Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקר חלבוני ממברנה אלקטרוגניים על ידי מדידת שינויים בפוטנציאל הממברנה. בדיקה זו מספקת פלטפורמה לקריאה פונקציונלית של תעלות יונים מרובות המבוטאות אנדוגנית בשורות תאי אפיתל.
Abstract
מחקרים מבוססי פלואורסצנטיות מתאימים למבחני קורא לוחות בעלי תפוקה גבוהה של תאים בתרבית. הם שימשו בדרך כלל לקמפיינים לגילוי תרופות שהתמקדו בחלבוני תעלות יונים רקומביננטיים המתבטאים יתר על המידה בתאים כגון תאי HEK-293. עם זאת, יש דגש הולך וגובר על השימוש בקווי תאים רלוונטיים לרקמות לחקר ההשפעות של התערבויות במולקולות קטנות. הפרוטוקול הבא מתאר את ההתאמה של בדיקת פוטנציאל ממברנה מבוססת פלואורסצנטיות לחקר תעלות יונים המבוטאות אנדוגניות בשורות תאי אפיתל. בדיקת פוטנציאל הממברנה מפרטת בדיקת תפוקה גבוהה לפעילות תעלת כלוריד של וסת המוליכות הטרנסממברנית של סיסטיק פיברוזיס (CFTR) בשני קווי תאי אפיתל נחקרים נפוצים, Caco-2 ו- Calu-3. בנוסף, מאמר זה מתאר יישום חדשני של מערכת זו למדידת הפעילות של תעלת נתרן אפיתל (ENaC) בפורמט תפוקה גבוהה באותם קווי תאי אפיתל. יחד, בדיקות פלואורסצנטיות אלה מספקות פלטפורמה חזקה וגמישה לחקר אפנון מולקולות קטנות, המכוונות לשני ערוצי אפיתל בהקשר תאי רלוונטי.
Introduction
מבחני פעילות מבוססי פלואורסצנטיות ובתפוקה גבוהה של חלבוני ערוץ רקומביננטי היו יעילים ביותר בזיהוי מודולטורים של מולקולות קטנות שיש להם פוטנציאל להפוך לטיפולים עתידיים 1,2,3,4. אחת השיטות הנפוצות לסינון ספריות מולקולות קטנות עבור מודולטורים של תעלות יונים היא באמצעות מדידת שינויים בפוטנציאל הממברנה. בדרך כלל, מסכים אלה מתבצעים באמצעות ערוצים רקומביננטיים המבוטאים באופן הטרולוגי בקווי תאים כגון תאי HEK-293 5,6,7.
עם זאת, יש צורך באימות של "להיטים" בסוגי תאים רלוונטיים. אנו מציעים כי רצוי מסך משני בקווי תאים רלוונטיים המבטאים באופן אנדוגני את ערוצי העניין. מסך משני כזה יזהה את המודולטורים בעלי הסבירות הגבוהה ביותר להיות יעילים במבחני אימות סופיים המסתמכים על רקמות אנושיות ראשוניות פחות נגישות.
יש גם צורך במערכות בדיקה שיש להן את הגמישות לדווח על הפעילות של מטרות מרובות תעלות יונים באותו סוג רקמה. לדוגמה, יש ספרות מהותית שפורסמה התומכת ברעיון כי CFTR ו- ENaC אינטראקציה פונקציונלית 8,9,10. למרות שמספר קווי תאי אפיתל שנחקרו היטב ידועים כמבטאים הן CFTR והן ENaC, עד כה, תנאי הבדיקה לחקר שניהם באופן בתפוקה גבוהה לא תוארו.
בדיקת פוטנציאל ממברנה פלואורסצנטית זו היא רב-תכליתית, מכיוון שהיא משתמשת בבדיקה כימית אקסוגנית כדי למדוד את תפקודם של CFTR ו- ENaC, תוך עקיפת הצורך בבדיקות מקודדות גנטית11. כהוכחה עקרונית, שני קווי תאי אפיתל נפוצים נלמדים כדוגמאות כדי להדגיש את השלבים הקריטיים הדרושים למדידת פעילות הערוץ הן של CFTR והן של ENaC.
