksiyon odasında hamile farenin yatıştırılmasını sağlamak için 1 L/dk akış hızında% 2-3 konsantrasyonda oda havası veya tıbbi oksijen ile izofluran karıştırın.
NOT: Sedasyon genellikle 1-2 dakika içinde gerçekleşir. Fare hareketsiz yatacak ve nefes alışı yavaşlamış olacak. - Fareyi görüntüleme platformuna hızla aktarın. Görüntüleme platformu genellikle fareyi sıcak tutmaya yardımcı olabilecek ısıtma elemanları dana sahiptir.
- Farenin burnunu anestezik burun kemiğine yerleştirin.
- İzofluran/oksijen karışımını görüntüleme platformu burunkonuna hızla yeniden yönlendirin. 1 L/dk akışta %2-%3 oranında izofluran sağlayın.
- Pençe sıkışması, kornea refleksi, solunum seviyesi ve herhangi bir hareketle sedasyon seviyesini belirleyin.
NOT: Kornea refleksi başlangıçta, fare uyuşturulurken kurumasını önlemek için gözlere nemlendirici merhem uygulanarak belirlenebilir (fare gözlerini kapatmaz). - Fare sırtüstü yatarken (sırtında), pençeleri görüntüleme platformunun elektrokardiyogram (EKG) pedlerine bantleyin.
NOT: Ancak, bu tür görüntülemeler için EKG gerekli değildir. - Kürkü hamile barajın karnından aşağıdaki gibi çıkarın:
- Karın kürkü, yanal kenarlara kadar dahil olmak üzere% 70 etanol ile iyice ıslatın. Platforma kaçacak kadar çok uygulamayın.
NOT: Etanol, su yerine tıraş yağı olarak daha iyi çalışır. - Karnı dikkatlice tıraş etmek için jilet kullanın. Meme uçlarını kesmemeye dikkat edin.
- Tıraş edilen kürkü karından gazlı bez veya bazı mendillerle silin.
- Alternatif olarak, kürklerin çoğunu çıkarmak için kürk makaslarını kullandıktan sonra bir depilatory krem kullanın.
- Karın kürkü, yanal kenarlara kadar dahil olmak üzere% 70 etanol ile iyice ıslatın. Platforma kaçacak kadar çok uygulamayın.
3. (Tahmin edilen) hamile farenin transabdominal görüntülenmesi
- Karın tıraş edildikten sonra, izofluranları% 1-% 1.5'e düşürün, hala 1 L / dk akış hızını koruyun. Sedasyon seviyesini solunum seviyesine ve herhangi bir hareketin yanı sıra pençe sıkışması ve/veya kornea refleksine göre izleyin.
NOT: Anestezi yapılan farenin kalp atış hızı, çekirdek (rektal) sıcaklığa bağlı olarak tipik olarak 400-500/dk olacaktır. Hızlı bir hamilelik kontrolü amacıyla, fareyi fizyolojik bir çekirdek sıcaklığına ısıtmayın; kalp atış hızı 400-450/dk'ya yakın olacaktır, ancak fare uzun süreli görüntüleme ile soğuduğunda düzensiz bir ritimle daha da düşebilir.- Daha da önemlisi, respirasyonların düzensiz veya ıstıraplı değil, derinlik ve düzenli olarak orta düzeyde olduğundan emin olun (nefes alma: derin, yavaş ve düzensiz, derin interkostal ve subkoztal geri çekmelerle).
NOT: Havalandırılmayan, uyuşturulmuş farenin solunum hızı tipik olarak 60-100/dk olacaktır https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html.
- Daha da önemlisi, respirasyonların düzensiz veya ıstıraplı değil, derinlik ve düzenli olarak orta düzeyde olduğundan emin olun (nefes alma: derin, yavaş ve düzensiz, derin interkostal ve subkoztal geri çekmelerle).
- Karın bölgesine ultrason (akustik kavrama) jelini cömertçe uygulayın.
- Görüntüleme dönüştürücüsünü yatay bir düzlemde yönlendirmek için karın üzerine yerleştirin: görüntüleme sisteminde sol-sağ yönelim elde etmek için probu yönlendirin; görüntüleme probunun yan tarafında belirtilen "nokta" veya sırt sağa bakacak şekilde olmalıdır.
