Summary
カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着毛状突起の便利で高スループットの分離と濃縮のためのプロトコルが提示されています。このプロトコルは、液体窒素、ドライアイス、ナイロンふるいのみを使用したトリコームの乾燥した非緩衝抽出に基づいており、RNA抽出およびトランスクリプトーム解析に適しています。
Abstract
この論文は、 カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着性毛状突起の便利でハイスループットな分離と濃縮のためのプロトコルを提示します。カンナビノイドと揮発性テルペン代謝の生合成経路は主に 大麻 トリコームに局在しており、単離されたトリコームはトランスクリプトーム分析に有益です。トランスクリプトームの特性評価のために腺毛状突起を単離するための既存のプロトコルは不便であり、毛状突起ヘッドが損なわれ、孤立した毛状突起が比較的少量になります。さらに、RNA分解を避けるために、タンパク質阻害剤を含む高価な装置と分離媒体に依存しています。本プロトコルは、3つの個別の修飾を組み合わせて、 それぞれC. sativa 成熟雌花序および扇形葉から大量の単離された腺頭状茎および固着毛状突起を得ることを示唆している。第1の改変は、マイクロシーブを通るトリコームの通過を容易にするために、従来の単離媒体を液体窒素に置き換えることを含む。2番目の変更では、ドライアイスを使用してトリコームを植物源から切り離します。第3の変更は、細孔サイズが減少する5つのマイクロシーブに植物材料を連続して通過させることを含む。顕微鏡イメージングは、両方のトリコームタイプに対する分離技術の有効性を示しました。さらに、単離されたトリコームから抽出されたRNAの品質は、下流のトランスクリプトーム解析に適切でした。
Introduction
腺毛状突起は、多くの二次代謝産物1を含む植物に存在する毛のような構造であり、新しい生合成遺伝子と酵素の貴重なバンクを表しています2。大麻では、重要な二次代謝産物であるカンナビノイド3とテルペン4の生合成が毛状突起に局在しています。薬用と娯楽用の両方で大麻の品質を決定する上での毛状突起の役割を考慮すると、毛状突起遺伝子発現の研究は興味深いものです。トリコーム特異的遺伝子の発現を特徴付けるには、まず目的のトリコームを単離する必要があります。トリコーム分離プロトコルは、早くも1992年に最初に記述されました5、そしてそれらの最新の開発は最近レビューされました2。一般に、トランスクリプトミクス特性評価のために腺トリコームを抽出するためのプロトコルは、2つの異なる連続ステップに分けることができます。最初のステップは、植物組織からの毛状突起の徹底的な物理的分離を含む。この工程は、ドライアイス5、ガラスビーズを市販の装置6,7を用いて、メッシュ篩8に対して植物材料を粉砕するか、または単離緩衝液9中で植物組織をボルテックスすることによって行うことができる。2番目のステップでは、関心のあるトリコームを微視的な植物残渣および/または他のトリコームタイプからより洗練された分離します。このステップは、密度勾配遠心分離8、10または様々なサイズの篩7、9を用いて実行することができる。処理された組織中のRNAは分解剤に対して極端に敏感であるため、これらの2つの連続したステップは通常、氷冷分離媒体中で、多くの場合タンパク質阻害剤の存在下で行われます4。
従来のトリコーム分離プロトコルでは、氷冷温度に加えて、効率的な抽出手順を確保するために大量の分離媒体が必要です。これらのコンポーネントの組み合わせにより、高スループットを妨げる、困難で時間のかかる絶縁プロセスが発生します。したがって、簡単でユーザーフレンドリーな代替のトリコーム分離プロトコルを提示することは、トリコームの特性評価に関連するさまざまな側面にとって有益である可能性があります。本論文は、従来のプロトコルのいくつかの要素を組み合わせて統合することにより、大麻サティバから茎および固着腺頭状毛状突起を分離するための代替プロトコルを提供することを目的としています。これらの要素には、ドライアイス5、細孔径7,9の減少を伴ういくつかのマイクロシーブを通るトリコームの通過、および隔離媒体8の液体窒素(LN)の置換が含まれます。