Protocol
1. ציפוי והתמיינות תאים
- תרבית תאי Calu-3 ו-Caco-2 ב-EMEM המכילים 20% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטוקו) בצלוחית T-75.
- ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80-100%, שואפים את התווך מבקבוק T-75.
- שטפו בעדינות את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
- הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין/0.1% EDTA שחומם מראש לחד-שכבה התאית ומקם את בקבוק T-75 בטמפרטורה של 37°C למשך כ-5 דקות כדי לאפשר לתאים להתרומם ממשטח הבקבוק התרבותי ולהתנתק לתרחיף חד-תאי.
- לאחר שהתאים מורמים מפני השטח של הבקבוק, נטרלו את התגובה עם 8 מ"ל של מדיום תרבית (שלב 1.1) ובסך הכל 10 מ"ל של השעיית תאים.
הערה: נתק מכנית גושי תאים לתרחיף חד-תאי עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. - לוחית את התאים על צלחת של 96 בארות (~ 140,000-150,000 תאים / באר) או צלחת של 384 בארות (~ 45,000-50,000 תאים / באר) במפגש של 30-40%.
- כדי לצלחת אחת מלאה של 96 בארות, הוסף 1.5 מ"ל של תרחיף התא ל -18.5 מ"ל של מדיום התרבית בצינור חרוטי של 50 מ"ל. לאחר הערבוב, להוסיף 200 μL של השעיית התא לכל באר.
- כדי צלחת אחת מלאה 384 באר, להוסיף 1 מ"ל של תרחיף התא ל 17 מ"ל של מדיום התרבית בצינור חרוטי 50 מ"ל. לאחר הערבוב, להוסיף 50 μL של השעיית התא לכל באר.
הערה: ודא שאין גושים של תאים, ותאים בודדים מפוזרים באופן שווה על פני כל באר.
- החליפו את המדיום כל יומיים לאחר הציפוי. אם התאים אינם מגיעים למפגש בו זמנית בין בארות שונות, השליכו את הצלחת וחזרו על שלב 1.5.
- לאחר הזרע, לחכות התאים להגיע 100% מפגש בתוך 3-5 ימים. שנה את המדיום 24 שעות לפני הלימודים הפונקציונליים.
2. הכנת פתרון מאגר בדיקה פונקציונלי CFTR
- הכינו את תמיסת החיץ נטולת הנתרן ונטולת הכלוריד עם הריאגנטים המפורטים בטבלה 1.
- הוסף את הריאגנטים לדרגת תרבית רקמה, H 2 O מזוקק כפול (ddH2O). הניחו לריאגנטים להתמוסס (במיכל סגור כדי למנוע אידוי) על ידי ערבוב לילה בטמפרטורת החדר.
- ברגע שהפתרון יציב, מדדו את ה- pH. אם ה- pH של התמיסה עולה על 7.4, הוסף 1 M N-methyl-D-glucamine (NMDG) פתרון טיפה כדי להתאים את ה- pH ל 7.4.
הערה: אין לכוונן את רמת החומציות של התמיסה עם HCl מכיוון שהתמיסה חייבת להישאר נטולת כלוריד. - אפשר לתמיסה לערבב עוד 30 דקות ולמדוד את האוסמולריות של התמיסה.
- להפחית את האוסמולריות של תמיסת החיץ לטווח פיזיולוגי של 300 ± 5 mOsm/kg.
- סנן ואחסן את תמיסת החיץ בבקבוקים סטריליים.
הערה: ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים. אם האחסון נשמר למשך יותר מ-6 חודשים, יש לבדוק את רמת החומציות והאוסמולריות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
3. בדיקה פונקציונלית CFTR
- יש להמיס את הצבע הפוטנציאלי של הממברנה בתמיסת חיץ נטולת נתרן וללא כלוריד (0.5 מ"ג צבע/1 מ"ל תמיסת חיץ) ולחמם אותו ל-37°C.