NOT: Görüntüleme probını farenin sağına kaydırmak, ultrason sistemindeki ilgili görüntüyü farenin sağına kaydırmalıdır (farenin kuyruğundan "yukarı" baktığınızı düşünün - farenin sağı monitörde kalacaktır).- Tipik olarak, görüntüleme sisteminin dönüştürücü montaj ve ray manipülatör sistemini kullanın. Burada, görüntüleme dönüştürücüslerinin elle tutulduğu (iki el birden daha sabittir) ve karın çevresinde daha hızlı hareketlere izin veren "serbest el" görüntüleme kullanılmıştır. Bu hareketler, aşağıda özetlenecek gibi, hem rotasyonel hem de çevirisel hareketleri içerir. Ancak, bu daha fazla pratik gerektirir.
- Ekranda mesaneyi tanımlayın (Video 1).
- Mesaneden kaudally tarama, vajinayı tanımlamak. Daha sonra, kraniyal yönde yavaşça ve sorunsuz bir şekilde tarama yaparak, vajinanın sol ve sağ rahim boynuzlarına çatallanmasını tanımlayın (Şekil 2; Video 1).
- Uterusun (sol ve sağ rahim boynuzları) incelenmesine başlayın13 (Şekil 3; Video 2).
NOT: Orta gebelik (E10.5 veya E11.5) kadar fare embriyoları sağ ve sol çevreler boyunca konumlandırılacaktır. Büyüdükçe, uterusun daha distal kısımları ve bunlara karşılık gelen embriyoları dışa ve arkaya dönecektir. Embriyolar daha da büyüdükçe (E15.5 ve daha sonra, genellikle), fare fetüsleri neredeyse rastgele çeşitli yönlere yerleştirilecek ve bir uterusu proksimalden distal'e "izlemek" zorlaşır.- Bir farenin hamile olup olmadığını kontrol etmek için hızlı bir şekilde tarayın. Bu hızlı yöntem sadece gravid uterus ve fare embriyolarının tanınmasıni gerektirir.
- Alternatif olarak, her rahim boynuzundaki embriyoları (canlı, ölü, resorbed) numaralandırmak için ekstra zaman ayırın.
NOT: Genel olarak, canlı bir embriyo kalp, uzuvlar, ventriküllü kafa ve gözler gibi farklı organlar sergiler. Ölü bir embriyo, sadece ölmediği sürece homojen, "duygusal" bir görünüm alır. Resorbed embriyolar gravid görünümlü bir uterusun ortasında kesin bir ekojenik noktaya sahiptir (Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7, Şekil 8). - Bir embriyonun gerçekten hayatta olup olmadığını belirlemek için kalp atışını ve/veya kan akışını arayın.
NOT: Renk Doppler akış haritalaması, hem embriyoda hem de göbek kordonunda kan akışının varlığını belirlemeye yardımcı olabilir. Genel olarak bu E8.5'ten büyük embriyolara uygulanabilir. - Gravid uterusu taklit edebilecek potansiyel eserleri tanıyın (Şekil 9, Şekil 10). Ek olarak, bağırsak gazı ve diğer ultrason "gölge" eserleri rahim boynuzu segmentlerini gizleyebileceğinden, uterusun yeterli görselleştirilmesini sağlamak için görüntülemeyi birden fazla bakış noktasından gerçekleştirin.
- Anket tamamlandıktan sonra, jeli karından gazlı bez veya mendille silin. Jel fareyi soğutma eğiliminde olduğu sürece mümkün olduğunca çıkarmaya çalışın.
- Pençeleri çıkarın ve fareyi anestezik burun kafesinden çıkarın.
- Fareyi yavaşça kafesine geri hareket ettirin. Uyanıp bir dakika içinde hareket etmeye başlamalı.
NOT: Genetiği değiştirilmiş farelerin anesteziden kurtulması biraz daha uzun sürebilir ve daha yakından izlenmesi gerekebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, bir araştırmacının erken aşamalar da dahil olmak üzere bir farenin hamile olup olmadığını güvenle belirlemesine ve hamile barajını feda etmeye gerek kalmadan doğum öncesi embriyonik veya fetal kayıpların olup olmadığını belirlemesine izin verecektir. Bu protokol özellikle genetik olarak tasarlanmış fareleri yetiştirirken yararlıdır; tipik olarak, homozigot yavrular elde etmek için heterozipöz x heterozipöz haçlar, doğum öncesi ölümcüllüğe neden olan uygun gelişimin başarısız olmasına yol açar. Şekil 1 embriyoların giderek öldüğü ve daha sonra orta gebelik yoluyla resorbed edildiği temsili bir durumu tasvir eder. Şekil 2, vajinayı çatallanma yoluyla takip ederek sol ve sağ rahim boynuzlarının nasıl bulunup, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7, Şekil 8ve Video 3, fare embriyolarını gelişimin çeşitli aşamalarında gösterir. Erken evre fare embriyoları, ölü embriyolar veya resorbed embriyolar karındaki diğer organlara veya bağırsaklardaki dışkıya benzeyebilir veya tersine bağırsak döngüleri gravid olmayan uterusu taklit edebilir. Şekil 9 ve Şekil 10, video 4 ve Video 5, araştırmacının uyanık olması gereken gravid uterusu taklit edebilecek bu tür potansiyel görüntüleme yapıtlarını göstermektedir.