本トリコーム分離プロトコルの新規性は、従来のプロトコルと比較して、多くの点で提示される。このプロトコルは、危険なコンポーネントを必要としないため便利です。この手順は、最小限の予防措置でラボで実施でき、高スループットを促進します。標準的な液体分離媒体の代わりにLNを使用することで、単離プロセス全体を通してトリコームの完全性が保証され、その後のトランスクリプトーム解析が可能になります。LNとドライアイスが昇華すると、孤立したトリコームには有害な残留物がなくなります。さらに、LNは室温で昇華する傾向があるため、プロトコル全体で寛大な使用が可能になります。対照的に、従来の単離媒体を大量に使用すると、その取り扱いに実際的な困難が生じます。最後に、このプロトコルは、腺毛状突起の残りの壊れやすい頭部構造からの椎間板細胞の分離を減少させ、ヘッドスペースコンテンツの保持を可能にする。
このプロトコルは、 C. sativa glandular capitate trichomesを単離する技術的実践を支援するように設計された詳細なステップバイステップの方法で提示されます。このプロトコルは、下流の分子分析に適した高濃度および高純度の単離されたトリコームをもたらす管理可能なワークフローを提供します。
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Protocol
注:この研究で使用された植物材料は、他の場所に記載されているように、イスラエルのボルカニセンターで栽培された4つの C.サティバ ARO-Volcani株(CS-11、CS-12、CS-13、およびCS-14)で構成されていました11。腺頭状茎毛状突起は成熟開花花序から単離され、腺頭状固着性毛状突起は成熟非開花母植物からの大きな扇状葉から単離された。すべての植物材料は摘みたてで、すぐに-80°Cで保存されました。
注意: ドライアイスとLNはプロトコル全体で使用されています。これらの物質は非常に危険です。孤立した毛状突起には、密閉されたチューブに挿入すると危険なガス圧を発生させる可能性のあるドライアイス粒子が含まれている可能性があります。したがって、すべてのキャップに針を刺す必要があります。極低温での取り扱いには、保護ゴーグル、適切なラボウェア、および手袋を使用することを強くお勧めします。
1.植物材料からの毛状突起の初期分離のためのセットアップ
- 5 Lのプラスチック容器にハンマーと硬い平らな物体を使用して、ドライアイスブロックを小さな細かいフレークに粉砕します。
- 粉砕されていないドライアイスから細かいドライアイスフレーク(5 mm未満)を大きなストレーナー(5 mm未満の細孔を介して )で別の5 Lプラスチック容器にふるいにかけます。約200 cm3 (200 mLマーク)のドライアイスフレークを直立した1 Lガラスビーカーに注ぎます。
- 砕いたドライアイスの最初の層の上に最大10 gの冷凍 C.サティバ 花序(これからは植物材料と呼びます)を加え、細かく砕いたドライアイスの200 cm3 の追加層で覆います。
- 1 Lガラスビーカーの開口部を2〜3層の1 mm網戸蚊帳で覆い、輪ゴムでガラスカップの外側に固定します(図1)。
- LNを大きな丸底のステンレス鋼容器( 材料表を参照)に注ぎ、そこで孤立した毛状突起を収集します。
- 小麦粉ふるい/ふるいストレーナーに350μmメッシュを挿入して、小麦粉ふるいメッシュを下から覆います(図2)。取り外し可能なプラスチックリング付きの小麦粉ふるいが利用可能な場合は、350μmのメッシュを挿入して、小麦粉ふるいのメッシュの下に固定します。そうでない場合は、350μmのメッシュを輪ゴムで小麦粉ふるいの周囲に固定します。
- LNで満たされた大きな丸底のステンレス鋼容器の上に小麦粉ふるいを置きます(図3)。丸底ステンレス鋼容器の外側のふるいにかけられた塊の損失を最小限に抑えるために、容器の幅が小麦粉ふるいの幅を超えていることを確認してください。
2.植物材料からの毛状突起の分離
- 大きなソルトシェーカーを使用するかのように、開口部が小麦粉ふるいに向かって下を向いた状態で1Lグラスを振ってください(図4)。
- 小麦粉のふるいに蓄積した砕いたドライアイスと植物材料をふるいにかけることができるように、2〜3分ごとに1 Lのガラスビーカーを取っておきます。
- 小麦粉のふるいを水平にふるいにかけ、下の丸底ステンレス鋼容器内のLNへの植物材料の通過を容易にします。
- LNをステンレス容器に加え、レベルが低くなったら1Lのガラスビーカーに砕いたドライアイスを入れます。小麦粉ふるいの植物材料が枯渇したら、ガラスビーカーの使用済み植物材料にさらに10 gの新鮮な植物材料を補充します。補充は通常、2回以上繰り返す必要はありません。