הערה: הימנע מחשיפת אבקת הצבע הפוטנציאלית של הממברנה לאור. - הסר את מדיום התרבית מחד-שכבות התאים Calu-3 או Caco-2 והוסף את התמיסה המכילה צבע לכל באר (195 μL לבאר עבור צלחת של 96 בארות, 95 μL לבאר עבור צלחת של 384 בארות).
הערה: ניתן להוסיף עד 112 μL לכל באר של לוחות 384 באר. - אפשרו לתאים לטעון את הצבע במשך 35 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- העבר את התאים, עמוסים בתמיסת צבע, לקורא לוחות הפלואורסצנטיים. קח מדידות פלואורסצנטיות מתחתית הצלחת, עם עירור = 530 ± 5 ננומטר, פליטה = 560 ± 5 ננומטר
- התחל על-ידי ביצוע קריאות בסיס רציפות במשך 5 דקות במרווחים של 30 שניות.
- הוסף 5 μL של תמיסה בריכוז נמוך של forskolin או DMSO לכל באר עבור ריכוז סופי של 1 μM forskolin (1x). קח קריאת גירוי במשך 20 דקות עם מדידות במרווחים של 15 שניות.
- עבור פורמט צלחת 96 בארות, להכין את ריכוז נמוך (40 μM forskolin (1:25 דילול)) פתרון של forskolin על ידי דילול 2 μL של 1 mM forskolin (1,000x) תמיסת מלאי או DMSO ב 48 μL של תמיסת חיץ נטולת נתרן ללא כלוריד.
הערה: פורסקולין בריכוז נמוך של 40 מיקרומטר ואחריו דילול שני (דילול 1:40) בשלב הבא לריכוז סופי של 1 מיקרומטר פורסקולין. - עבור פורמט צלחת 384 בארות, להכין את הריכוז הנמוך (20 μM forskolin (1:50 דילול)) פתרון על ידי דילול 1 μL של 1 mM (1,000x) תמיסת מלאי forskolin או DMSO ב 49 μL של תמיסת חיץ נטולת נתרן ללא כלוריד.
הערה: הפורסקולין בריכוז נמוך של 20 מיקרומטר ואחריו דילול שני (דילול 1:20) בשלב הבא לריכוז סופי של 1 מיקרומטר פורסקולין.
- עבור פורמט צלחת 96 בארות, להכין את ריכוז נמוך (40 μM forskolin (1:25 דילול)) פתרון של forskolin על ידי דילול 2 μL של 1 mM forskolin (1,000x) תמיסת מלאי או DMSO ב 48 μL של תמיסת חיץ נטולת נתרן ללא כלוריד.
- הוסף 5 μL של תמיסה בריכוז נמוך של CFTRInh172 לקבלת ריכוז סופי של 10 μM CFTRInh172. קח קריאת עיכוב במשך 15 דקות עם מדידות במרווחים של 30 שניות.
- עבור תבנית צלחת 96 בארות, הכן את תמיסת CFTRInh172 בריכוז נמוך (400 מיקרומטר CFTRInh172 (דילול 1:25)) על ידי דילול 2 μL של תמיסת מלאי CFTRInh172 (1,000x) של 10 mM בתמיסת מאגר נטולת נתרן וכלוריד של 48 μL.
הערה: CFTRInh172 בריכוז נמוך של 400 מיקרומטר ואחריו דילול שני (דילול 1:40) בשלב הבא לריכוז סופי של 10 מיקרומטר CFTRInh172. - עבור תבנית צלחת 384 בארות, הכן את תמיסת CFTRInh172 בריכוז נמוך (200 מיקרומטר CFTRInh172 (דילול 1:50)) על ידי דילול 1 μL של 10 mM CFTRInh172 (1,000x) תמיסת מלאי ב- 49 μL של תמיסת חיץ נטולת נתרן וללא כלוריד.