Şekil 1: Teorik bir hamile fare karnının şematik diyagramı, E11.5'te, sonra tekrar E14.5'te. Orta gebelik (E10.5 veya E11.5) kadar, fare embriyoları karnın sağ ve sol çevresel yönleri boyunca konumlandırılacaktır. Embriyolar büyüdükçe, uterusun daha distal kısımları ve karşılık gelen embriyoları dışa ve arkaya dönecektir. Embriyolar daha da büyüdükçe (E15.5 ve daha sonra, genellikle), fare fetüsleri neredeyse rastgele çeşitli yönlere yerleştirilecek ve bir uterusu proksimalden distal'e "izlemek" zorlaşır. Genetik olarak tasarlanmış bir fare modelinde doğum öncesi öldürücülük olduğunda, embriyolar (açık daireler) ölebilir; ölü embriyolar (yumurtadan çıkan daireler) sonunda resorbed (katı daireler) olacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Biri vajinayı bulduğunda (A), mesanenin hemen sağında, kranially süpürme, bifurkasyonu (B) sağa ve sol rahim boynuzlarına (D) –(F)gösterecektir.
Ölçek çubuğu (A) = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Gravid olmayan (hamile olmayan) uterusun görüntüleri (ok sıraları ile tanımlanır). Uterusun kalınlığı değişebilir: daha kalın (A), (B), (E); merkezi ince ekojenik çizgili ince(C), çok ince (D) veya hatta concepti (B) ve (E) ile karıştırılmaması gereken küçük, kistik yapılar içerebilir, ancak bunun belirlenmesi zor olabilir. (A) sağ rahim boynuzudur; Bağırsak gazı nedeniyle deneyimlerimizde bunu takip etmek daha zordur. (B)–(F) sol rahim boynuzlarıdır; (F) oldukça distal / yanal ve bu nedenle artan bağırsak gazı yapıtı nedeniyle görüntü daha zor hale gelir. Ölçek çubuğu (A) = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Resorbed ve ölü embriyolar farklı görünümlere sahiptir. Çok yaygın olarak bulunan resorbed embriyolar, merkezi bir ekojenik (çok parlak) "nokta" dışında nispeten homojen görünen yuvarlak (gravid) bir rahim kesesi içinde kaplanır —(A) ve (B)okları). (C) resorbed veya ölü embriyoları gösterir; uterusta tamamen homojen, "lapa gibi" bir görünüm vardır ve bu çerçevede muhtemelen 3-4 ölü embriyo görüyoruz. (D) hala bazı yapıları gösteren yakın zamanda ölmüş bir embriyo gösterir; Amniyotik kesede hücresel döküntüler de var gibi görünüyor. In (E), ölü embriyo çok küçülmüş ve hala plaseta bağlı ("P"). (F) muhtemelen 1-2 gün önce ölen, ancak henüz tamamen resorbed olmayan bir embriyonun homojen, "lapa gibi" bir görünümünü gösterir. (A) ve (D) = 2 mm için ölçek çubuğu.
