Zebrafisk Rheotaxis Assay: En metode til måling orientering adfærd som reaktion på forskellige vandgennemstrømningshastigheder

Overview

Denne video beskriver rheotaxis assay i zebrafisk. Metoden indebærer måling af zebrafisks orienteringsadfærd som reaktion på forskellige vandstrømshastigheder under indflydelse af forskellige magnetfelter.

Protocol

1.Opsætning af magnetfeltet med endimensional magnetfelt manipulation

1. Tænd for strømenheden (Figur 1A).
2. Placer den oprullede tunnel på det sted, hvor den reaktiske protokol skal udføres (afsnit 3), men hold den adskilt fra svømmeapparatet (Figur 1A). Placer en magnetisk sonde forbundet med et Gauss/Teslameter inde i tunnelen, og kontroller, hvilken spænding der er nødvendig for at opnå den valgte magnetfeltværdi langs tunnelens hovedakse.
   BEMÆRK: På grund af de magnetiske egenskaber af en magnetoid, feltet er rimeligt ensartet inde i tunnelen; dette kan kontrolleres ved langsomt at flytte sonden både vandret og lodret.
3. Afbryd sonden, og tilslut strømningstunnelen til svømmeapparatet.
4. Start med den reotaktiske protokol (afsnit 3).

2. Opsætning af magnetfeltet med tredimensionel magnetfelt manipulation

1. Tænd for CPU-, DAC- og spoledriverne (Figur 1B).
2. Indstil det valgte magnetfelt på hver af de tre akser (x, y og z).
3. Placer tunnelen i midten af Helmholtz par sæt.
4. Start med den reotaktiske protokol (afsnit 3).

3. Test af zebrafisk rheotaxis i Flow Afdeling

1. Overfør en til fem fisk til flowtunnelen ved hjælp af en 2 L-tank med siderne og bunden skjult.
2. Tænd for pumpen, og indstil strømningshastigheden i tunnelen til 1,7 cm/s.
   BEMÆRK: Dette langsomme vand vil holde vandet i tunnelen iltet, og det vil lette dyrenes genopretning.
3. Lad dyrene akklimatisere sig til svømmetunnelen i 1 time.
4. Start videooptagelsen af fiskens opførsel i tunnelen.
   BEMÆRK: Vi brugte et kamera (f.eks. Yi 4K Action) med fjernbetjening (f.eks. Bluetooth) og gemte videoen som .mpg (30 billeder/s).
5. Start den trinvise forøgelse af strømningshastigheden i henhold til den valgte forsøgsprotokol (1,3 cm/s i denne undersøgelse; Figur 2).
   BEMÆRK: Til denne protokol brugte vi lave strømningshastigheder, som for zebrafisk varierer fra 0 til 2,8 BL (kropslængder) / s. Disse strømningshastigheder er i det lavere interval af strømningshastigheder, der fremkalder kontinuerligt orienteret svømning i zebrafisk (3%-15% af kritisk svømmehastighed [U_crit]). Brugen af lave strømningshastigheder (efter Bretts protokol) er knyttet til de specifikke adfærdsmæssige egenskaber ved denne art i nærværelse af vandstrømme. Zebrafisk har tendens til at svømme langs kammerets store akse og dreje ofte, selv i nærvær af vandgennemstrømning, og har tendens til at svømme både opstrøms og nedstrøms. Denne adfærd påvirkes af vandgennemstrømningshastigheden og forsvinder ved relativt høje hastigheder (>8 BL/s), når dyrene kontinuerligt svømmer opstrøms (fuld positiv reotaktisk respons). Lodrette og tværgående forskydninger er meget sjældne.
6. Udfør dyrenes morfometriske (køn og total længde [TL], gaffellængde [FL] eller BL) på billeder af fisk i et morfometrisk kammer.
   1. Vælg det relevante billede.
   2. Åbn billedet i ImageJ.
   3. Vær opmærksom på dyrets køn (mandlige zebrafisk er slanke og har tendens til at være gullige, mens kvinder er mere afrundede og har tendens til at have blå og hvide farve).
   4. Klik på Analyser > Angiv skalering, og angiv billedets skala i centimeter ved hjælp af hele tunnelens vandrette længde som reference.
   5. Klik på Analyser > Mål og registrer dyrets lineære længde.
   6. Beregn dens kropsvægt (BW).
      BEMÆRK: BW beregnes ud fra sex-FL-BW-relationer, der tidligere er bygget i laboratoriet eller fra metadata. Hele proceduren undgår manipulation af stress på dyrene.