הערה: CFTRInh172 בריכוז נמוך של 200 מיקרומטר ואחריו דילול שני (דילול 1:20) בשלב הבא לריכוז סופי של 10 מיקרומטר CFTRInh172.
- עבור תבנית צלחת 96 בארות, הכן את תמיסת CFTRInh172 בריכוז נמוך (400 מיקרומטר CFTRInh172 (דילול 1:25)) על ידי דילול 2 μL של תמיסת מלאי CFTRInh172 (1,000x) של 10 mM בתמיסת מאגר נטולת נתרן וכלוריד של 48 μL.
- כמת את מדידות עוצמת הפלואורסצנטיות של כל באר, וייצא את הערכים כגיליון אלקטרוני בפורמט עמודה המכיל בארות בודדות. כדי לחשב שינויים הנגרמים על ידי פורסקולין, חלק את מדידות ה- RFU (יחידות פלואורסצנטיות יחסיות) מכל באר של לוח 96 או 384 בארות במדידת עוצמת הפלואורסצנטיות האחרונה של קריאת קו הבסיס והתווה אותן.
- לחלופין, כמת את תגובת העיכוב בתיווך CFTRInh172 כדי לאשר טוב יותר את הספציפיות של פונקציית CFTR 12, שכן טיפול אקוטי בפורסקולין עלול לגרום לדפולריזציה של הממברנה באמצעות פעילות של תעלות כלוריד אחרות, כגון SLC26A912.
- מדוד את תגובות השיא כמדידת עוצמת הפלואורסצנטיות המרבית מקו הבסיס במהלך גירוי פורסקולין. השתמש במדידה זו או באזור זה מתחת לעקומה כדי לכמת את תגובת CFTR.
4. הכנת פתרון חיץ בדיקה פונקציונלי של ENaC
- הכינו את תמיסת החיץ עתירת הנתרן, נטולת הכלוריד, עם הריאגנטים המפורטים בטבלה 2.
- ברגע שהפתרון יציב, מדדו את ה- pH. אם ה- pH של התמיסה נמוך מ- 7.4, הוסף תמיסת NaOH 1 N כדי להתאים את ה- pH ל- 7.4.
הערה: אין לכוונן את רמת החומציות של התמיסה עם HCl מכיוון שהתמיסה חייבת להישאר נטולת כלוריד. - להפחית את האוסמולריות של תמיסת החיץ לטווח פיזיולוגי של 300 ± 5 mOsm/kg.
- סנן ואחסן את תמיסת החיץ בבקבוקים סטריליים בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים.
הערה: אם שטח האחסון ארוך מ-6 חודשים, יש לבדוק את רמת החומציות והאוסמולריות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
5. בדיקה פונקציונלית של ENaC
- ממיסים את צבע פוטנציאל הממברנה בתמיסת חיץ עתירת נתרן, נטולת כלוריד (0.5 מ"ג צבע/1 מ"ל תמיסת חיץ) ומחממים אותו ל-37°C.
הערה: הימנע מחשיפת אבקת הצבע הפוטנציאלית של הממברנה לאור. - הסר את מדיום התרבית מחד-שכבות התאים Calu-3 או Caco-2 והוסף את התמיסה המכילה צבע לכל באר (195 μL לבאר עבור צלחות של 96 בארות, 95 μL לבאר עבור צלחות של 384 בארות).
הערה: הימנע מחשיפת תמיסת הצבע לאור. - אפשרו לתאים לטעון צבע במשך 35 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- העבר את התאים, עמוסים בתמיסת צבע, לקורא לוחות הפלואורסצנטיים. קרא מדידות פלואורסצנטיות מתחתית הצלחת, עם עירור = 530 ± 5 ננומטר, פליטה = 560 ± 5 ננומטר.
- התחל על-ידי ביצוע קריאות בסיס רציפות במשך 5 דקות במרווחים של 30 שניות.
- כדי לעכב את תפקוד ENaC, הוסף 5 μL של תמיסה בריכוז נמוך amiloride או תמיסה בריכוז נמוך DMSO מומס בתמיסת חיץ נתרן גבוהה, אפס כלוריד עבור ריכוז סופי של 10 μM amiloride.
