Summary
Descriviamo una procedura chirurgica utilizzata per indurre l'ischemia periferica nei conigli con iperlipidemia e diabete. Questo intervento chirurgico agisce come un modello preclinico per le condizioni sperimentate nella malattia dell'arteria periferica nei pazienti. L'angiografia è anche descritta come un mezzo per misurare l'entità dell'ischemia introdotta e il recupero della perfusione.
Abstract
La malattia vascolare periferica è un problema clinico diffuso che colpisce milioni di pazienti in tutto il mondo. Una delle principali conseguenze della malattia vascolare periferica è lo sviluppo di ischemia. Nei casi più gravi, i pazienti possono sviluppare ischemia critica degli arti in cui sperimentano dolore costante e un aumento del rischio di amputazione degli arti. Le attuali terapie per l'ischemia periferica includono la chirurgia di bypass o interventi percutanei come angioplastica con stenting o aterectomia per ripristinare il flusso sanguigno. Tuttavia, questi trattamenti spesso non riescono a progressione continua della malattia vascolare o ristenosi o sono controindicati a causa della scarsa salute generale del paziente. Un promettente approccio potenziale per il trattamento dell'ischemia periferica comporta l'induzione della neovascolarizzazione terapeutica per consentire al paziente di sviluppare vascolarizzazione collaterale. Questa rete appena formata allevia l'ischemia periferica ripristinando la perfusione all'area interessata. Il modello preclinico più frequentemente impiegato per l'ischemia periferica utilizza la creazione di ischemia degli arti posteriori nei conigli sani attraverso la legazione dell'arteria femorale. In passato, tuttavia, c'è stata una forte disconnessione tra il successo degli studi preclinici e il fallimento di sperimentazioni cliniche riguardanti trattamenti per l'ischemia periferica. Gli animali sani in genere hanno una solida rigenerazione vascolare in risposta a ischemia indotta chirurgicamente, in contrasto con la ridotta vascolarizzazione e rigenerazione in pazienti con ischemia periferica cronica. Qui, descriviamo un modello animale ottimizzato per l'ischemia periferica nei conigli che include iperlipidemia e diabete. Questo modello ha ridotto la formazione collaterale e il recupero della pressione sanguigna in confronto ad un modello con una dieta di colesterolo superiore. Così, il modello può fornire una migliore correlazione con i pazienti umani con angiogenesi compromessa dalle commorbilità comuni che accompagnano la malattia vascolare periferica.
Introduction
La malattia arteriosa periferica (PAD) è un disturbo circolatorio comune in cui la progressione della formazione di placca aterosclerotica porta ad un restringimento dei vasi sanguigni negli arti del corpo. Il recente aumento dei fattori di rischio per l'aterosclerosi, compreso il diabete, l'obesità e l'inattività, ha portato ad aumentare la prevalenza della malattia vascolare1. Attualmente, si stima che il 12% – 20% della popolazione generale oltre 60 anni ha una malattia arteriosa periferica2. Una delle principali conseguenze della malattia arteriosa periferica è lo sviluppo dell'ischemia periferica, più comunemente trovata negli arti inferiori. Nei casi più gravi, i pazienti possono sviluppare ischemia critica degli arti, uno stato in cui c'è dolore costante a causa di una mancanza di flusso sanguigno. I pazienti con ischemia critica degli arti hanno una probabilità 50% di avere un arto amputato entro un anno dalla diagnosi. Inoltre, i pazienti con diabete hanno una maggiore incidenza di arteriopatia periferica e risultati più poveri dopo interventi per la rivascolarizzazione3,4. Le attuali terapie per l'ischemia periferica includono interventi percutanei come aterectomia e stenting o bypass chirurgico. Tuttavia, per molti pazienti questi trattamenti forniscono solo benefici a breve termine e molti non sono abbastanza sani per le principali procedure chirurgiche. In questo lavoro, descriviamo un modello animale preclinico per testare nuovi trattamenti mirati alla malattia vascolare periferica che incorpora la generazione di ischemia periferica nei conigli attraverso la legazione chirurgica nel contesto dello stato di malattia diabetica.
Il modello di ischemia degli arti posteriori nei conigli è stato utilizzato come modello fisiologico per la malattia vascolare ostruttiva e precursore preclinico di studi umani per oltre mezzo secolo5,6. I conigli sono spesso una specie preferita per gli studi sull'ischemia periferica a causa della muscolatura sviluppata del muscolo della caviglia e del vitello, in contrasto con i comuni modelli animali di grandi dimensioni che sono ungulati (animali con zoccoli). Diverse recensioni recenti hanno affrontato l'uso di questo modello e altri nella modellazione della malattia vascolare periferica in esseri umani7,8. Modelli simili che utilizzano l'ischemia degli arti posteriori nei conigli sono stati usati negli studi preclinici sui fattori di crescita9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20, terapia genica21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32, 33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44e cellule staminali45,46,47,48,49,50 ,51per la neovascolarizzazione terapeutica negli arti. Sfortunatamente, le sperimentazioni cliniche che hanno seguito questi studi animali di successo non hanno mostrato benefici significativi per i pazienti52.
Una spiegazione suggerita della ragione di questo fallimento traslazionale è che la condizione dell'ischemia periferica nei pazienti umani è quella che include la resistenza ai segnali angiogenici53,54,55, 56 a , 57 a , 58 a , 59. diversi studi hanno evidenziato difetti nelle vie di segnalazione angiogenica nel diabete e nell'iperglicemia. Il diabete e l'iperlipidemia portano ad una perdita di proteoglicani eparan solfato e un aumento degli enzimi che tagliano il solfato di eparan, presentando un potenziale meccanismo per la resistenza all'angiogenesi terapeutica/arteriogenesi con fattori di crescita60 , 61. Pertanto, una caratteristica fondamentale di un modello per l'ischemia periferica dovrebbe includere un aspetto della resistenza terapeutica in modo che le terapie possano essere valutate nel contesto dello stato di malattia presente nei pazienti umani.
In questo lavoro, descriviamo un modello di coniglio di ischemia periferica attraverso la legazione chirurgica delle arterie femorali. Un periodo di piombo con l'induzione del diabete e dell'iperlipidemia è incorporato nel modello. Abbiamo confrontato questo modello con un altro modello che incorpora una dieta grassa più alta senza diabete e ha scoperto che il modello con diabete e basso livello di iperlipidemia era più efficace nel ridurre la crescita dei vasi sanguigni. Il nostro modello combina i progressi che sono stati utilizzati da gruppi separati, con l'obiettivo di fornire un metodo pratico e standardizzato per ottenere risultati coerenti nella ricerca sulle malattie vascolari periferiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gli studi che coinvolgono gli animali sono stati condotti con l'approvazione dell'Università del Texas ad Austin e il centro scientifico Utheivita presso il Comitato istituzionale di cura e uso degli animali di Houston (IACUC), l'ufficio di revisione degli animali e dell'uso (ACURO) dell'esercito degli Stati Uniti Ricerca medica e Materiel comando ufficio di protezioni di ricerca, e in conformità con le linee guida NIH per la cura degli animali.
1. induzione del diabete e iperlipidemia
- Transizione i conigli neozelandesi (4 – 6 mesi) da una tazza di erba medica standard a 0,1% di colesterolo Chow nel corso di quattro giorni. Per i giorni 1 – 5, utilizzare il Chow standard a rapporto di colesterolo Chow di 1:0, 3:1, 1:1, 1:3, e 0:1, rispettivamente. Dopo due settimane sul 0,1% di colesterolo Chow, indurre i conigli ad avere il diabete usando l'iniezione di allossana come descritto nei seguenti passaggi
- Sedate i conigli con 35 – 75 mg/mL di chetamina e 1 – 2 mg/mL di acepromazina per iniezione sottocutanea e preparate un'iniezione endovenosa introducendo un catetere nella vena marginale sinistra con un catetere da 22 g.
- Raccogliere una goccia di sangue dai conigli attraverso il mozzo del catetere della vena dell'orecchio per la misurazione del livello basale di glucosio nel sangue (BGL). È possibile utilizzare qualsiasi glucometro standard. I livelli normali di glucosio per un coniglio sono tipicamente nell'intervallo di 80 a 150 mg/dL.
- Iniettare allossana a 100 mg/kg ricostituito in soluzione salina ad un volume di 8 ml attraverso il catetere auricolare lentamente per un periodo di 8 minuti utilizzando una pompa a siringa.
- Controllare il BGL ogni ora per le prossime 12 h utilizzando un glucometro standard per monitorare per l'ipoglicemia.
- Mettere il coniglio in un trattenitore.
- Anestetizzare l'orecchio con 2,5% lidocaina/2.5% crema di prilocaina.
- Prenda il sangue dalla vena dell'orecchio laterale utilizzando un ago da 27 G e misuri BGL utilizzando un misuratore standard.
- Misurare il BGL due volte al giorno per i primi 7 giorni. Dare ai conigli un'iniezione di insulina se il BGL raggiunge o supera 350 mg/dL.
- Preparare una sfera in acciaio inossidabile di 3 mm per l'impianto come marcatore di dimensioni durante gli angiogrammi prima del giorno dell'intervento chirurgico.
- Tagliare un pezzo circolare di 10 mm di pellicola silastica da un foglio più grande utilizzando un pugno biopsia.
- Montare la sfera al centro del foglio utilizzando un sigillante in silicone trasparente.
- Coprire completamente la palla con il sigillante. Lasciar curare il sigillante per un minimo di 24 ore.
- Posizionare la palla in un sacchetto di polietilene a bassa densità da 2 pollici x 3 pollici aperto e posizionarlo in una sacca di sterilizzazione da sterilizzare con gas di ossido di etilene.
2. preparazione del coniglio per la chirurgia
- Anestetizzare il coniglio con 20 – 40 mg/kg di chetamina e 2 mg/kg di midazolam tramite iniezione sottocutanea. Posizionare il coniglio sull'1,5% – 3% isoflurano (tipicamente 2%) durante la sedazione iniziale utilizzando una maschera. Somministrare un'iniezione di Alfaxalone per mantenere l'anestesia attraverso un'iniezione intramuscolare di 3 mg/kg.
- Una volta anestetizzato, rimuovere la maschera e inserire un tubo endotracheale ammanicato, nelle vie respiratorie e collegare ad un ventilatore. Continuare a somministrare isoflurano all'1,5% – 3%.
- Raccogli il sangue dall'arteria centrale da entrambe le orecchie per un pannello chimico di base.
- Posizionare un catetere per la vena dell'orecchio di 22 G nella vena laterale per la soluzione di Ringer lattato in tutta la procedura chirurgica. In alternativa, è possibile utilizzare una soluzione salina normale (0,9% cloruro di sodio).
- Utilizzando la vena laterale nell'orecchio opposto, posizionare un catetere nella vena e consegnare Alfaxalone a 6 mg/kg/h. aumentare gradualmente l'Alfaxalone a 8 mg/kg/h diminuendo l'isoflurano a 0,6% durante il periodo di preparazione.
- Per limitare il dolore e il rischio di infezione, somministrare buprenorfina (0,01 mg/kg) e enrofloxacina (5 mg/kg) utilizzando un'iniezione sottocutanea con un ago da 25 G.
- Tagliare i capelli sul collo, le cosce interne destra e sinistra, e indietro utilizzando Clippers (#40 lama). I capelli vengono rimossi dal retro per mantenere il contatto con il tampone di messa a terra.
- Posizionare un polsino della pressione sanguigna su ciascuno degli arti posteriori e misurare la pressione sanguigna iniziale. Posizionare il polsino appena sotto il ginocchio con la sonda appena sopra il Hock sulla superficie laterale.
- Posizionare il coniglio sul tavolo di chirurgia sulla schiena e strofinare e drappe i siti di chirurgia. Questo include il collo per l'accesso all'arteria carotide e la coscia destra interna per l'accesso all'arteria femorale. Eseguire lo scrub di sterilizzazione con scrub alternati al 2% di clorexidina e 70% di alcol etilico. Ripetere questo tre volte, quindi applicare uno spray finale con 2% soluzione di clorexidina.
- Posizionare una sfera in acciaio inossidabile di 3 mm che è stata sterilizzata all'interno di un sacchetto di polietilene a bassa densità sulla parte superiore della gamba destra (strofinato) vicino alla parte superiore della coscia per servire come riferimento di dimensione durante le misurazioni angiogramma. Posizionare un drappo sterile sulla gamba fino al momento dell'intervento chirurgico. Lasciare la palla all'interno del sacchetto di plastica sterile durante il primo angiogramma.
3. l'angiografia
- Esporre la giusta arteria carotide comune
- Fare un'incisione di 4 – 5 cm di lunghezza solo laterale alla trachea utilizzando un bisturi con una lama #15.
- Utilizzare la dissezione smussata per esporre l'arteria carotide e aprire l'incisione utilizzando piccoli retrattori Weitlaner. Isolare accuratamente l'arteria carotidea dalla vena giugulare e dal nervo vago. Tipicamente, una curva Metzenbaum forbici e un emostatico di zanzara curvo sono utilizzati per la dissezione smussata. Assicuratevi di ottenere la piena separazione dell'arteria carotide dal nervo e dalla vena giugulare per rendere le legature solo legare l'arteria.
