Overview
이 비디오는 제브라피시의 류오탁시스 분석법을 설명합니다. 이 방법은 서로 다른 자기장의 영향으로 다른 물 유량에 대한 응답으로 제브라피시의 방향 거동을 측정하는 것을 포함한다.
Protocol
1. 1차원 자기장 조작으로 자기장 설정
- 전원 장치(그림1A)를켭니다.
- 코일 터널을 류전술 프로토콜이 수행되는 위치에 놓지만(3절) 수영장치(도 1A)와분리된 상태로 유지한다. 터널 내부에 가우스/테슬라미터와 연결된 마그네틱 프로브를 배치하고 터널의 주요 축을 따라 선택한 자기장 값을 얻는 데 필요한 전압을 확인합니다.
참고: 솔레노이드의 자기 특성 때문에, 필드는 터널 내부의 합리적으로 균일하다; 이는 프로브를 수평 및 수직으로 천천히 이동하여 확인할 수 있습니다. - 프로브를 분리하고 유동 터널을 수영 장치에 연결합니다.
- 레오전술 프로토콜(섹션 3)으로 시작합니다.
2. 3차원 자기장 조작으로 자기장의 설정
- CPU, DAC 및 코일드라이버(그림 1B)를켭니다.
- 선택한 자기장을 세 축(x, y 및 z)의 각 하나에 설정합니다.
- 헬름홀츠 쌍 세트의 중앙에 터널을 배치합니다.
- 레오전술 프로토콜(섹션 3)으로 시작합니다.
3. 플로우 챔버에서 제브라피시 류오탁시스 시험
- 측면과 바닥이 가려진 2L 탱크를 사용하여 1~5마리의 물고기를 유동 터널로 옮길 수 있습니다.
- 펌프를 켜고 터널의 유량을 1.7cm/s로 설정합니다.
참고: 이 느리게 움직이는 물은 터널의 물을 산소화상태로 유지하고 동물 회복을 촉진합니다. - 동물들이 수영 터널에 1시간 동안 적응하게 하십시오.
- 터널에서 물고기의 동작에 대한 비디오 녹화를 시작합니다.
참고: 리모컨(예: 블루투스)이 있는 카메라(예: Yi 4K Action)를 사용하고 비디오를 .mpg(30프레임/s)로 저장했습니다. - 선택한 실험 프로토콜(본 연구에서 1.3cm/s)에 따라 유량의 단계별 증가를 시작합니다. 그림 2).
참고: 이 프로토콜의 경우, 우리는 제브라피시의 경우 0에서 2.8 BL (신체 길이)/s범위의 낮은 유량을 사용했습니다. 이러한 유량 속도는 제브라피시(임계 수영 속도의 3%-15%)에서 연속 지향적 인 수영을 유도하는 낮은 유량 의 흐름 범위에있습니다. 낮은 유량 (브렛의 프로토콜 에 따라)의 사용은 해류의 존재이 종의 특정 행동 특성에 연결됩니다. Zebrafish는 챔버의 주요 축을 따라 수영하는 경향이 있으며, 물 흐름이 있는 경우에도 자주 회전하며 상류와 하류를 모두 수영하는 경향이 있습니다. 이 동작은 동물이 지속적으로 상류를 향하여 수영할 때 상대적으로 빠른 속도(>8 BL/s)에서 사라지는 물 유량의 영향을 받습니다(전체 양성 반응). 수직 및 변위는 매우 드뭅니다. -
형태챔버에서 물고기 의 사진에 동물의 morphometry (섹스 및 총 길이 [TL], 포크 길이 [FL], 또는 BL)의 morphometry을 수행합니다.
- 적절한 그림을 선택합니다.
- ImageJ에서 그림을 엽니다.
- 동물의 성별에 주의하십시오 (수컷 얼룩말은 날씬하고 황색경향이 있으며 여성은 더 둥글고 파란색과 흰색 색색을 가진 경향이 있습니다).
- 터널의 전체 수평 길이를 참조로 사용하여 분석 및 gt; 설정 배율을 센티미터로 설정하고 이미지의 배율을 센티미터로 설정합니다.
- 분석 및 측정을 클릭하고 동물의 선형 길이를 기록합니다.
- 체중(BW)을 계산합니다.
참고: BW는 이전에 실험실또는 메타데이터에서 구축된 섹스-FL-BW 관계에서 계산됩니다. 전체 절차는 동물에 대한 조작 스트레스를 피합니다.