- עבור פורמט צלחת 96 בארות, להכין את ריכוז נמוך (400 מיקרומטר amiloride (1:25 דילול)) פתרון של amiloride על ידי דילול 2 μL של 10 mM amiloride (1,000x) תמיסת מלאי ב 48 μL של תמיסת חיץ גבוהה נתרן, ללא כלוריד.
הערה: אמילוריד בריכוז נמוך של 400 מיקרומטר ואחריו דילול שני (דילול 1:40) בשלב הבא לריכוז סופי של 10 מיקרומטר אמילוריד. - עבור פורמט צלחת 384 בארות, הכינו את תמיסת האמילוריד בריכוז נמוך (200 מיקרומטר אמילוריד (דילול 1:50)) של אמילוריד על ידי הוספת 1 μL של 10 mM amiloride (1,000x) תמיסת מלאי ב-49 μL של תמיסת חיץ עתירת נתרן, נטולת כלוריד.
הערה: אמילוריד בריכוז נמוך של 200 מיקרומטר ואחריו דילול שני (דילול 1:20) בשלב הבא לריכוז סופי של 10 מיקרומטר אמילוריד.
- עבור פורמט צלחת 96 בארות, להכין את ריכוז נמוך (400 מיקרומטר amiloride (1:25 דילול)) פתרון של amiloride על ידי דילול 2 μL של 10 mM amiloride (1,000x) תמיסת מלאי ב 48 μL של תמיסת חיץ גבוהה נתרן, ללא כלוריד.
- בצע קריאת עיכוב במשך 60 דקות עם מדידות במרווחים של 45 שניות.
- חזור על שלב 3.7 לניתוח נתונים.
- מדוד את תגובת האמילוריד כאחוז עיכוב מקו הבסיס לנקודת הרמה, בערך 15-20 דקות לאחר הוספת אמילורידים. השתמש בהבדל זה כדי לכמת את תגובת ENaC.
Representative Results
כדי למדוד את פעילות תעלת CFTR, תאים ממוינים היטב ומודגרים בתמיסה חוץ-תאית ללא כלוריד המכילה את הצבע הרגיש לפוטנציאל הממברנה. פונקציית CFTR מזוהה באופן עקבי כדפולריזציה של הממברנה לאחר גירוי פורסקולין. שטף כלוריד מזוהה כעלייה חדה בפלואורסצנטיות בהשוואה לבקרת הרכב. האות הפלואורסצנטי נשמר עד להוספת מעכב CFTR (CFTRInh172), מה שמוביל לירידה מהירה בעוצמת הפלואורסצנטיות, כפי שניתן לראות בתאי Caco-2 (איור 1A), וניתן לשחזר אותו גם בתאי Caco-2 וגם בתאי Calu-3 (איור 1B). הערכת פעילות CFTR כהבדל בשינוי המקסימלי בפלואורסצנטיות לאחר פורסקולין או DMSO (רכב). נקודות בודדות נעו בין ± 3 סטיות תקן מגירוי הפורסקולין הממוצע (נקודות שחורות) או בקרת DMSO (נקודות אפורות), אשר התאימו לפקטור Z של 0.586. ציון מצוין זה הצביע על יכולת השחזור של בדיקה זו (איור 1C). במקרה שיש סחף קל בקו הבסיס, ניתן למזער את השפעת הסחף על ידי אקסטרפולציה של קו הבסיס לאורך כל העקבה לאחר ההפעלה עד לנקודת הוספת המעכב. ניתן לכמת את התגובה כשטח שמתחת לעקומה, כאשר הגבול התחתון מוגדר על ידי הקו האקסטרפולטיבי.
ניתן למדוד את פעילות ENaC גם בתאי אפיתל של דרכי הנשימה והמעי הגס הגדלים בצלחות של 96 בארות. בניגוד לבדיקה של פעילות ערוץ CFTR, תאים אלה שקועים בתמיסה עתירת נתרן, המאפשרת ספיגת נתרן באמצעות ENaC. עם תוספת חריפה של amiloride, ספיגת נתרן נחסם, ותאים חווים היפרפולריזציה יחסית של הממברנה. זה מוצג בתאי Caco-2 גם בריכוזים נמוכים (10 מיקרומטר) (איור 2A) וגם בריכוזים גבוהים (50 מיקרומטר) של אמילוריד (איור 2A,B) ובתאי Calu-3 עם ריכוז גבוה של אמילוריד (50 מיקרומטר) (איור 2B). בדיקת ENaC הורחבה לפורמט צלחת של 384 בארות והדגימה יכולת שחזור רבה בעיכוב ENaC. באופן דומה, הנקודות הבודדות נעו בין ± 3 סטיות תקן מעיכוב האמילוריד הממוצע (נקודות שחורות) או בקרת DMSO (נקודות אפורות). תגובת ENaC בתאי Calu-3 דיווחה על גורם Z של 0.629 עם טיפול אקוטי באמצעות אמילוריד (50 מיקרומטר) (איור 2C), מה שמצביע על כך שפרמטרים אלה תומכים בסינון בתפוקה גבוהה.
איור 1: מדידת תעלות CFTR כשינויים בדפולריזציה של הממברנה בתאי Caco-2 ו-Calu-3. (A) מעקב מייצג של גירוי CFTR עם פורסקולין (1 מיקרומטר) ובקרת DMSO בתאי Caco-2. (B) תרשים קופסה ושפם של גירוי פורסקולין בתאי Caco-2 ו-Calu-3 (**** P < 0.0001, n > 3 העתקים ביולוגיים, n > 3 שכפולים טכניים). שכפולים ביולוגיים הם מעברי קו תאים עצמאיים; העתקים טכניים מתייחסים לבארות עצמאיות של לוחות Multiwell. תרשים התיבה מתאר את הערך החציוני; הגבולות מתארים את IQR, כאשר השפם מגדיר את ערכי המינימה והמקסימום. (C) תרשים בלנד-אלטמן של תגובת CFTR ניתנת לשחזור עם גירוי פורסקולין בהשוואה לבקרת DMSO בתאי Caco-2. נקודות שחורות מייצגות שינויים מוחלטים מקסימליים בפלואורסצנטיות בתגובה לגירוי פורסקולין. נקודות אפורות מייצגות שינויים בפלואורסצנטיות בתגובה לבקרת DMSO. קיצורים: CFTR = וסת מוליכות טרנסממברנה סיסטיק פיברוזיס; DMSO = dimethyl sulfoxide; IQR = טווח בין-רבעוני; Fsk = forskolin; ΔF/F0 = שינוי בפלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מדידות עיכוב ENaC באמצעות היפרפולריזציה של הממברנה בתאי Caco-2 ו-Calu-3. (A) עקבות מייצגות של עיכוב ENaC עם אמילוריד (10 מיקרומטר) ביחס לבקרת DMSO בתאי Caco-2. (B) תרשים קופסה ושפם של עיכוב אמילוריד בתאי Caco-2 ו-Calu-3 (**** P < 0.0001, n > 3 העתקים ביולוגיים, n > 3 שכפולים טכניים). (C) תרשים בלנד-אלטמן של תגובת ENaC ניתנת לשחזור עם עיכוב אמילוריד בהשוואה לבקרת DMSO בתאי Calu-3. נקודות שחורות מייצגות שינויים מוחלטים מרביים בפלואורסצנטיות בתגובה לעיכוב אמילורידים. נקודות אפורות מייצגות שינויים בפלואורסצנטיות בתגובה לבקרת DMSO. קיצורים: ENaC = ערוץ נתרן אפיתל; DMSO = dimethyl sulfoxide; אמיל. = amiloride; ΔF/F0 = שינוי בפלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| שם | ריכוז |
| NMDG (N-מתיל-D-גלוקמין) | 150 מ"מ |
| חומצה גלוקונית לקטון | 150 מ"מ |
| אשלגן גלוקונאט | 3 מ"מ |
| HEPES | 10 מ"מ |
טבלה 1: ריאגנטים והריכוזים המתאימים שלהם לבדיקה פונקציונלית CFTR עם אפס נתרן וכלוריד. קיצור: CFTR = וסת מוליכות טרנסממברנה סיסטיק פיברוזיס.