- Posizionare una legatura utilizzando una sutura di seta 4-0 alle estremità prossimali e distali dell'arteria esposta. Legare l'estremità distale della carotide con il nodo di un chirurgo seguito da quattro nodi quadrati. Sull'estremità prossimale, utilizzare un ligaloop per consentirgli di essere serrato o allentato secondo necessità. L'uso di un ligaloop posto all'estremità prossimale dell'arteria esposta può aiutare a fissare l'introduttore e il catetere.
- Somministrare 500 UI di eparina attraverso la IV. Utilizzare circa 0,5 mL di lidocaina 1% applicato lungo la carotide esposta per dilatare la nave. Un trattamento è di solito sufficiente, ma può essere ripetuto se necessario. Tagliare approssimativamente a metà strada attraverso l'arteria carotide utilizzando un bisturi o iris forbici, quindi posizionare lo strumento di inserimento filo 4-inch nell'arteria.
- Alimentare un filo guida da 0,014 pollici x 185 cm attraverso lo strumento di inserimento alla biforcazione aortica sulla cresta iliaca nell'aorta discendente. Rimuovere lo strumento di inserimento e inserire un catetere angiografico a codino 3F sul filo.
- Avanzare il catetere codino per essere 2 cm prossimale alla biforcazione aortica sulla cresta iliaca nell'aorta discendente.
- Posizionare la punta del catetere tra la settima vertebra lombare e la prima vertebrale sacrale. Testare la posizione del catetere iniettando manualmente un 2 – 4 mL di agente di contrasto.
- Somministrare un'iniezione intra-arteriosa di 100 μg di nitroglicerina attraverso il catetere per aumentare la vasodilatazione.
- Somministrare 0,8 mL di lidocaina 1% al coniglio attraverso il catetere per aiutare con vasodilatazione durante l'angiogramma. Fissare il tubo per l'iniettore al catetere e rimuovere eventuali bolle d'aria nella linea. Iniettare 8-9 mL di mezzo di contrasto utilizzando un iniettore angiografico automatizzato attraverso il catetere.
- Registrare le immagini seriali degli arti posteriori usando l'angiografia.
- Impostare l'iniettore di potenza per iniettare il contrasto a 3 mL/sec per un totale di 8-9 mL. Eseguire l'angiografia digitale a sottrazione a 6 fotogrammi al secondo.
- Selezionare le immagini seriali create e modificare una foto di ogni angiogramma utilizzando circa-40% impostazione per minimizzare l'aspetto dell'osso e catturare un quadro completo della perfusione vaso con contrasto. Un esempio angiogramma del flusso vascolare dopo la legazione/escissione dell'arteria femorale è mostrato in Figura 1.
4. isolamento dell'arteria femorale
- Fare un'incisione longitudinale nella pelle sopra l'arteria femorale destra utilizzando un bisturi (#15 lama). Assicurarsi che l'incisione si estenda inferiormente dal legamento inguinale che termina nella zona appena prossimale alla rotula (circa 6 cm).
- Utilizzare la dissezione smussata con le forbici curve Metzenbaum o un emostatico di zanzara curvo per esporre l'arteria femorale.
- Usare i retrattori Weitlaner per tenere aperta l'incisione.
- Aggiungere 0,5 mL di lidocaina 1% localmente per ridurre l'irritazione del nervo e promuovere la vasodilatazione.
- Continuare la dissezione smussata dei tessuti per liberare l'intera lunghezza dell'arteria femorale insieme a tutti i rami dell'arteria femorale, tra cui l'epigastrica inferiore, femorale profonda, circumflessione laterale, e le arterie epigastriche superficiali (Figura 2a) .
- Dissezionare ulteriormente lungo le arterie poplitee e safene così come l'arteria iliaca esterna (Figura 2a). Inumidire periodicamente l'area con soluzione salina per proteggere dal danno tissutale. Se la dissezione smussata viene eseguita lungo la scanalatura femorale (tra i muscoli) non c'è bisogno di tagliare il muscolo.
- Separare accuratamente l'arteria dalla vena e dal nervo come mostrato nella Figura 2B, C. Ligare le arterie indicate dal diagramma con 4,0 suture di seta mettendo due legami con abbastanza spazio tra di loro per tagliare l'arteria. Questi legami vengono eseguiti con un nodo del chirurgo seguito da quattro nodi quadrati.
- Tagliare tra i due legami sulle arterie ligate utilizzando le piccole forbici Metzenbaum. Accisa l'arteria femorale dalla sua origine prossimale come un ramo dell'arteria iliaca esterna al punto distalmente dove si biforcazione per formare le arterie safena e poplitea.
5. Ripeti angiografia
- Utilizzare 4-0 sutura di seta per attaccare il foglio silastico, con sfera in acciaio inossidabile di 3 mm alla parte superiore del muscolo quadricipite. Tirare la pelle sopra la palla dopo che è in posizione.
- Somministrare un'iniezione intra-arteriosa di 100 μg di nitroglicerina attraverso il catetere per aumentare la vasodilatazione.
- Se necessario, somministrare un altro 0,8 mL di lidocaina 1% al coniglio attraverso il catetere per assistere con vasodilatazione durante l'angiogramma.
- Iniettare 8-9 mL di mezzo di contrasto utilizzando un iniettore angiografico automatizzato.
- Eseguire l'angiografia come descritto nel passaggio 3,9.
6. chiusura e recupero delle ferite
- Rimuovere il catetere dall'arteria destra. Legare l'arteria utilizzando la sutura di seta 4-0 che è già in atto intorno all'arteria.
- Suture entrambe le ferite chiuse. Chiudere gli strati muscolari e subcuticolari utilizzando 4-0 polidiossanone o 3-0 poliglactina 910 su un ago conico (vedere tabella dei materiali) in un modello di sutura continua. Chiudere la pelle utilizzando 4-0 polidiossanone o 4-0 poliglactina 910 su un ago da taglio inverso (vedere tabella dei materiali) in un modello di sutura subcuticolare continua sepolta.
Nota: se disponibile, polidiossanone è preferibile per entrambi. - Somministrare iniezioni intradermiche di 0,25% di bupivacaina vicino alle incisioni utilizzando una siringa con un ago da 25 G. Inserire l'ago e iniettare 0,5 mL mentre l'ago viene tirato indietro. Dare una iniezione per lato della ferita per l'incisione sul collo (due iniezioni sul collo) e due iniezioni per lato della ferita per l'incisione sulla gamba (quattro iniezioni sulla gamba; sei iniezioni in totale). Il volume totale iniettato è di 3 mL (0,5 mL x 6 iniezioni).
- Somministrare iniezioni sottocutanee di 0,5 mg/kg di meloxicam e di buprenorfina a rilascio prolungato a 0,12 mg/kg.