- 十分な量の濃縮トリコームが丸底のステンレス鋼容器に集められるまで、手順2.1〜2.4を繰り返します。一般に、RNA抽出とトランスクリプトーム解析には20 gの新鮮な植物材料で十分です。
- LNに沈めたステンレス容器の底に白い粉末状の物質(植物の破片、腺の毛状突起、砕いたドライアイスからなる)があることを確認します。顕微鏡観察は、十分な量の毛状突起が収集されたかどうかを判断するのに役立ちます。ただし、この手順を実行すると、プロトコルのフローが妨げられる可能性があります。通常、ほとんどの分離には10〜20 gの初期植物材料で十分です。ただし、植物の毛状突起密度には違いがあるかもしれません。
注: この時点から、実験を一時停止し、後で再開できます。短時間休止する場合は、毛状突起が水没したままになるように、十分な量のLNを追加する必要があります。あるいは、トリコームを収集し、ステップ5で説明したように、後で使用するために最大3か月間-80°Cで保管することができます。
3.球根状および膀胱状毛状突起、および破片などの他の毛状突起タイプからの腺頭状毛状突起(茎および固着)の分離
- 清潔な小さな丸底のステンレス鋼容器に少量のLNを追加します。
- メッシュサイズ150μmの40cm×40cmのマイクロシーブを2回折り、20cm×20cmの折り目になるようにして開きます。円錐形に似ていることを確認します(図5)。
- メッシュコーンを丸底のステンレス鋼容器の端に1つまたは2つの洗濯はさみで固定し、コーンの開いた部分が直立し、その尖った部分が部分的にLNに沈むようにします。
- LNとステップ2.6の白色粉末状物質をマイクロシーブコーンにそっと注ぎます。
- 幅の広いブラシをそっと当てて、残っている植物材料を集めて、最初の容器から150μmのメッシュコーンに移します。
- 最初の容器にさらにLNを追加し、すべての植物材料がマイクロシーブコーンに移されるまでブラッシング動作を繰り返します。
- 洗濯はさみを容器の蓋から慎重に取り外し、マイクロシーブコーンを開いて、トリコームが開いたマイクロシーブの中央に配置されるようにします。マイクロシーブの四隅をすべて一緒に保持して、毛状突起を含む中央部分がLNに沈んだままになるようにします(図6)。
- マイクロシーブの四隅すべてを保持しながら、ティーバッグを注入するようにスチール容器内のLNにマイクロシーブをゆっくりと浸して振る。このディッピング/シェイク(垂直および水平)の動きを1分間続けます。分離の質と量の間にはトレードオフがあります。浸漬動作が長くなると、毛状突起の量が増える可能性がありますが、分離グレードが低くなる可能性があります。全体として、質と量の両方に対して適切なものとして1分をお勧めします。
注:このふるい分け動作はプロトコルの最も重要な部分であり、それに応じて実行する必要があります。 - オプション:マイクロシーブの中央に包まれているふるいにかけられていない植物の破片と大きな毛状突起(まだLNに沈んでいる)を13 mLまたは50 mLの試験管にすくい取り、将来の使用のために-80°Cで保管します。
注意: (ドライアイスとLN残留物からの)圧力ガスの蓄積を避けるために、滅菌針で試験管のキャップに穴を開けてください。キャップは、圧力が下がったら、通常は24時間後に交換できます。
4.細孔径が小さくなるマイクロシーブにトリコームを通す
- 小さな丸底ステンレス鋼容器の底にあるLNに沈めたふるいにかけた毛状突起を、手順3で提示したのと同じ方法で、細孔サイズ(105 μm、80 μm、65 μm、および50 μm)を小さくしたマイクロシーブに順次移します。
5.希望する毛状突起の収集
- LNに沈めた目的の毛状突起を取り除き、事前に冷やした(LN中)スプーンを使用して50μmマイクロシーブで包みます。きれいな皿の上に置きます。
注:この最終分離段階では、目的の毛状突起がふるいから収集されます。 - 粉末状の毛状突起を、事前に冷却したスパチュラまたはチューブに挿入したスクープラ を介して 、ラベルの付いたプレチルド1.5 mLチューブにすばやく移します(図7)。さらなる研究のために、チューブをすぐに-80°Cで保管してください。
メモ: 絶縁プロトコル全体を示す概略ワークフローチャートを 図8に示します。
6. 精製された毛状突起の観察と分析
- 少量(10 mg)の分離された毛状突起を、予冷した(LN経由 の)ヘラを使用して顕微鏡スライドに置きます。一滴の水を加え、染色せずに光学顕微鏡で直接観察します。低倍率(10倍)と高倍率(40倍)を使用して、全体的な分離と汚染の程度を評価します。富化は、 図9に示すように、非毛状突起組織に対する毛状突起の相対量によって視覚的に推定される。