| שם | ריכוז |
| נתרן גלוקונאט | 150 מ"מ |
| אשלגן גלוקונאט | 3 מ"מ |
| HEPES | 10 מ"מ |
טבלה 2: ריאגנטים והריכוזים המתאימים להם עבור חיץ בדיקה פונקציונלי של ENaC עם נתרן גבוה, אפס כלוריד. קיצור: ENaC = אפיתל נתרן (Na) ערוץ.
Discussion
במאמר זה תיארנו שיטות מבוססות פלואורסצנטיות למדידת פעילות CFTR ו-ENaC בקו תאי סרטן המעי הגס אפיתל, Caco-2, ובקו תאי סרטן הריאה באפיתל האנושי, Calu-3. ניתן להשתמש בבדיקות פוטנציאליות אלה של ממברנות בקווי תאי אפיתל כדי לאשר את יעילותן של תרכובות מודולטור של מולקולות קטנות, שזוהו בעבר במערכות ביטוי הטרולוגיות, לפני אימות סופי במבחנה בתרביות אפיתל ראשוניות שמקורן במטופל.
חובה לאשר כי המדידות הנ"ל מיוחסות כראוי לאפיק העניין. לדוגמה, המדידה המיוחסת ל- CFTR צריכה להראות תלות בביטוי חלבון CFTR ובכוח המניע האלקטרוכימי של כלוריד, אשר מווסת על ידי פורסקולין והמעכב CFTRInh-172. באופן דומה, ניתן לייחס את השינויים הפוטנציאליים בממברנה הנגרמים על ידי אמילוריד של 10 מיקרומטר ל- ENaC, אם הם מסתמכים על ביטוי חלבון ENaC וכוח מניע נתרן פנימי. למרות שאישרנו תכונות אלה של ENaC בתאי MDCK לאחר טרנספקציה עם כל שלוש תת-היחידות של ENaC 2, עדיין לא אישרנו רשמית כי תגובת האמילוריד שנמדדה בתאי Caco-2 ו- Calu-3 מוענקת על ידי ENaC. זה חשוב במיוחד, כמו amiloride יכול לווסת את הפונקציה של מחליף נתרן-פרוטונים NHE3 בנוסף ENaC13. באופן מתקבל על הדעת, היפרפולריזציה הנגרמת על ידי אמילוריד שנצפתה בבדיקה זו יכולה לשקף חלקית את ההשפעות העקיפות של החמצה תוך תאית על ערוצים אחרים. כדי לאשר שההיפרפולריזציה הנגרמת על ידי אמילוריד שנמדדה באמצעות צבע רגיש פוטנציאלי זה מוענקת על ידי ENaC בקווי התאים לעיל ובמערכות תאים מורכבות יותר, כגון רקמות הנגזרות מ- iPSC, אנו מאשרים כי פעילות זו אובדת על ידי השמטת תת-יחידה ENaC (בטא) מחייבת בשורות אלה.
ההצלחה של בדיקות אלה דורשת תשומת לב למספר גורמים. ראשית, תרבויות האפיתל חייבות להיות חופפות ומובחנות היטב. לצורך מדידת פונקציות CFTR ו-ENaC, יש לצפות כ-145,000 תאים לבאר בלוחות של 96 בארות או 45,000 תאים לבאר בלוחות של 384 בארות. ברגע שתאי האפיתל מגיעים למפגש (תוך 3-4 ימים מהציפוי), יש לאפשר 2-5 ימים של התמיינות. תזמון זה נקבע בעבר בהתבסס על ביטוי מקסימלי של חלבון CFTR על ידי immunoblotting14. באופן דומה, נקבע תזמון אופטימלי לביטוי ENaC פונקציונלי בשני קווי התא, Calu-3 ו- Caco-2.