- Monitorare il coniglio come si recupera dall'anestesia. Il coniglio inizierà automaticamente a deglutire come si sveglia dall'anestesia. Una volta che la risposta deglutizione si verifica, rimuovere il tubo endotracheale. Fornire un attento monitoraggio e supporto termico fino a quando il coniglio è in grado di mantenere la funzione cardiovascolare e la temperatura corporea. Riportare il coniglio nel suo recinto una volta che è in grado di ambulare.
- Impiegare verdure fresche e/o l'alimentazione della siringa di una dieta di cura critica insieme a iniezioni saline sottocutanee se il coniglio non tollera il Chow dopo l'intervento chirurgico. Cavolo, broccoli, cavolfiore, carote, o altro in verdure di stagione possono essere utilizzati. Shred le verdure e mescolare insieme per aiutare nel coniglio di ritorno a mangiare.
7. monitoraggio delle
- Anestetizzare i conigli ogni due settimane per acquisire la pressione sanguigna su entrambe le gambe come descritto nel passaggio 2,8. Raccogliere il sangue dall'arteria centrale dell'orecchio per l'uso nei saggi di chimica del sangue. In alternativa, prendere il sangue dalla vena safena o dalla vena cefalica. Prendere approssimativamente 2 mL ad ogni punto temporale. Utilizzare un pannello di chimica del sangue standard per l'analisi. Se necessario, aggiungere test per lipoproteina a bassa densità (LDL), lipoproteina ad alta densità (HDL), o emoglobina Hba1c (HbA1c).
- Prendere una piccola quantità di sangue per le misurazioni BGL.
8. il trattamento
- Preparare dieci siringhe con trattamento, Carrier e CROSSLINKER. Riempire ogni siringa appena prima dell'uso con 100 μL di liquame di solfato di calcio e poi 100 μL di alginato di sodio al 2% con fattori di crescita o altri trattamenti in modo che l'alginato sia più vicino alla punta della siringa.
- Somministrare una iniezione preparata nel muscolo prima di preparare il successivo. Questo riduce il tempo che l'alginato interagisce con il solfato di calcio nella siringa. Lo spazio le iniezioni uniformemente lungo entrambi i lati dell'arteria femorale sulla coscia. Per ottenere iniezioni uniformi, creare un foglio di silicone con fori per guidare l'iniezione, come descritto in altri studi19. Questo può essere facilmente preparato utilizzando un punzone per biopsia per creare fori in fogli di silicone disponibili in commercio.
9. angiografia endpoint, eutanasia, fissazione della perfusione e raccolta dei tessuti
- Alla data dell'endpoint, eseguire l'angiografia come descritto nel passaggio 3, ma utilizzare l'arteria carotide sinistra per l'accesso.
- Dopo angiografia, spostare l'animale al tavolo necroscopia ed eseguire la fissazione di perfusione per preservare i tessuti degli arti posteriori:
- Aumentare l'isoflurano al 3% – 4% ed eseguire un pizzico di punta per confermare che l'anestesia è sufficientemente profonda.
- Somministrare 1000-2000 UI di eparina per via endovenosa.
- Crea un'incisione lungo la linea mediana della gabbia toracica e attraversa la lunghezza del diaframma usando un bisturi con una lama #20.
- Con la gabbia toracica esposta, tagliare le costole appena a sinistra della linea mediana con frese a costine. USA i retrattori Weitlaner per esporre il cuore.
- Impostare la pompa con tubo di uscita con un diametro interno di 1/8 pollici e un ago 18G alla fine. Precaricare la linea con soluzione salina e avere almeno 600 mL di soluzione salina e formalina preparata in contenitori separati per la perfusione.
- Inserire l'ago da 18 G collegato alla pompa nel ventricolo sinistro tramite l'apice del cuore. Inserisci un altro ago da 18 G (non attaccato a nulla) nell'atrio destro e Consenti al sangue di fluire nel downdraft della tabella del necroscopia.
- Utilizzare una pompa di perfusione per controllare il flusso di circa 500 mL di soluzione salina nel cuore. Utilizzare un settaggio pompa per flusso 110 mL/min.
- Una volta che il fluido proveniente dal cuore è limpido, spostare il tubo dal serbatoio salino a uno riempito con una soluzione di formalina al 10%. Il contrattacco avverrà in tutti e quattro gli arti se la perfusione funziona correttamente. Pompare circa 500 mL di soluzione di formalina nel ventricolo sinistro.
- Spegnere la pompa e togliere gli aghi dal cuore.
- Rimuovere entrambi gli arti posteriori all'anca tagliando intorno all'articolazione dell'anca con un bisturi con #20 lama. Utilizzare una piccola fresa a costine per rimuovere gli arti. Utilizzare l'arto non ischemico come controllo.
- Conservare gli arti in formalina per 24 h a 4 ° c e poi immagazzinato in 70% etanolo a 4 ° c.
- Per l'analisi istologica, prendere biopsie multiple dagli arti. Abbiamo usato otto biopsie da 6 mm prese nelle regioni della coscia e del vitello in entrambi gli arti.
Nota: mentre la misurazione della pressione sanguigna della caviglia e l'angiografia sono i metodi più comunemente utilizzati per misurare il recupero del flusso sanguigno, altri metodi possono essere utilizzati per tenere traccia del recupero degli animali, tra cui ultrasuoni Doppler, Imaging doppler laser, infrarossi termografia62, microsfera determinata perfusione63,64, tomografia computerizzata (CT) Imaging, e risonanza magnetica Imaging (MRI)65.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dopo l'induzione del diabete e l'inizio della dieta di colesterolo 0,1%, il colesterolo totale per i conigli con diabete e dieta di colesterolo è stato 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 conigli maschi) media dei punti di tempo complessivi e conigli. Il livello BGL per questi conigli è stato di 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 conigli maschi). Un corso di tempo per le sostanze chimiche del sangue e i rapporti di pressione sanguigna delle gambe in un coniglio tipico è mostrato nella Figura 3 rispetto ai conigli sotto una dieta di colesterolo più alta (1% di colesterolo). In animali non diabetici, anche con colesterolo più alto, abbiamo scoperto che c'è stato un aumento del recupero della pressione sanguigna nell'arto ischemico e nella vascolarizzazione negli angiogrammi al punto finale (Figura 3). Gli animali sulla dieta di colesterolo/grasso superiore hanno anche mostrato un aumento dei livelli di lipoproteina A, suggerendo lo stress sul fegato. Così, il diabete con un livello inferiore di colesterolo ha portato alla perfusione più compromessa all'endpoint dello studio. Istologicamente, ci sono cambiamenti nella struttura muscolare coerenti con edema e danno ischemico in alcune posizioni Figura 4. In alcuni casi, si possono osservare cambiamenti/danni nelle fibre muscolari a causa dell'ischemia. Questo può essere osservato come perdita o interruzione delle fibre muscolari nell'analisi istologica, come è stato osservato in alcuni modelli di ischemia degli arti posteriori nei topi. Tuttavia, la cura è necessaria per distinguere questi cambiamenti da artefatti istologici della lavorazione tissutale. L'immunostaining per PECAM e αSMA può essere utilizzato per identificare il numero di vasi e vasi più grandi nelle sezioni tissutali (Figura 4). Nel complesso, il modello che utilizza il diabete con una dieta di colesterolo di livello inferiore ha prodotto deficit ripetibili nella pressione sanguigna e vascolarizzazione sul modello di dieta di colesterolo più alto senza diabete.
Figura 1: angiogrammi per l'arto posteriore di un pre-intervento di coniglio diabetico e non diabetico, post-chirurgia e dopo il recupero per 70 giorni dopo la legazione e l'escissione dell'arteria femorale. (A) angiogramma dell'arto ischemico (A sinistra) e dell'arto di controllo controlaterale (A destra). B) immagine ingrandita dell'arto ischemico nel sito di legazione. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: induzione dell'ischemia degli arti posteriori nei conigli attraverso la legatura dell'arteria femorale e l'escissione. A) illustrazione dell'anatomia vascolare dell'arto posteriore del coniglio. Posizionare i legami in tutti i punti contrassegnati per legarsi le arterie. Modificato e utilizzato con il permesso71. B) campo chirurgico che mostra il taglio verso l'arteria femorale prima della legatura. C) arterie femorali con legature in atto per indurre ischemia degli arti posteriori. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: pressione sanguigna tipica e chemisterie ematiche per i conigli con ischemia degli arti posteriori nel corso del modello. Il gruppo diabetico/MC è stato indotto ad avere il diabete e ha dato una dieta di colesterolo 0,1%. Il gruppo non-diabetico/HC è stato somministrato un 1% dieta di colesterolo. BGL = livello di glucosio nel sangue. TC = colesterolo totale. LIPA = lipoproteina (a). BP = rapporto di pressione sanguigna tra l'arto ischemico e non ischemico. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: analisi istologica del muscolo dell'arto posteriore nei conigli diabetici 70 giorni dopo la legatura dell'arteria femorale. È stata eseguita la colorazione H & E, nonché la colorazione immunoistochimica per il marcatore endoteliale, il PECAM e il marcatore delle cellule muscolari lisce vascolari, αSMA. I campioni di tessuto sono stati biopsiati dall'arto ischemico e dall'arto di controllo controlaterale non ischemico. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Abbiamo presentato un modello preclinico per indurre l'ischemia degli arti posteriori nei conigli con diabete e iperlipidemia. In molti studi, c'è ambiguità alla tecnica utilizzata per creare l'ischemia degli arti posteriori nei conigli. Nei topi, la gravità e il recupero dall'ischemia degli arti posteriori dipendono fortemente dalla posizione della legatura e della tecnica utilizzata per indurre l'ischemia. Il significato della tecnica presentata in questo lavoro è che permette l'induzione costante di ischemia che non si recupera completamente dopo 8 settimane in animali diabetici. In particolare, quando gli animali sono stati dati una dieta più alta di colesterolo e grassi, sono stati in grado di recuperare a livelli al basale vicino di rapporto di pressione sanguigna degli arti. Inoltre, sulla dieta grassa più alta gli animali avevano alterazioni negli enzimi epatici che suggeriscono danni al fegato. Così, il modello diabetico con un livello inferiore di colesterolo/grasso sembra essere un modello più consistente e pertinente di ischemia cronica nell'arto.
Quattro passaggi essenziali possono essere evidenziati all'interno di questo modello tra cui induzione del diabete, angiografia, legatura chirurgica delle arterie femorali e applicazione del trattamento. Tra questi passaggi, l'induzione del diabete è stata una delle fasi più critiche e uno che può richiedere un'ulteriore ottimizzazione per ogni laboratorio. Il tasso di iniezione di allossana è un fattore importante che altera la tossicità e l'efficacia dell'induzione del diabete da parte di allossana per i conigli. Quando iniettato troppo rapidamente, allossana ha causato instabilità nel BGL e morte nei conigli. Questo a volte può essere osservato come ipoglicemia che non viene risolta attraverso iniezioni di soluzioni di destrosio o in altri casi estremamente alta BGL. Se iniettato troppo lentamente i conigli spesso non riescono a diventare diabetico. È possibile che questo parametro debba essere ottimizzato per i conigli provenienti da fonti diverse. I conigli diventeranno tipicamente iperglicemici per 1-3 h, ma il BGL inizierà a cadere. Pertanto, di solito nessuna insulina viene somministrata il giorno dell'induzione del diabete. Tuttavia, se il BGL scende al di sotto 100 mg/dL nelle prime 24 h, può essere aumentata iniettando 10,0 mL di soluzione di destrosio al 5% per via sottocutanea o cambiando l'approvvigionamento idrico a una soluzione di destrosio al 10% (tipicamente durante la notte è sufficiente). Ogni volta che l'insulina viene somministrata viene fatto un test BGL supplementare per garantire che i livelli di glucosio non scendano troppo basso. La reattività dell'insulina varia spesso per ogni coniglio. Pertanto, i singoli regimi di dosaggio vengono utilizzati per normalizzare il BGL in base al modo in cui il coniglio risponde all'insulina. Il diabete è tipicamente indotto dopo 2-3 giorni successivi all'iniezione allossana.
Come modello preclinico di malattia vascolare periferica e ischemia degli arti, il modello presentato ha alcune potenziali limitazioni. L'induzione del diabete con allossana porta a un rapido sviluppo del diabete di tipo I. Questo è in contrasto con lo sviluppo cronico del diabete di tipo II che è più prevalente nei pazienti umani. Inoltre, l'ischemia è sviluppata acutamente a causa della Legazione chirurgica piuttosto che a causa dello sviluppo cronico di malattie vascolari e placche aterosclerotiche. Una limitazione fondamentale dell'uso dei conigli è la loro fragilità come modello animale. Gli animali tollereranno solo una quantità limitata di iperlipidemia in combinazione con il diabete di tipo I e ottimizzando la quantità massima di malattia senza avere la matrice animale era un obiettivo importante nella creazione di questo protocollo. Il nostro gruppo ha ipotizzato che i pazienti con ischemia periferica sviluppano resistenza terapeutica ai fattori di crescita angiogenica e che questo può svolgere un ruolo importante nel fallimento di terapie basate sul fattore di crescita per l'ischemia66. A tal fine, abbiamo mostrato una perdita nei proteoglicani superficiali delle cellule e un aumento dell'eparanasi nei campioni di tessuto animale e umano55,58,67,68,69,70 . Non è noto se il modello di coniglio descritto qui dimostra la resistenza del fattore di crescita, anche se l'osservazione che c'è ischemia a più lungo termine con diabete e moderato modello iperlipidemia rispetto al modello ad alto iperlipidemia suggerirebbe C'è un certo deficit nel processo di rivascolarizzazione.