- 50 mgの単離された C.サティバ 腺頭蓋骨茎および固着性毛状突起からRNA抽出および品質分析を実行します。
注:RNA抽出には、mRNA精製のポリAベースの戦略を採用した市販の抽出キット( 材料の表を参照)が使用されました。- 単離された毛状突起の50mgを溶解溶液に再懸濁し、30秒間渦巻き、35kHzの氷冷超音波洗浄ユニットで5分間超音波処理し、メーカーのプロトコルに従ってサンプルからmRNAを抽出する( 材料表を参照)。
- トリコームから抽出されたRNAの完全性を推定するには、ラボオンチップシステムを使用して、RNA濃度、総量、およびRNA完全性数(RIN)値を決定します(材料の表を参照)。
- トリコーム画分のRNAseq分析を実行します(オプション)。配列決定されたリードのRNAseq解析およびバイオインフォマティクス解析は、標準的なアウトソーシングサービスで実行できます
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Representative Results
従来のトリコーム分離プロトコルと比較してこのプロトコルに含まれる主な変更は、標準の分離媒体をLNに置き換えることです。単離媒体としてLNを使用すると、サンプルがLNに沈んでいる限り、代謝分解が起こりにくいため、ワークフローを緩和できます。さらに、このプロトコルは、従来のトリコーム分離媒体で使用される危険な成分(すなわち、オーリントリカルボン酸およびβ-メルカプトエタノール)を回避するため、作業は化学フードに限定されません。それでも、ドライアイスやLNを取り扱う際には、必要な予防措置を講じることが重要です。
本プロトコルの利点を評価するために、本プロトコルからのトリコーム分離結果を、従来のトリコーム分離手順(トリコーム分離に水性バッファー、ガラスビーズ、および微細篩を使用)12を使用して得られた結果と比較しました。光学顕微鏡検査によるさまざまな分離段階からの成分の比較は、分離プロセスが進むにつれてトリコーム分離度が増加することを示しています。単離プロセスの初期段階(105〜150μmマイクロシーブ)では、ほぼ完全に孤立した毛状突起で構成されていた最終単離生成物とは対照的に、葉組織の断片が孤立した部分で優勢でした(図9A)。単離されたサンプルに汚染がないことを検証するように注意する必要があります(図9B)。
この研究では毛状突起密度は定量化されなかったが、最終単離ステップにおける単離された腺頭状茎および固着性毛状突起の品質を図10で観察することができる。純度は、従来のプロトコル12(図10C)を用いたトリコーム単離で得られたものと比較することができる。現在のプロトコルでは、繊細な茎の毛状突起の頭の構造が保持され、孤立した茎の毛状突起の頭全体が見えますが(図10D)、従来のプロトコルでは、完全な毛状突起の頭の構造が欠落しており、椎間板細胞のみが存在します(図10E)。ドライアイスとLNを使用することで、抽出できる植物材料の限界がなくなるため、収量も大幅に増やすことができます。当社の非水性プロトコルの追加の利点は、ドライアイスとLNのみを使用するため、蒸発後に分離媒体の残留成分が残らないことです。LNを使用すると、毛状突起13の凝集につながる可能性のある粘着性の二次代謝産物の放出が防止されます。本プロトコールでは、最終単離工程で単離された毛状突起は、乾燥微粉末として回収された。
本プロトコル全体で維持される極低温は、従来のバッファー媒体でRNAの分解を防ぎ(サンプルが水没している限り)、下流の分子アプリケーションを容易にするのに十分である可能性があります。この仮定を検証するために、単離されたトリコームからRNAを抽出し、市販のキットを使用してRNAの完全性を推定しました。得られた高いRIN値(9.4〜10)および明確なゲルクロマトグラフィー(図11)は、高いRNA完全性を明確に示しています。RNAサンプルをRNAseqでさらに分析し、すべてのライブラリから>20 Mの高品質リードを取得しました。
実際に、単離された毛状突起画分からのmRNAが毛状突起発現遺伝子に富んでいることを検証するために、花序および対応する単離された茎の毛状突起の遺伝子発現結果を、大麻の精製された毛状突起の遺伝子発現を特徴付けるLivingstonらによって提示された以前の結果と比較しました14(補足表1から適応).彼らのプロトコルは、水性バッファーへのブレンド、ふるいによるろ過、そして最後にPercollグラジエントを使用したトリコーム精製で構成されていました。トリコーム発現遺伝子は、トリコーム特異的遺伝子マーカーであるカンナビジオール酸シンターゼ(CBDAS)の遺伝子発現と最も高度に相関するもの(p > 0.95)として特徴付けられた14。本プロトコルで得られた結果とLivingstonら14で提示された結果との間の遺伝子発現の比較は、トリコームマーカー遺伝子CBDASを含む、我々のトリコーム画分における12の最も高度に濃縮された遺伝子がLivingstonらの研究14でも濃縮されたことを示している(表1)。注目すべきことに、有意に高い濃縮比が本プロトコルから得られた。これらの結果は、トリコーム濃縮遺伝子発現の研究のための本プロトコルの有効性を確認する。
また、トランスクリプトーム研究の基準遺伝子としてアクチンが多用されることから、 大麻のアクチン遺伝子5種の発現データを比較しました(表2)。孤立した茎と固着性の毛状突起の両方についての私たちの結果は、Livingstonらの研究14によって報告されたものに匹敵しました。
最後に、おそらくトリコーム濃縮されていないクロロフィルa-b結合タンパク質ファミリー遺伝子の発現およびトリコーム濃縮データを計算した(表3)。実際、この遺伝子ファミリーの12人のメンバーは、<1の毛状突起濃縮因子を示し、毛状突起濃縮の陰性対照として機能しました。これらの組み合わせの結果は、花序および単離された毛状突起画分の独特の発現パターンを示し、単離された毛状突起画分の完全性および品質を支持する。
図1:1Lガラスビーカーをロードするためのセットアップ。 1mmのスクリーンドアメッシュは、いくつかの輪ゴム(図示せず) を介して ガラスビーカーの側面に固定されています。1 Lガラスビーカーは直立位置にロードする必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:小麦粉ふるいのセットアップ。 小麦粉ふるいには、底部に輪ゴム を介して 350μmのマイクロふるいが取り付けられている(図示せず)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:トリコーム分離の最初のステップのセットアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ガラスビーカーのセットアップ。 ガラスビーカーには、開口部に輪ゴム で 固定された1mmのスクリーンドア(蚊)メッシュの3層が取り付けられています。ビーカーの開口部は下を向いています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:トリコーム分離に使用されるマイクロシーブコーン構造のセットアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:孤立した毛状突起を含むマイクロシーブの浸漬および振とう動作のセットアップ。 水平/垂直の動きは、ティーバッグの注入に似ている必要があります。セットアップは、使用するメッシュサイズごとに同じです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:最終的な孤立した毛状突起を転送するためのセットアップ。 最終的に単離されたトリコームは、標識された1.5 mLチューブに移されます。すべての調理器具はLNで事前に冷やしておく必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:プロトコルの概要を示すフローチャート。Cからの腺頭状毛状突起の分離。サティバには3つのステップが含まれます:(1)植物源からのトリコームの最初の剥離と2つのふるい(1 mmおよび350 μm)を介した通過、(2)細孔サイズが減少する5つのマイクロシーブを介して植物材料を通過させます(150 μm、105 μm、80 μm、65 μm、および50 μm)、および(3)分離された毛状突起を事前に冷却された1.5 mLチューブに収集します。いずれのマイクロシーブ段階から保持された組織は、同様に採取され得る。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:現在のプロトコルを使用した単離された毛状突起の顕微鏡画像。 (A,B,C) 腺頭状固着毛状突起 C. sativa fan葉から。(A)孔径が105μmから150μmの範囲のマイクロシーブからの中間分離。緑色の非トリコーム素材が大量に保持されていることに注意してください。(B)細孔径が50μmから65μmの範囲のマイクロシーブから、植物源で汚染された(赤い矢印)、および(C)汚染されていない分離の終了。スケールバー = (A) 100 μm、(B,C) 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:単離された毛状突起の顕微鏡画像。 (A,B)C.サティバの腺頭状毛状突起:(A)現在のプロトコルを使用して分離された茎型、および(B)現在のプロトコルを使用して分離された固着型。(C)従来のプロトコルを使用して単離された茎状の毛状突起。毛状突起の低収量と妥協のない頭の欠如は明らかです。(D,E)(D)本プロトコールおよび(E)従来のプロトコールを用いて単離された茎腺頭頂状トリコーム。(F)65μmから105μmのマイクロシーブから分離された腺茎毛状突起(クローズアップ)。分離した頭と茎の部分を持つ茎の毛状突起の高い分離に注意してください。赤い矢印は膀胱石の毛状突起を示し、青い矢印は腺頭状茎の毛状突起からのいくつかの茎部分を示し、黄色の矢印は分離した椎間板細胞を示します。スケールバー = (A、C、D、E、F) 100 μm、(B) 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:トリコームから抽出されたRNAの完全性の分析。本プロトコルを使用して単離された腺頭頂茎および固着性毛状突起から抽出されたRNAサンプルのクロマトグラフおよびゲル。本研究で用いた4品種系統の(A-D)茎毛状突起、それぞれCS-11、CS-12、CS-13、CS-14、および固着性毛状突起CS-11、CS-12、CS-13、CS-14のRNAの結果。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:本プロトコールを用いてRNAseqで得られたトリコーム濃縮遺伝子発現とLivingstonらによって得られた結果との比較14。Livingstonらによるカンナビジオール酸シンターゼ(CBDAS)発現と最も高い相関を示す12個の遺伝子(Wiley出版社の許可を得て適応された補足表データS4から)を比較のために選択しました。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:本プロトコル(大麻品種CS-1111(Var CS-11)からの遺伝子発現データ)からの単離された茎および固着毛状突起の5つの大麻アクチン遺伝子の遺伝子発現(FPKM)と、Livingstonらから以前に発表された結果との比較14。Livingstonら14の結果は、Finola FNリファレンスゲノムに基づいて提示され、それらのデータはCS10.2リファレンスゲノムに変換されました。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:本プロトコルからの全花序および単離された茎毛状突起の大麻クロロフィルa-b結合遺伝子の遺伝子発現(FPKM)(Var CS-11からの遺伝子発現データ)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在利用可能なトリコーム単離プロトコルと比較して、2つの主要な変更が本プロトコルに記載されている。これらには、最初のステップでドライアイスを使用して植物材料からトリコームを剥離し、一般的に使用される液体緩衝媒体をLNに置き換えることが含まれます。 C. sativa trichome精製の最初の変更は、ゼラニウムペディセルからトリコームを分離するために砕いたドライアイスの使用を導入した以前のプロトコルに基づいています5。従来の毛状突起分離プロトコルでは、一般的に小型(50 mL)の試験管を使用しますが、この研究では、大量の砕いたドライアイスを含む1 Lのガラスビーカーを使用し、大量の初期植物材料(最大10 g)を処理できるようにしました。さらに、本プロトコルでは、マイクロシーブを通るトリコームの2つの追加の通路が、最初の単離工程で導入された。第1のステップは上下の激しいソルトシェーカーのような動きを採用し、第2のステップは小麦粉ふるいのマイクロふるいを通る水平ふるい分け運動を採用する。水平方向と垂直方向のふるい分け動作を組み合わせることで、毛状突起のサイズと形状に基づいて分離を強化することが提案されています。
第二の、最も重要な変更は、マイクロシーブを通過することが行われる分離媒体に対処する。本プロトコルでは、従来の水性単離媒体は完全にLNに置き換えられています。以前のプロトコル8 でも、トリコーム分離の最初のステップでLNを使用し、トリコームを植物材料から分離し(花の材料をメッシュふるいに格子することによって)、液体バッファー抽出とパーコール密度分離を続けました。従来の単離媒体の代わりにLNを代用することで、従来の単離媒体の毒性成分に関連する特別な手順が不要になり、ワークフローの緩和と高スループットが可能になります。
本プロトコルの重要な特徴は、ドライアイスとLNが室温で急速に昇華する傾向に依存しています。この機能により、分離プロセス全体で寛大なアプリケーションが可能になります。対照的に、従来の単離バッファーを大量に使用すると、その大量の取り扱いに関して技術的な複雑さが生じます。
本プロトコールの単離プロセスは、腺頭状茎トリコームの脆弱な頭部構造の保持を促進するが、従来のプロトコルは、椎間板細胞のみを残して容易に洗い流される残りの腺材料からの椎間板細胞の分離を促進する。この現象は、従来の絶縁プロトコルと新しいプロトコルを比較した結果にはっきりと見ることができます(図10D、E)。顕微鏡観察に加えて、トリコームから抽出されたRNAの品質分析(このプロトコルを使用して分離)は、RNAの完全性が単離プロセス中に保持され、トランスクリプトーム分析に適していることを明確に示しています。
さらに、単離されたトリコーム画分からの遺伝子発現結果は、フラクションが確立されたトリコーム発現遺伝子において高度に濃縮されていること(表1)および逆に、非トリコーム発現遺伝子が非発現であることを示しています(表3)。
本プロトコルの主な制限は、マイクロシーブを通過する傾向に応じてトリコームを単離するための排他的適合性です。このプロトコルは、密度勾配を用いたトリコームの単離に直接適用することはできませんが、必要に応じて、密度勾配ステップの前にトリコームを単離するのに適しています。この研究では、このプロトコルを使用して分離されたトリコームはプロテオミクス特性評価を受けておらず、そのようなアプリケーションへの適合性を検証する必要があります。しかし、茎状突起と固着性トリコームの両方から抽出されたRNAサンプルは、チョコレートグラフと高いRIN値が示すように分解を示さなかったため、本プロトコルで分離されたトリコームは、プロテオーム解析に必要な要件を満たしている可能性が高いと考えられます。
扇状子葉からの腺頭状固着性毛状突起の(初期植物源および他のタイプの毛状突起からの)分離度は非常に高い、扇状地の葉には腺頭状毛状毛状突起タイプ15,16がなく、膀胱性および球根状毛状突起は、構造およびサイズの違いにより固着性毛状突起から容易に分離される。しかし、腺頭状茎型毛状突起の分離に関しては、植物源である成熟雌花序には、前茎型14に加えて4つの毛状突起タイプすべてが含まれているため、濃縮としてそれらの分離度に対処するのが最善です。孤立した腺頭状毛状突起のほとんどが茎型であることは、それらの高い位置(表皮に結合した固着性毛状突起に対して)がドライアイス粒子と衝突して植物から分離する可能性を高めるため、当然のことです。さらに、茎状突起の頭部と茎部とを結ぶ接合部は、腺頭17の脱落に伴う弱点と考えられる。したがって、茎の毛状突起部分を、固着型の潜在的に低い汚染を伴う高度に濃縮された画分と呼ぶのが正確であろう。ただし、この仮定を検証するためのさらなる分析は行われませんでした。
他の植物種から腺毛状突起を抽出するための本プロトコルの適合性はまだ決定されていない。C. sativaの高いトリコーム密度は、おそらく本プロトコルの成功に寄与する。ただし、比較的大きな植物材料源(分離サイクルあたり最大10 g)を効果的に処理できるため、これが唯一の理由である可能性は低いようです。他の研究では、他の植物から異なる毛状突起タイプを分離するための詳細なプロトコル、例えば、シロイヌナズナ18,19からのロゼット葉の毛状突起が提示されている。他のトリコームタイプを単離するための本プロトコルの適用性は、この研究では研究されていませんが、この研究で提示された要素、特に単離バッファーのLNの置換は、トリコームの分離プロセスを改善する可能性があります。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、CannabiVar Ltd.からの財政的支援を認めている。すべての植物材料は、イスラエルのボルカニセンターのヒナニットコルタイ教授によって寛大に提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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