חד-שכבות לא משתפכות או צמיחת יתר של תאים מובילה ליכולת רבייה נמוכה על פני שכפולים טכניים. במקרים בהם תאים בבארות בודדות אינם מגיעים למפגש בו זמנית, יש להשליך לוחות אלה. בנוסף, קריאות בסיסיות לא יציבות או היעדר תגובות גירוי עשויות להיות אינדיקציה לאיכות תאים ירודה, שיש להוציא מהניתוח. תגובות מופחתות למפעיל CFTR, פורסקולין או מעכב ENaC, אמילוריד, עשויות לשקף את השימוש בתאים שעברו מעבר מוגזם15. למרות שזה לא בעיה עבור תאי Calu-3 ו- Caco-2, תאים או רקמות אחרים עשויים שלא להיצמד היטב ללוחות ועשויים לדרוש ציפוי מוקדם של הבארות. לדוגמה, במחקרים קודמים הוצמדו לצלחות תרביות כולנגיוציטים דו-ממדיות באמצעות ציפוי קולגן16. לחלופין, היצמדות של רקמות מעיים דו ממדיות הוגברה באמצעות Poly-L-Lysine2.
יתר על כן, בבדיקת אפנון תעלות יונים על ידי מולקולות קטנות באמצעות בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות, חיוני להתייחס לממצאים פוטנציאליים המוענקים על ידי תכונות פלואורסצנטיות של המולקולות הקטנות. כדי לאשר את הספציפיות של תגובות פונקציונליות, ניתן לאמת עוד יותר את בדיקות פוטנציאל הממברנה באמצעות שיטות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונליות, כגון מחקרי שימוש17.
לאחר שאישרו כי התגובה המזוהה על ידי צבעים רגישים לפוטנציאל הממברנה מוענקת באופן ספציפי על ידי ערוץ העניין, לבדיקות אלה יש פוטנציאל עצום לאמת מודולטורים מבטיחים של תעלות יוני אפיתל בהקשר התאי הרלוונטי שלהם. פלטפורמה זו יכולה לגשר על הפער בין מסכי אפנן בעלי תפוקה גבוהה במערכות ביטוי הטרולוגיות לבין מדידות ביואלקטריות הגוזלות זמן רב ברקמות ראשוניות קשות לגישה.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לכריסטופר פלאד ול-SPARC BioCentre בבית החולים לילדים חולים על עזרתם בביצוע בדיקות פוטנציאל הממברנה המודדות CFTR ו-ENaC. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית CFIT במימון CF קנדה וקרן הילדים החולים. עבודה זו מומנה על ידי ממשלת קנדה באמצעות גנום קנדה ומכון הגנומיקה של אונטריו (OGI-148). מחקר זה מומן על ידי ממשלת אונטריו. S.X. נתמך על ידי האגודה הקנדית לגסטרואנטרולוגיה (CAG) Ph.D. Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
| EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
| FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
| HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
| Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
| Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
| Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |
References
- Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
- Xia, S., et al. High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids. Cells. 10 (12), 3419 (2021).
- Jiang, J. X., et al. A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).
- Hu, J., et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology. Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- Chen, M. X., et al. Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels. Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).
- Maitra, R., Sivashanmugam, P., Warner, K. A rapid membrane potential assay to monitor CFTR function and inhibition. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1132-1137 (2013).
- Mall, M. A. ENaC inhibition in cystic fibrosis: potential role in the new era of CFTR modulator therapies. European Respiratory Journal. 56 (6), 2000946 (2020).
- Moore, P. J., Tarran, R. The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Merkert, S., et al. High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).
- Bertrand, C. A., et al. The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).
- Frelin, C., et al. Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger. Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).
- Di Paola, M., et al. SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells. mBio. 8 (6), 02073 (2017).
- Schiavi, S. C., et al. Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells. American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).
- Ogawa, M., et al. Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 12 (1), 6504 (2021).
- Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool. Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).