Şekil 5: Erken evre embriyolar, yaklaşık E5.5 (A) ve E6.5 (B) ila E8.5 ((C) ve (D) arasında. Görünümlerde farklılıklar vardır ve buradaki tahmini aşamalar çiftleşmenin zamanlamasına ve embriyoların kendilerinin görünümüne dayanıyordu. Ölçek çubuğu (A) = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: E9.5 embriyoları E8.5 embriyolarından oldukça büyüktür ve oluşmaya başlar. Bitişik embriyoları gösteren temsili görüntüler (A) ve (B) olarak gösterilir. Ölçek çubukları = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: E10.5 embriyoları baş, omurga ve kalp gibi daha net organlar sergiler. Bitişik embriyoları gösteren temsili görüntüler tüm panellerde gösterilir; (D),ölü/resorbing embriyosu canlı embriyoya bitişiktir. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Daha eski embriyolar, yaklaşık E12.5 (A), E14.5 (B) ve E15.5 (C). Eğik görüntüleme düzlemleri hassas anatomiyi biraz gizler, ancak kalp (ok) her embriyonun orta kısmındadır; in (C), miyokard artık kandan daha ekojeniktir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Rahim ile karıştırılma olasılığı en fazla olan organ olan bağırsak. In (E), resorbed embriyo (ok uçları) bağırsak (oklar) bir segment overlies. In (F), gravid olmayan bir uterus (ok uçları) kısa bir bağırsak segmentini (oklar) abartır Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Gravid karın ek görüntüleme eserleri böbrekler, dalak ve karaciğer içerir. (A) Sağ böbrek; (B) Böbrek atardamarı (oklar) ile sağ böbrek; (C) Sol böbrek; (D) Böbrek atardamarı (oklar) ile sol böbrek; (E) Dalak; (F) Karaciğer bir bağırsak segmentini aşırı; (G) Bağırsak böbrek overlying segmenti; (H) Dalak, karaciğer ve sol böbrek bir görüntüleme düzleminde görülür. B = bağırsak; K= böbrek; L= karaciğer; S= dalak. Ölçek çubuğu (A) = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Görüntülemenin en önemli ilk adımı vajinayı tanımlamak ve daha sonra rahim boynuzunun sola ve sağa çatallanmasını belirlemektir. Her rahim boynuzu takip ederek, görüntüleyicinin bağırsak döngülerini uterus olarak yanlış tanımlama olasılığı daha düşüktür. Ayrıca, bağırsak görünümündeki varyasyonları anlamak (dışkı maddesi olan / olmayan) bunları uterustan ayırt etmek önemlidir; bazen, bağırsak halkalarındaki dışkı "topları" gravid (hamile) uterusu taklit edebilir. Diğer yazarlar gebelik tanısını ve fare embriyonik gelişiminin evrelenmeyi tanımlamış olsalar da17,18,19 resorbe embriyoların tespiti de dahil olmak üzere20, bu çalışma gravid murine uterusun görüntülenmesinde adımları ve potansiyel tuzakları özetleyen ilk çalışmadır.
Görüntüleyici, erken bir hamileliği veya gravid uterusu taklit edebilecek veya uterus ve embriyoların görüntülenmesini engelleyebilecek potansiyel eserleri tanımalıdır. Rahim boynuzlarını yanal olarak takip etmek, karındaki diğer organların ve eserlerin uterus (ve küçük embriyolar) için yanlış anlama olasılığını azaltacaktır. Rahim, embriyolar ve/veya obstrüktif maddelerle karıştırılabilecek potansiyel eserler arasında bağırsak ve bağırsak gazı, dışkı, dalak, karaciğer ve mide bulunur.
Bu yöntem genel anestezi gerektirir ve anesteziye bağlı rahim içi kayıp olasılığını azaltmak için şu sınırlamaya dikkat ediyoruz: 1) görüntüleme süresi ve 2) gebelik kontrollerinin sıklığı. Anestetikler ve analjezikler hamilelik sırasında genel olarak güvenli görünse de21, önemli maruziyet fare embriyonik büyümesi üzerinde sonuçlar doğurabilir22. Fare nakavt modelleri genellikle doğum öncesi veya erken perinatal ölümü gösterdiğinden, embriyoların bu görüntüleme sırasında genel anesteziye maruz kalması (en azından teorik olarak) ölüm risklerini artırabilir veya biyolojilerini bilinmeyen şekillerde etkileyebilir. Mutlak bir zaman sınırı bilinmemekle birlikte, her görüntüleme seansını en fazla 15 dakika ve gebelik başına 2-3 görüntüleme seansı (maksimum) ile sınırlamaya çalışıyoruz. "ALARA ilkesi" burada ihtiyatlıdır: Makul Ulaşılabilir Kadar Düşük.