Per l'inclusione di trattamenti nel modello, è importante avere un periodo di recupero dopo l'induzione di ischemia per consentire la fase di guarigione acuta a verificarsi senza intervento. Se durante questo periodo si somministrano terapie, la risposta sarebbe più rilevante per migliorare la risposta all'ischemia acuta piuttosto che all'ischemia cronica che caratterizza la malattia vascolare periferica. Tale modello può essere rilevante per lesioni ischemiche acute in traumi o trombosi, ma probabilmente non fornirà una buona correlazione con l'ischemia cronica. Data la scarsa correlazione tra i risultati positivi nei modelli preclinici di ischemia negli animali sani e i risultati delle sperimentazioni cliniche, l'inclusione del diabete o un altro fattore che riduce la rigenerazione vascolare è essenziale per tentare di ricapitolare l'ischemia degli arti negli esseri umani per la creazione di terapie future.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine il finanziamento attraverso il dipartimento di difesa Congressionalmente diretto programma di ricerca (DOD CDMRP; W81XWH-16-1-0582) a ABB e RS. Gli autori riconoscono anche il finanziamento attraverso l'American Heart Association (17IRG33410888), il DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) e gli istituti nazionali di sanità (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) ad ABB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Henry Schein Medical | 1537468 / 1531434 | 250 mL bag / 1000 mL irrigation btl |
| 1 mL Syringe | VWR | BD309628 | |
| 10 mL Syringe | VWR | BD309695 | |
| 10% Formalin | Fisher-Scientific | 23-245684 | |
| 18G Needle | VWR | 89219-294 | |
| 20G Needle | VWR | 89219-340 | |
| 25G Needle | VWR | 89219-290 | |
| 27G Needle | VWR | 89219-288 | |
| 5 mL Syringe | VWR | BD309646 | |
| 5% Dextrose | Patterson Veterinary | 07-800-9689 | |
| Acepromazine | Patterson Veterinary | VEDC207 | |
| Alfaxalone | Patterson Veterinary | 07-891-6051 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | PHR1471-1G | |
| Alloxan Monohydrate | Sigma-Aldrich | A7413 | |
| Angiography Equipment | Toshiba | Infinix-i | |
| Angiography Injector | Medrad | ||
| Anti-Mouse Ab Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | Secondary Antibody for IHC |
| Anti-Rabbit Ab Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | Secondary Antibody for IHC |
| a-SMA Antibody | Abcam | ab5694 | Primary Antibody for IHC |
| Baytril | Bayer Animal Health | 724089904201 | Enrofloxacin |
| Blood Chemistry Panel | IDEXX | 2616 | Rabbit Panel |
| Blood Pressure Cuff | WelchAllyn | Flexiport Disposable BP Cuff-infant size 7 | |
| Blood Pressure Monitor | Vmed Technology | Vmed Vet-Dop2 | |
| Bupivacaine | Henry Schein Medical | 6023287 | |
| Buprenorphine | Patterson Veterinary | 42023017905 | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Calcium Sulfate | CB Minerals | Food and Pharmaceutical Grade USP and FCC | |
| Chlorhexidine Scrub | Patterson Veterinary | 07-888-4598 | |
| Chloroform | Fisher-Scientific | C298-4 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8503 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Ear Vein Catheter | Patterson Veterinary | SR-OX165 | Surflo IV catheters |
| Endotracheal tube | Patterson Veterinary | Sheridan Brand, Depends on Rabbit Size | |
| Glucometer | Amazon | B001A67WH2 | Accu-Chek Aviva |
| Glucometer Test Strips | McKesson Medical-Surgical | 788222 | Accu-Chek Aviva Plus |
| Guidewire | Boston Scientific | 39122-01 | |
| Hair Clippers | Amazon | B000CQZI3Q | Oster #40 blade |
| Heating Pad | Cincinnati Subzero | 273 | |
| Heating Pad Pump | Gaymar | Gaymar T/Pump | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | Curved Mosquito Hemostat |
| Heparin | Patterson Veterinary | ||
| Insertion Tool | Merit Medical Systems | MAP550 | metal wire insertion tool |
| Insulin | HPB Pharmacy | Novalin R & Novalin N | |
| Insulin Syringes | McKesson Medical-Surgical | 942674 | |
| Introducer | Cook Medical | G28954 | 3F Check Flo Performer Introducer |
| Isoflurane | Henry Schein Medical | 1100734 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 856440301 | |
| Lactated Ringers | McKesson Medical-Surgical | 186662 | |
| Lidocaine | McKesson Medical-Surgical | 239936 | |
| Lidocaine/Prilocaine cream | McKesson Medical-Surgical | 761240 | |
| Ligaloop | V. Mueller | CH117 / CH116 | White Mini / Yellow Mini |
| Mazola Corn Oil | Amazon | B0049IIVCI | |
| Medrad Syringe | McKesson Medical-Surgical | 346920 | 150 mL |
| Meloxicam | Patterson Veterinary | ||
| Metal ball sutures | Ethicon-Johnson & Johnson | K891H | 4-0 silk C-1 30" |
| Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14019-13 | |
| Midazolam | Henry Schein Medical | 1215470 | |
| Nitroglycerin | McKesson Medical-Surgical | 927528 | |
| PECAM Antibody | Novus Biologicals | NB600-562 | Primary Antibody for IHC |
| Perfusion Pump | Masterflex | ||
| Pigtail Catheter | Merit Medical Systems | 1310-21-0053 | 3F pigtail |
| Polydioxanone (PDS II) suture | McKesson Medical-Surgical | 129271 | 4-0 taper RB-1 (needle comes on suture) |
| Polydioxanone (PDS II) suture | McKesson Medical-Surgical | 129031 | 4-0 reverse cutting FS-2 |
| Polyglactin 910 (Vicryl) suture | Butler | 7233-41 | 3-0 taper RB-1 |
| Polyglactin 910 (Vicryl) suture | McKesson | 104373 | 4-0 reverse cutting FS-2 |
| Rabbit Chow (Alfalfa) | LabDiet | 5321 | |
| Rabbit Restrainer | VWR | 10718-000 | |
| Rib Cutters | V. Mueller | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blade | Fine Science Tools | 10015-00 | #15 blade |
| Silk Sutures | Ethicon-Johnson & Johnson | A183H | 4-0 silk ties 18" |
| Stainless Steel Ball | McMaster-Carr | 1598K23 | 3-mm diameter |
| Surgical Drapes | Gepco | 8204S | |
| Syringe Pump | DRE Veterinary | Versaflow VF-300 | |
| Visipaque contrast media | McKesson Medical-Surgical | 509055 | |
| Weitlaner Retractor | Fine Science Tools | 17012-13 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
- Shammas, A. N., et al. Limb Outcomes Following Lower Extremity Endovascular Revascularization in Patients With and Without Diabetes Mellitus. Journal of Endovascular Therapy. 24 (3), 376-382 (2017).
- Tunstall-Pedoe, H., Peters, S. A. E., Woodward, M., Struthers, A. D., Belch, J. J. F. Twenty-Year Predictors of Peripheral Arterial Disease Compared With Coronary Heart Disease in the Scottish Heart Health Extended Cohort (SHHEC). Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Whiteley, H. J., Stoner, H. B., Threlfall, C. J. The effect of hind limb ischaemia on the physiological activity of rabbit skin). British Journal of Experimental Pathology. 34 (4), 365-375 (1953).
- Longland, C. J.
- Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 773-780 (2004).
- Krishna, S. M., Omer, S. M., Golledge, J. Evaluation of the clinical relevance and limitations of current pre-clinical models of peripheral artery disease. Clinical Science (London. 130 (3), 127-150 (2016).
- Zhou, J., et al. Therapeutic angiogenesis using basic fibroblast growth factor in combination with a collagen matrix in chronic hindlimb ischemia). ScientificWorldJournal. , 652794 (2012).
- Prochazka, V., et al. Therapeutic Potential of Adipose-Derived Therapeutic Factor Concentrate for Treating Critical Limb Ischemia. Cell Transplantation. 25 (9), 1623-1633 (2016).
- Cao, R., et al. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2. Nature Medicine. 9 (5), 604-613 (2003).
- Doi, K., et al. Enhanced angiogenesis by gelatin hydrogels incorporating basic fibroblast growth factor in rabbit model of hind limb ischemia. Heart and Vessels. 22 (2), 104-108 (2007).
- Nitta, N., et al. Vascular regeneration by pinpoint delivery of growth factors using a microcatheter reservoir system in a rabbit hind-limb ischemia model. Experimental and Therapeutic. 4 (2), 201-204 (2012).
- Karatzas, A., et al. NGF promotes hemodynamic recovery in a rabbit hindlimb ischemic model through trkA- and VEGFR2-dependent pathways. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 62 (3), 270-277 (2013).
- Stachel, G., et al. SDF-1 fused to a fractalkine stalk and a GPI anchor enables functional neovascularization. Stem Cells. 31 (9), 1795-1805 (2013).
- Asahara, T., et al. Synergistic effect of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on angiogenesis in vivo. Circulation. 92, 365 (1995).
- Morishita, R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human recombinant hepatocyte growth factor in rabbit hind limb ischemia model as cytokine supplement therapy. Hypertension. 33 (6), 1379-1384 (1999).
- Walder, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor augments muscle blood flow and function in a rabbit model of chronic hindlimb ischemia. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 27 (1), 91-98 (1996).
- Anderson, E. M., et al. VEGF and IGF Delivered from Alginate Hydrogels Promote Stable Perfusion Recovery in Ischemic Hind Limbs of Aged Mice and Young Rabbits. Journal of Vascular Research. 54 (5), 288-298 (2017).
- Xie, J., et al. Induction of angiogenesis by controlled delivery of vascular endothelial growth factor using nanoparticles. Cardiovascular Therapeutics. 31 (3), e12-e18 (2013).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Ohara, N., et al. Adenovirus-mediated ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor promotes collateral development in a rabbit model of hind limb ischemia. Gene Therapy. 8 (11), 837-845 (2001).
- Pyun, W. B., et al. Naked DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factor induces collateral artery augmentation in a rabbit model of limb ischemia. Gene Therapy. 17 (12), 1442-1452 (2010).
- Kupatt, C., et al. Cotransfection of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-B via recombinant adeno-associated virus resolves chronic ischemic malperfusion role of vessel maturation. Journal of the American College of Cardiology. 56 (5), 414-422 (2010).
- Olea, F. D., et al. but not single, VEGF gene transfer affords protection against ischemic muscle lesions in rabbits with hindlimb ischemia. Gene Therapy. 16 (6), 716-723 (2009).
- Pinkenburg, O., et al. Recombinant adeno-associated virus-based gene transfer of cathelicidin induces therapeutic neovascularization preferentially via potent collateral growth. Human Gene Therapy. 20 (2), 159-167 (2009).
- Katsu, M., et al. Ex vivo gene delivery of ephrin-B2 induces development of functional collateral vessels in a rabbit model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 49 (1), 192-198 (2009).
- Korpisalo, P., et al. Therapeutic angiogenesis with placental growth factor improves exercise tolerance of ischaemic rabbit hindlimbs. Cardiovascular Research. 80 (2), 263-270 (2008).
- Chen, F., Tan, Z., Dong, C. Y., Chen, X., Guo, S. F. Adeno-associated virus vectors simultaneously encoding VEGF and angiopoietin-1 enhances neovascularization in ischemic rabbit hind-limbs. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (4), 493-502 (2007).
- Kobayashi, K., et al. Combination of in vivo angiopoietin-1 gene transfer and autologous bone marrow cell implantation for functional therapeutic angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (7), 1465-1472 (2006).
- Lee, J. U., et al. A novel adenoviral gutless vector encoding sphingosine kinase promotes arteriogenesis and improves perfusion in a rabbit hindlimb ischemia model. Coronary Artery Disease. 16 (7), 451-456 (2005).
- Nishikage, S., et al. In vivo electroporation enhances plasmid-based gene transfer of basic fibroblast growth factor for the treatment of ischemic limb. Journal of Surgical Research. 120 (1), 37-46 (2004).
- Ishii, S., et al. Appropriate control of ex vivo gene therapy delivering basic fibroblast growth factor promotes successful and safe development of collateral vessels in rabbit model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 39 (3), 629-638 (2004).
- Tokunaga, N., et al. Adrenomedullin gene transfer induces therapeutic angiogenesis in a rabbit model of chronic hind limb ischemia: benefits of a novel nonviral vector, gelatin. Circulation. 109 (4), 526-531 (2004).
- Yamauchi, A., et al. Pre-administration of angiopoietin-1 followed by VEGF induces functional and mature vascular formation in a rabbit ischemic model. Journal of Gene Medicine. 5 (11), 994-1004 (2003).
- Zhong, J., et al. Neovascularization of ischemic tissues by gene delivery of the extracellular matrix protein Del-1. Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 30-41 (2003).