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Representative Results
도 1: 자기장 제어를 위한 설정. (A)터널 내의 정적, 수평 자기장의 유도를 위한 솔레노이드와 함께 수영 터널렌더링. 솔레노이드(0.83 회전/cm)는 동력 장치에 연결되어 있으며 ±250 μT(지구 자기장 범위를 포함하는 강도 범위)의 범위에서 필드를 생성합니다. 오른쪽에는 수영 장치에 연결된 솔레노이드 터널 의 사진이 표시됩니다. 터널은 아크릴로 만들어졌으며 물 입구에 두 개의 천포 아크릴 플레이트가 배치되어 있으며, 이는 라미나르에 가까운 흐름을 보장합니다. (B)지자기 범위의 강도 범위에서 자기장의 제어를 위해 설정된 3개의 직교 헬름홀츠 쌍의 다이어그램 및 사진. 자기장 프로브, CPU, 디지털-아날로그 컨버터 및 루프를 닫는 데 사용되는 코일 드라이버도 표시됩니다. 코일의 각 쌍은 30cm의 반경(r)과 N = AWG-14 구리 와이어의 50 회전두 개의 원형 코일로 구성됩니다. 선택 가능한 스케일(± 88 μT ~ ± 810 μT)을 가진 3축 자력계(센서)는 코일 세트의 중앙 에 가깝게 배치됩니다. 센서 범위는 ±130 μT에 이르는 값으로 설정됩니다. 이러한 값은 대표 결과에 설명된 측정에도 사용되었습니다(이러한 조건에서는 명목 센서 해상도가 약 0.1 μT). 자기장의 강도와 방향은 디지털 피드백 시스템으로 제어됩니다. 센서는 자기장 벡터(3축)의 세 가지 구성 요소를 측정하고 해당 오류 신호가 추출됩니다. 그런 다음 보정 신호는 간단한 통합필터에 의해 생성됩니다. 디지털 보정 신호는 디지털-아날로그 컨버터에 의해 전압으로 변환되고 적합한 코일 드라이버에 의해 증폭됩니다. 이 마지막 신호는 헬름홀츠 쌍을 구동하는 데 사용됩니다. 샘플링 주파수는 5Hz로 고정되고 루프의 통일 게인 주파수는 약 0.16Hz입니다. 코일의 Helmholtz 쌍의 전류가 설정되면, 총 자기장은 코일의 중앙 입방 부피 (가장자리 [L] = 10cm)의 평균 강도 값에서 2 % 미만 다양합니다. 측정 중에 자기장 rms는 0.2 μT 미만입니다. 설정(패널 A 및 B)모두에서 정적 전기장은 자기장을 생성하는 코일의 전류에 의해 생성된다. 최대 전류가 적용될 때 전기장의 강도는 약 0.4 V/m입니다. 이 값은 강도가 1kV/m의 순서인 환경에 존재하는 자연 또는 인공 정적 필드에 비해 무시할 수 있습니다.
그림 2:제브라피시의 류전술 임계값을 결정하는 테스트 중에 사용되는 유량의 다이어그램입니다. 1h 적응 기간 동안의 흐름은 동물에게 적절한 산소 공급을 보장하기에 충분했습니다. 이 설계를 통해 산소 공급은 흐름 0이 있는 첫 10분 단계에서도 결코 한계가 되지 않는다는 가정할 수 있습니다. 실제로, 약 7.9 mg/L의 27°C에서 물의 산소 함량과 1 mg/h.g의 동물 산소 소비(일상적인 조건하에서 와 저속 수영모두에서 제브라피시 산소 소비에 대한 과도한 근사치)를 통해, 수로의 Po2는 동물당 2% 이상 감소하지 않을 것이라는 계산이 가능하다(약 40μg).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9500 G meter | FWBell | N/A | Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT |
| AD5755-1 | Analog Devices | EVAL-AD5755SDZ | Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter |
| ALR3003D | ELC | 3.76024E+12 | DC Double Regulated power supply |
| BeagleBone Black | Beagleboard.org | N/A | Single Board Computer |
| Coil driver | Home made | N/A | Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI) |
| Helmholtz pairs | Home made | N/A | Coils made with standard AWG-14 wire |
| HMC588L | Honeywell | 900405 | Rev E Digital three-axis magnetometer |
| MO99-2506 | FWBell | 129966 | Single axis magnetic probe |
| Swimming apparatus | M2M Engineering Custom Scientific Equipment | N/A | Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback |
| TECO 278 | TECO | N/A | Thermo-cryostat |