Bu yöntem, daha verimli üremenin yanı sıra rahim içi ürünmenin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu, özellikle erken ölen nakavt modellerinin kullanılarak yapılan deneylerde önemlidir; diğer örnekler toksikolojik çalışmaları içerir. Birkaç çalışma hamilelik sırasında kilo alımını detaylandırmış olsa da, erken kilo alımının (E8.5'ten önce) küçük olduğu ve günlük kilo değişimlerinden farklı olmayabileceği oldukça açıktır. Ayrıca, veriler sadece ilk kez hamile farelerden elde edilmiştir ve çok gravid farelerin şaşırtıcı etkilerini yansıtmayabilir10,11. Süreli gebelikler erken dönemde belirgin olmayabilir ve özellikle genetik olarak tasarlanmış farelerde rahim içi kayıplar yaygın olabilir ve hatta tüm çöpü etkileyebilir. Bu nedenle, bir farenin bir çöp teslim etmemesi, asla hamile olmadığı anlamına gelmez. Dişi hamile değilse fareler bir hafta içinde yeniden çiftlenebilir; aksi takdirde, araştırmacılar dişinin hamile olup olmadığını görmek için beklemek zorunda kalacaktır. Sadece hamilelik için kontrol etmek yerine daha fazlasını yapmak için beceriler geliştirildikten sonra, bu yöntem hamilelik ilerledikçe embriyoların haritalandırılmasına ve izlenmesine de izin verecektir. Bu şekilde, embriyo hasadı için en uygun zamanlama, dokuların23'ünsinen önce toplanması gerekip gerekmemesi gerektiği belirlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | |||
| Ethanol, 70% | |||
| Fur clippers | |||
| Gauze or KimWipes | |||
| Isoflurane | |||
| Medical oxygen (optional) | |||
| Medical tape | |||
| Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform) | Fujifilm Visual Sonics | Various | Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe |
| Razor blade (not a safety razor) | |||
| Scale (to weigh mouse) | |||
| Ultrasound gel |
References
- Bogue, M. A., et al. Mouse Phenome Database: an integrative database and analysis suite for curated empirical phenotype data from laboratory mice. Nucleic Acids Research. 46, 843-850 (2018).
- Ito, R., Takahashi, T., Ito, M. Humanized mouse models: Application to human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3723-3728 (2018).
- Law, M., Shaw, D. R. Mouse Genome Informatics (MGI) is the international resource for information on the laboratory mouse. Methods in Molecular Biology. 1757, 141-161 (2018).
- Rydell-Törmänen, K., Johnson, J. R. The applicability of mouse models to the study of human disease. Methods in Molecular Biology. 1940, 3-22 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Reviews of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- Tam, P. P. L., et al. Formation of the embryonic head in the mouse: attributes of a gene regulatory network. Current Topics in Developmental Biology. 117, 497-521 (2016).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Letters. 590 (22), 3965-3974 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Selecting female mice in estrus and checking plugs. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (8), (2016).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Finlay, J. B., Liu, X., Ermel, R. W., Adamson, T. W. Maternal weight gain as a predictor of litter size in Swiss Webster, C57BL/6J, and BALB/cJ mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 694-699 (2015).
- Zhou, Y. Q., et al. Applications for multifrequency ultrasound biomicroscopy in mice from implantation to adulthood. Physiological Genomics. 10 (2), 113-126 (2002).
- Ji, R. P., Phoon, C. K. L. Noninvasive localization of nuclear factor of activated T cells c1-/- mouse embryos by ultrasound biomicroscopy-Doppler allows genotype-phenotype correlation. Journal of the American Society of Echocardiography. 18 (12), 1415-1421 (2005).
- Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-117 (2006).
- Mu, J., Slevin, J. C., Qu, D., McCormick, S., Adamson, S. L. In vivo quantification of embryonic and placental growth during gestation in mice using micro-ultrasound. Reproductive Biology and Endocrinology. 6, 34 (2008).
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H.
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Ultrasound biomicroscopy-Doppler in mouse cardiovascular development. Physiological Genomics. 14 (1), 3-15 (2003).
- Peavey, M. C., et al. A novel use of three-dimensional high-frequency ultrasonography for early pregnancy characterization in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (128), e56207 (2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), 77205 (2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kühl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38 (2014).
- Norton, W. B., et al. Refinements for embryo implantation surgery in the mouse: comparison of injectable and inhalant anesthesias - tribromoethanol, ketamine and isoflurane - on pregnancy and pup survival. Laboratory Animal. 50 (5), 335-343 (2016).
- Thaete, L. G., Levin, S. I., Dudley, A. T. Impact of anaesthetics and analgesics on fetal growth in the mouse. Laboratory Animal. 47 (3), 175-183 (2013).
- Phoon, C. K. L., et al. Tafazzin knockdown in mice leads to a developmental cardiomyopathy with early diastolic dysfunction preceding myocardial noncompaction. Journal of the American Heart Association. 1 (2), (2012).