- Shyu, K. G., Chang, H., Isner, J. M. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hindlimb ischemia. Life Sciences. 73 (5), 563-579 (2003).
- Kasahara, H., et al. Biodegradable gelatin hydrogel potentiates the angiogenic effect of fibroblast growth factor 4 plasmid in rabbit hindlimb ischemia. The Journal of the American College of Cardiology. 41 (6), 1056-1062 (2003).
- Rissanen, T. T., et al. Fibroblast growth factor 4 induces vascular permeability, angiogenesis and arteriogenesis in a rabbit hindlimb ischemia model. FASEB Journal. 17 (1), 100-102 (2003).
- Taniyama, Y., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in rat and rabbit hindlimb ischemia models: preclinical study for treatment of peripheral arterial disease. Gene Therapy. 8 (3), 181-189 (2001).
- Vincent, K. A., et al. Angiogenesis is induced in a rabbit model of hindlimb ischemia by naked DNA encoding an HIF-1alpha/VP16 hybrid transcription factor. Circulation. 102 (18), 2255-2261 (2000).
- Gowdak, L. H., et al. Induction of angiogenesis by cationic lipid-mediated VEGF165 gene transfer in the rabbit ischemic hindlimb model. Journal of Vascular Surgery. 32 (2), 343-352 (2000).
- Shyu, K. G., Manor, O., Magner, M., Yancopoulos, G. D., Isner, J. M. Direct intramuscular injection of plasmid DNA encoding angiopoietin-1 but not angiopoietin-2 augments revascularization in the rabbit ischemic hindlimb. Circulation. 98 (19), 2081-2087 (1998).
- Witzenbichler, B., et al. Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C/VEGF-2) promotes angiogenesis in the setting of tissue ischemia. The American Journal of Pathology. 153 (2), 381-394 (1998).
- Prochazka, V., et al. The Role of miR-126 in Critical Limb Ischemia Treatment Using Adipose-Derived Stem Cell Therapeutic Factor Concentrate and Extracellular Matrix Microparticles. Medical Science Monitor. 24, 511-522 (2018).
- Wang, J., et al. A cellular delivery system fabricated with autologous BMSCs and collagen scaffold enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (6), 1438-1447 (2012).
- Hao, C., et al. Therapeutic angiogenesis by autologous adipose-derived regenerative cells: comparison with bone marrow mononuclear cells. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 307 (6), H869-H879 (2014).
- Nemoto, M., et al. Adequate Selection of a Therapeutic Site Enables Efficient Development of Collateral Vessels in Angiogenic Treatment With Bone Marrow Mononuclear Cells. Journal of the American Heart Association. 4 (9), (2015).
- Mikami, S., et al. Autologous bone-marrow mesenchymal stem cell implantation and endothelial function in a rabbit ischemic limb model. PLoS One. 8 (7), (2013).
- Wang, S., et al. Transplantation of vascular endothelial growth factor 165transfected endothelial progenitor cells for the treatment of limb ischemia. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 4967-4974 (2015).
- Yin, T., et al. Genetically modified human placentaderived mesenchymal stem cells with FGF2 and PDGFBB enhance neovascularization in a model of hindlimb ischemia. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5093-5099 (2015).
- Annex, B. H. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischaemia. Nature Reviews Cardiology. 10 (7), 387-396 (2013).
- Das, S., et al. Syndesome Therapeutics for Enhancing Diabetic Wound Healing. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2248-2260 (2016).
- Jang, E., Albadawi, H., Watkins, M. T., Edelman, E. R., Baker, A. B. Syndecan-4 proteoliposomes enhance fibroblast growth factor-2 (FGF-2)-induced proliferation, migration, and neovascularization of ischemic muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1679-1684 (2012).
- Monteforte, A. J., et al. Glypican-1 nanoliposomes for potentiating growth factor activity in therapeutic angiogenesis. Biomaterials. 94, 45-56 (2016).
- Das, S., et al. Syndecan-4 Enhances Therapeutic Angiogenesis after Hind limb Ischemia in Mice with Type 2 Diabetes. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1008-1013 (2016).
- Das, S., Majid, M., Baker, A. B. Syndecan-4 enhances PDGF-BB activity in diabetic wound healing. Acta Biomaterialia. 42, 56-65 (2016).
- Das, S., Singh, G., Baker, A. B. Overcoming disease-induced growth factor resistance in therapeutic angiogenesis using recombinant co-receptors delivered by a liposomal system. Biomaterials. 35 (1), 196-205 (2014).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2014).
- Shafat, I., Ilan, N., Zoabi, S., Vlodavsky, I., Nakhoul, F. Heparanase levels are elevated in the urine and plasma of type 2 diabetes patients and associate with blood glucose levels. PLoS One. 6 (2), (2011).
- Wang, Y., et al. Endothelial cell heparanase taken up by cardiomyocytes regulates lipoprotein lipase transfer to the coronary lumen after diabetes. Diabetes. 63 (8), 2643-2655 (2014).
- Fan, C. L., et al. Therapeutic angiogenesis by intramuscular injection of fibrin particles into ischaemic hindlimbs. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 33 (7), 617-622 (2006).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Interventional Radiology. 16 (7), 991-998 (2005).
- Gowdak, L. H., et al. Adenovirus-mediated VEGF(121) gene transfer stimulates angiogenesis in normoperfused skeletal muscle and preserves tissue perfusion after induction of ischemia. Circulation. 102 (121), 565-571 (2000).
- Zhang, H., Wang, X., Guan, M., Li, C., Luo, L. Skeletal muscle evaluation by MRI in a rabbit model of acute ischaemia. The British Journal of Radiology. 86 (1026), 20120042 (2013).
- Jang, E., Albadawi, H., Watkins, M. T., Edelman, E. R., Baker, A. B. Syndecan-4 proteoliposomes enhance fibroblast growth factor-2 (FGF-2)-induced proliferation, migration, and neovascularization of ischemic muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1679-1684 (2012).
- Das, S., et al. Syndesome Therapeutics for Enhancing Diabetic Wound Healing. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2248-2260 (2016).
- Das, S., Majid, M., Baker, A. B. Syndecan-4 enhances PDGF-BB activity in diabetic wound healing. Acta Biomateriala. 42, 56-65 (2016).
- Baker, A. B., et al. Regulation of heparanase expression in coronary artery disease in diabetic, hyperlipidemic swine. Atherosclerosis. 213 (2), 436-442 (2010).
- Das, S., et al. Syndecan-4 Enhances Therapeutic Angiogenesis after Hind Limb Ischemia in Mice with Type 2 Diabetes. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1008-1013 (2016).
- Popesko, P., Rajtová, V., Ji Horák, A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals. , Wolfe Publishing. London. (1992).