Representative Results

Figur 1:Opsætning tilmagnetfeltkontrol. (A) Gengivelse af svømmetunnelen med en magnetoid til induktion af et statisk, vandret magnetfelt i tunnelen. Solenoiden (0,83 drejninger/cm) er forbundet til en kraftenhed, og den genererer felter i området ±250 μT (intensitetsområde, der omfatter jordens magnetfeltområde). I højre side vises et billede af den magnettunnel, der er forbundet med svømmeapparatet. Tunnelen er lavet af akryl, og den har to perforerede akrylplader placeret ved vandindtaget, som garanterer, at strømmen er tæt på laminar. (B) Diagram og foto af de tre ortogonale Helmholtz-par, der er indstillet til kontrol af magnetfeltet i det geomagnetiske interval af intensiteter. Magnetfeltsonden, CPU'en, den digitale-til-analoge konverter og spoledriverne, der bruges til at lukke løkken, vises også. Hvert par spoler består af to cirkulære spoler med en radius (r) på 30 cm og N = 50 omgange AWG-14 kobbertråde. Et magnetometer med tre akser (sensor) med valgbar skala (± 88 μT til ± 810 μT) placeres tæt på midten af spolesættet. Sensorområdet er indstillet til værdier, der spænder til ±130 μT. Disse værdier blev også anvendt til de målinger, der er beskrevet i de repræsentative resultater (under disse forhold er den nominelle sensoropløsning ca. 0,1 μT). Magnetfeltets intensitet og retning styres med et digitalt feedbacksystem. Sensoren måler de tre komponenter i magnetfeltvektoren (de tre akser), og de tilsvarende fejlsignaler udtrækkes. Derefter genereres korrektionssignalerne af et simpelt integratorfilter. De digitale korrektionssignaler konverteres til spænding af en digital-til-analog konverter og forstærkes af en passende spoledriver. Disse sidste signaler bruges til at drive Helmholtz-parrene. Prøveudtagningsfrekvensen er fastgjort til 5 Hz, og sløjfernes enhedsforøgelsesfrekvens er ca. 0,16 Hz. Når strømmene i Helmholtz-spolernes par er indstillet, varierer det samlede magnetfelt mindre end 2% fra middelintensitetsværdien i det centrale kubiske volumen (med kant [L] = 10 cm) af spolerne. Under målingerne er magnetfeltet rms mindre end 0,2 μT. I begge opsætninger (paneler A og B) genereres et statisk elektrisk felt af strømmen i spolerne, der producerer magnetfeltet. Intensiteten af det elektriske felt er ca. 0,4 V/m, når den maksimale strøm påføres. denne værdi er ubetydelig i forhold til naturlige eller kunstige statiske felter i miljøet, hvis intensitet er i størrelsesordenen 1 kV/m. 

Figur 2: Diagram over de strømningshastigheder, der blev anvendt under testene til bestemmelse af den reotaktiske tærskel for zebrafisk. Strømmen i akklimatiseringsperioden på 1 time var tilstrækkelig til at sikre en tilstrækkelig iltforsyning til dyrene. Det kan antages, at med dette design er iltforsyning aldrig en grænse, selv i de første 10 minutters trin med flow 0. Faktisk med et iltindhold i vand ved 27 °C på ca. 7,9 mg/l og et iltforbrug hos dyr på 1 mg/h.g (en overskydende tilnærmelse til zebrafisks iltforbrug både under rutinemæssige forhold og ved lavhastighedssvømning) er det muligt at beregne, at Po₂ i flume ikke vil falde mere end 2% pr. dyr, idet den forbliver et godt stykke over den kritiske Po₂ (ca. 40 torr for zebrafisk).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3.76024E+12	DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405	Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat