Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

Introduction

L'uso di modelli animali per lo studio BPCO è impegnativo, perché nessun modello può riprodurre perfettamente tutte le caratteristiche della malattia umana ^(2). La maggior parte dei ricercatori utilizzano topi per modellare la BPCO a causa delle somiglianze tra i topi e gli esseri umani nella loro polmonari fisiologia, patologia, genetica, e metaboliti. Inoltre, i topi sono relativamente poco costoso per studiare, e sia l'enfisema e la piccola rimodellamento delle vie aeree si sviluppano entro 6 mesi di esposizione CS ^(5,7-9).

Il fumo di sigaretta indotta BPCO: Diversi metodi possono indurre BPCO nei topi. Molti ricercatori espongono topi per CS, che è il fattore eziologico principale per BPCO umana. Esposizione CS per 6 mesi provoca lo sviluppo di enfisema e piccole rimodellamento delle vie aeree (SAR) nei topi, ma la gravità della malattia che viene indotta varia a seconda del ceppo murino studiata. Per esempio, i topi NZWLacZ sono resistenti allo sviluppo di enfisema CS-indotta che AKR / J topi sono extremely sensibili ^(10). La maggior parte dei ricercatori studiano C57BL / 6 topi deformazione del modello di esposizione CS come tanti topi del gene targeting sono disponibili in questo ceppo. Dopo 6 mesi di esposizione CS, enfisema e fibrosi piccole vie aeree sviluppano in wild type (WT) C57BL / 6 topi, ed entrambe le lesioni sono relativamente mite a gravità ^(5,10). I ricercatori utilizzano due tipi di CS dell'esposizione: esposizioni naso-solo e tutto il corpo. I principali svantaggi del naso di sola tecnica di esposizione sono che: 1) si tratta di un metodo più alta intensità di manodopera; e 2) topi devono essere trattenuto in piccole sezioni che possono indurre una risposta allo stress e ipertermia negli animali ^(11). Il principale svantaggio di esposizione al corpo intero (qui descritto) è che gli animali possono ingerire (così come inalare) nicotina e catrame prodotti quando hanno pulito la loro pelliccia. I topi esposti a corpo intero CS hanno livelli di carbossiemoglobina inferiori e ridotto la perdita di peso corporeo rispetto animali esposti a naso sola CS ^(12).

test di funzionalità polmonare (PFT): Misure di compliance polmonare e elastanza solito sono simili in C57BL / 6 wild type (WT) topi esposti all'aria o CS per 6 mesi a causa della enfisema relativamente mite che si sviluppa quando il ceppo è esposto CS ^(10). Tuttavia, quando la distruzione enfisematosa è più grave, aumenti di compliance polmonare e si sposta a sinistra del volume pressione (PV) flusso loop possono essere rilevati. Quest'ultimo può essere osservato, per esempio, in ceppi murini che sono più sensibili agli effetti di CS ^(10), in CS-esposti / 6 ceppo topi C57BL gene-targeting che hanno un tipo di enfisema più grave di C57BL / 6 topi WT ^(13), o in topi CS-esposti soggetti a cambiamenti ambientali che li rendono più sensibili agli effetti di CS ^(14). Questo protocollo utilizza un piccolo ventilatore animali per misurare la riduzione del ritorno elastico del polmone (aumento della compliance polmonare quasi statica [Cost] e riduzioni nel tessutoelastanza [H]), flussi di loop PV, e cambiamenti nella resistenza delle vie aeree e dei tessuti in topi anestetizzati ^(15,16).

Misure di enfisema polmonare: Analisi dello sviluppo dell'enfisema in CS-esposti C56BL / 6 ceppo topi è impegnativo, perché la sua distribuzione è spazialmente eterogenea. Diversi metodi differenti quantificano l'allargamento dello spazio aereo nei topi. Il primo metodo è stato utilizzato il mezzo di intercettazione lineare (L _m) ^(17). Tuttavia, il metodo L _m è un lento processo manuale che non può catturare l'eterogeneità della malattia (a meno che tutte le sezioni del polmone vengono campionati a caso) e il suo impiego può quindi introdurre bias osservatore nell'analisi. L'indice distruttivo [DI, ^(18)] quantifica anche l'allargamento dello spazio aereo utilizzando un foglio trasparente con 50 punti equamente distribuiti posizionati sopra un'immagine digitalizzata stampata di un ematossilina e la sezione del polmone eosina macchiato. Il metodo PI punteggi zona circostante ogni punto accondo la misura in cui i condotti alveolari e pareti alveolari all'interno di questa zona sono distrutti. Lo svantaggio principale del metodo DI è che richiede tempo e non più preciso di altri metodi ^(19,20).

Questo misure protocollo significano lunghezza della corda alveolare e zona alveolare su sezioni polmonari in paraffina colorate con macchia di Gill. Morfometria software converte le immagini di sezioni polmonari alle immagini binarie (in cui il tessuto è bianco e spazio aereo è nero), e poi sovrappone una griglia uniforme di linee orizzontali e verticali (corde) e il software poi quantifica la lunghezza di ciascuna corda all'interno di aree individuate dalla software come spazio aereo. Utilizzando questo metodo, è possibile misurare le dimensioni degli alveoli in tutte le parti del polmone in modo standardizzato e relativamente automatizzato ^(21).

Piccolo rimodellamento delle vie aeree (SAR): La maggiore deposizione di proteine ​​ECM (soprattutto interstitial collagene) intorno piccole vie aeree tra gli animali CS-esposti e contribuisce a ostruzione delle vie aeree. I ricercatori non studiano SAR in modelli animali di BPCO frequentemente come sviluppo enfisema ^(22). Per quantificare SAR in topi CS-esposti, questo protocollo utilizza il software di analisi di immagine per misurare lo spessore dello strato di proteine ​​ECM che si deposita intorno piccole vie aeree (airways avente un diametro medio compreso tra 300 e 899 m) nelle sezioni polmonari paraffina colorati con colorazione tricromica di Masson.

Protocol

Il protocollo prende ~ 25 settimane per completare. Il protocollo topi nell'aria o fumare esposto per 24 settimane. Al termine delle esposizioni fumo, le misure di protocollo funzione polmonare nei topi, e polmoni sono gonfiati ad una pressione fissa, fissi, e rimossi lo stesso giorno. È necessario più tempo per il ricercatore di incorporare, tagliare, e macchiare sezioni polmonari (2-3 giorni), e la cattura e analizzare le immagini (2-4 giorni a seconda del numero di animali studiati). Questo protocollo può anche essere usato per misurare senile allargamento dello spazio aereo nei topi.

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato Istituzionale presso il Brigham and Women 's Hospital / Harvard Medical School.

1. corpo intero Cigarette Smoke Exposure

1. Esporre i topi a fumare in un dispositivo di esposizione al fumo di tutto il corpo (vedi Figura 1) installato in una cappa aspirante.
   NOTA: Il dispositivo di carica automaticamente sigarette di ricerca nella ruota, lIRITTI le sigarette, e raccoglie side-stream fumo nella camera di raccolta di fumo side-stream, e espelle le sigarette. La macchina unisce lato corrente di fumo con fumo tradizionale estratta dalla sigaretta da una pompa per creare una miscela di tradizionale e lato-corrente di fumo. La ventola nella camera di miscelazione e diluendo mescola il fumo con aria ambiente e spinge il fumo in camere di esposizione.
2. Inserire gabbie contenenti i topi senza i coperchi gabbia rimossi (Figura 1) nella camera di esposizione. Lasciare che il mouse per muoversi liberamente nelle loro gabbie e avere accesso al cibo e all'acqua per la durata dell'esposizione al fumo (~ 1,75 h).
3. Mettere un secchio pieno d'acqua sotto la camera di sigaretta per spegnere le sigarette proiettati. Eseguire etanolo (100%) attraverso la pompa e collegarlo al dispositivo. Passare sull'elemento microprocessore del dispositivo, che avvia il caricamento automatico delle sigarette, sbuffi della pompa, e il riscaldamento della ligh sigaretteting filo.
4. I carichi di dispositivi, luci, fumi e 10 sigarette in un momento e poi espelle le sigarette usati e li sostituisce con un nuovo lotto di 10 sigarette e ripete questo processo. Ogni ciclo dura 9 min.
5. Acclimatarsi topi per fumare esponendoli al fumo di 20 sigarette il primo giorno, 40 sigarette al secondo giorno, 60 sigarette il terzo giorno, 80 sigarette al quarto giorno, e 100 sigarette al quinto giorno. Durante il periodo di acclimatazione, osservare attentamente i topi per i segni di sofferenza.
6. Dopo 5 giorni di acclimatazione, esporre i topi a 100 sigarette al giorno, 5 o 6 giorni-per-settimana per 6 mesi. È necessario Questo livello di esposizione al fumo di indurre l'allargamento dello spazio aereo relativamente modesto in C57BL / 6 topi wild-type (23,24). Esporre i topi di controllo all'aria ambiente per 6 mesi. Pesare i topi prima fumo acclimatazione e settimanale, successivamente per valutare l'effetto di esposizione al fumo sul peso corporeo.
7. Monitorare il particolato totale sospesomateria (TSPM) nelle camere di esposizione, dopo i primi 60 sigarette è stato fumato:
   1. Pesare carta da filtro e posto in un portafiltro in linea che è collegata ad un filtro di prelievo temporizzato e misuratore di gas secco. Il campionatore a filtro temporizzata tira aria dalla camera di esposizione attraverso la carta filtro e il contatore misura gas Il flusso d'aria durante il campionamento.
      NOTA: Il filtro trattiene particelle come 20 m ³ di aria camera di esposizione passa attraverso il filtro (misurata sul contatore gas secco).
   2. Calcolare il conteggio TPM come la variazione in peso del filtro prima e dopo il campionamento (in mg) per m ³ di aria. Conta TPM ideali sono tra 150 e 200 mg / m ^3.
8. Dopo che tutte le sigarette sono stati fumato, rimuovere le gabbie dalla camera di esposizione e osservare i topi di segni di sofferenza per 20 min.
9. Pulire la pompa con il 100% di etanolo dopo ogni utilizzo, e pulire tutte le porte e le barre nella macchina bi-settimanale per la promozionecircolazione dell'aria ed evitare accumulo di catrame.

2. Pulmonary Function Test (PFT) e del polmone Inflazione

1. Al termine delle esposizioni, anestetizzare ciascun topo fornendo un cocktail di ketamina (100 mg / kg), xilazina (10 mg / kg), e acepromazina (3 mg / kg) per via intraperitoneale in 200 ml di soluzione salina (USP grade) e utilizzare pomata veterinaria sugli occhi per evitare che si secchi. Attendere l'animale è in un piano chirurgica di anestesia, valuta utilizzando il metodo toe-pinch.
2. Shave anteriore della pelle alla trachea, e disinfettare la regione con una soluzione contenenti iodio seguito da etanolo. Eseguire un'incisione mid-line attraverso la pelle e anteriore del tessuto sottocutaneo alla trachea con le forbici in autoclave, e separare i muscoli sterno-tiroideo con una pinza per esporre la trachea.
3. Passare una lunghezza di 2 pollici di sutura seta posteriore alla trachea, fare una tracheotomia sulla faccia anteriore della trachea con autoclavato tforbici Racheal, inserire una cannula tracheale (18 G) nella tracheotomia, e fissarlo in posizione con la sutura.
4. Collegare il mouse alla Y-tubo dell'adattatore del ventilatore meccanico tramite la cannula tracheale, e iniziare la ventilazione meccanica con un volume corrente di 10 ml / kg e una frequenza respiratoria di 150 respiri / min.
   NOTA: E 'importante in questa fase per garantire che il mouse sia adeguatamente anestetizzato per ottenere misure accurate PFT. Re-dosare il mouse con anestetici se l'animale non è in un piano chirurgica di anestesia. L'intera durata di tutte le manovre PFT è di circa 7,5 min, quindi non è solitamente necessario ritrattare topi con anestetici una volta raggiunto un piano chirurgica di anestesia. Il tempo totale di induzione dell'anestesia all'eutanasia è ~ 20 minuti.
5. Gonfiare i polmoni a capacità polmonare totale (TLC) 3 volte per una storia di volume per misurare la capacità inspiratoria (IC) e ridurre atelettasia dei polmoni. Avanti, perform la singola frequenza forzata manovra di oscillazione (SnapShot-150 perturbazione) e valutare la resistenza dinamica (R), elastanza (Ers) e la conformità (Crs) del sistema respiratorio, seguito dalla frequenza a banda larga di oscillazione forzata manovra (Quick Prime-3 perturbazione ) e misurare la resistenza delle vie aeree centrale (R _n), resistenza del tessuto (G), elastanza tessuto (H) e il rapporto G / N (). Infine, registrare quasic-static compliance (C _st) durante le manovre di flusso volume-pressione.
6. Ripetere ognuno di queste manovre cinque volte (o eseguire misure aggiuntive fino ad ottenere valori costanti) e gonfiare per TLC tre volte tra ogni serie di misurazioni ripetute. Riportare il valore medio per ciascun parametro per ogni mouse.
7. Rimuovere il mouse dal ventilatore meccanico, e eutanasia con narcosi CO ₂ seguita da dislocazione cervicale [questo metodo l'eutanasia sia approvato dal nostro Animal Care and Use Committee Istituzionale]. Tagliare il diaframma, open torace sulla linea mediana, e rimuovere le costole anteriori per esporre i polmoni. Sezionare pelle e del tessuto sottocutaneo intorno alla trachea e passare una seconda lunghezza 2 pollici di sutura di seta posteriormente alla trachea.
8. Preparare l'attrezzatura per gonfiaggio polmonare (figura 2):
   1. Riempire una beuta conica 500 ml ¾ con PBS sterile, sigillare con un tappo di gomma, invertire, e sospensione su un supporto ad anello (in modo che il menisco della pH7.4 tampone fosfato salino (PBS) è di 25 cm sopra cuore del mouse).
   2. Inserire un'estremità di un dono endovenosa impostare nel PBS nel pallone attraverso il tappo di gomma. Inserire una lunghezza di 6 pollici di una pipetta sierologica plastica attraverso il tappo di gomma in modo che la sua apertura si trova sopra il menisco del PBS per permettere all'aria di sostituire PBS lasciare il pallone.
   3. Aprire la valvola del set dare ed eseguire PBS se il sistema a scovare aria dal set dare.
9. Collegare il intravenous dare insieme alla cannula tracheale, aprire la valvola, e consentire PBS di fluire nei polmoni per gravità fino gonfiare i polmoni completamente. Chiudere la valvola, legare trachea utilizzando la sutura distale chirurgica alla cannula tracheale, e rimuovere la cannula.
10. Sollevare la trachea con una pinza, e tagliare la trachea prossimale al nodo, e sezionare il tessuto connettivo posteriormente alla trachea ei polmoni. Rimuovere con attenzione i polmoni (senza di loro intaccare), e posizionare i polmoni in una provetta contenente il 10% di formalina salina tamponata. Fissare i polmoni O / N a RT, e il giorno dopo, lavarli con PBS due volte.
11. Incorpora i polmoni in paraffina, tagliato a 5 micron sezioni spesse, e quindi macchiare le sezioni con macchia di Gill, come indicato di seguito.

3. enfisema

1. Colorazione di Gill di sezioni polmonari in paraffina
   1. Porre i vetrini in un rack di plastica e incubare a 70 ° C per 20-30 minuti in un forno.
   2. De-pariffinize le diapositiveda essi incubazione per 2 minuti in ciascuna delle quattro cambi di xilene.
   3. Reidratare i vetrini da essi incubazione per 2-3 minuti in ciascuna delle due cambi di 100% etanolo, seguito da 2-3 min in ciascuna delle due cambi di etanolo al 95%, e poi lavare i vetrini due volte in PBS per 2-3 min per ogni cambio di soluzione.
   4. Incubare i vetrini per 18-48 ore in una miscela 1: 1 di ematossilina di Gill e modificato Harris ematossilina.
   5. Lavare i vetrini per 2 min in ciascuna delle cinque porzioni di acqua distillata, e disidratare i vetrini incubando poi per 2-3 min in ciascuna delle due cambi di etanolo al 95%, seguito 2-3 min in ciascuna delle 2 cambi di 100% etanolo.
   6. Cancellare i vetrini da essi incubando per 2 min in ciascuna delle quattro cambi di xilene.
   7. Montare i vetrini con mezzo di montaggio chiare e aggiungere un copri senza bolle introduzione, che ostacolano la successiva analisi.
2. Acquisizione delle immagini Randomized:
   1. Acquisire le immagini in bianco e nero come file TIFFs utilizzando un microscopio, un obiettivo 20 X, e una telecamera e software in grado di acquisire immagini digitali di alta qualità.
   2. Cattura ~ 20-30 immagini (X 200 ingrandimenti) per topo in modo randomizzato, con l'osservatore accecato alla condizione sperimentale, evitando aree gonfiati sotto del polmone.
   3. Nastro un micro-slide campo-finder sul vetrino. Il cercatore campo ha una griglia contenente una serie di quadrati contrassegnate con una lettera (in direzione verticale) e un numero (in direzione orizzontale) e ogni quadrato ha una croce (+) al centro ed è individuato da una lettera e numero (ad esempio, A1, A2, ...... Z25).
   4. Utilizzare un campo casuale Generator foglio di calcolo Excel per selezionare casualmente una piazza per la cattura delle immagini. Per creare una lettera a caso, entra EFGHJKLMNPQRSTU in cella B1 nel foglio di calcolo (il ricercatore può regolare questo intervallo di lettere per coprire la gamma delle piazze identificate da una lettera che si sovrappongono i polmoni). Avanti, aggiungere la formula [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] alla cella C1 per selezionare casualmente una lettera in C1. Copia e incolla C1 in C2, C3, C4 eccetera per generare una colonna di lettere casuali.
   5. Per creare un numero casuale nella colonna adiacente, digitare la formula = RANDBETWEEN (5,25) in D1 (dove 5-25 è la tipica gamma di tessuto sul vetrino). Facoltativamente, regolare questo intervallo per coprire la gamma di quadrati identificati da un numero che sovrastare i polmoni.
   6. Copia e incolla in D1 D2, D3, D4 eccetera per generare una colonna di numeri casuali accanto che contengono lettere casuali. Così, ogni riga contiene una coppia di lettere generati casualmente e numeri corrispondenti alle etichette sulle piazze campo mirino (ad esempio, E17, H24 ....).
   7. Posizionare il vetrino sul microscopio. Utilizzando l'obiettivo microscopio 4X trovare la casella corrispondente nella slitta campo cercatore (ad esempio, E17, H24 ...) e posizionare questa piazza al centro del campo di microscopio.
   8. Allineare il centro della microscopicacampo con il "+" al centro della piazza selezionato. Rimuovere il finder campo, concentrarsi sul polmone con l'obiettivo del microscopio 20X e acquisire l'immagine come file TIF in scala di grigi. Se copertine tessuto polmonare <50% del campo microscopico, selezionare il successivo quadrata generato in modo casuale. Ripetere fino a ~ 20-30 immagini vengono catturate per ogni animale. Salva tutte le immagini per ogni animale in una singola cartella etichettata con il numero di tag dell'animale in modo che il rapporto macro di Excel per riconoscere i file.

4. Morfometria misurare enfisema

Il protocollo utilizza Scion immagine e le macro personalizzate per analizzare l'allargamento dello spazio aereo. Scion immagine è una versione compatibile con Windows dell'originale NIH applicazione immagine che gira sotto il sistema operativo Macintosh. Scion Immagine gira sotto Windows XP ed è ancora disponibile online attraverso Wikiversity.org, dove una ricerca di 'Scion Immagine' dirigerà l'utente a collegamenti con ilmanuali e beta 4.0.2 rilascio di Scion immagine. L'installazione e il software di funzionamento è dettagliato nel manuale supplemento on-line e riassunti di seguito. La macro lunghezza della corda alveolare è stato adattato dal macro disponibili in NIH immagine.

1. Preparare l'immagine TIFF di sezione polmone macchiato del Gill per Scion analisi delle immagini:
   1. Inizia Scion immagine e caricare le macro come indicato nel supplemento in linea. Selezionare l'Open Brightfield immagine [1] macro per selezionare e aprire il file di immagine TIFF. Avanti, utilizzare gli strumenti di modifica dell'immagine per preparare l'immagine per l'analisi.
   2. Utilizzare lo strumento pennello per forzare aree dell'immagine che non sono lo spazio aereo o muri alveolari da trattare sia come spazio aereo o come tessuto. Ad esempio, vernici bronchi e vasi nero in modo che essi sono analizzati come tessuto. Vernice cellule infiammatorie (o polvere) che occupano spazio in bianco alveoli a che essi sono così spazio aereo.
   3. Selezionare il colore pennello cliccando il puntatore del mouse sulparole nere o bianche nella parte inferiore della finestra LUT. Avanti, fare clic sullo strumento pennello. Per modificare la dimensione del pennello, fare doppio clic sullo strumento pennello e immettere una dimensione del pennello adeguata. Fare clic e trascinare il mouse sopra l'immagine per dipingere strutture colore selezionato (vedi sopra 1 #).
2. Misurazione lunghezza della corda media dello spazio aereo
   1. Selezionare la Chord Lunghezza macro Air [2] per misurare la lunghezza dello spazio aereo degli accordi.
   2. Soglia l'immagine prima, cliccando con il mouse vicino al centro dell'immagine trascinare il mouse verso l'alto o verso il basso per regolare il valore di soglia (un numero compreso tra 0 e 255, che viene visualizzata nella finestra Info). Istruzioni mouse una seconda volta per accettare il valore di soglia. Regolare la soglia per rendere le pareti alveolari lo stesso spessore come nelle immagini originali.
      NOTA: E 'fondamentale che il ricercatore non sotto-soglia e quindi creare interruzioni nei muri alveolari che non esistono nell'immagine originale che produrràartificialmente i valori di lunghezza elevata accordi.
   3. Il programma rimuove automaticamente singoli pixel (pixel singole nero circondato da 8 pixel bianchi).
   4. em> 4.2.4. Osservare una finestra che chiede all'utente di ri-soglia l'immagine binaria, continua la macro, o annullare la macro. Per di nuovo la soglia, di rispondere Y alla richiesta e selezionare il pulsante OK.
   5. em> 4.2.5. Visualizza una finestra griglia orizzontale e verticale con le linee 5 pixel a parte creati dalle macro. Il programma misura le lunghezze delle linee orizzontali e verticali che si sovrappongono spazio aereo.
   6. Salvare il file in una cartella qualsiasi, ma non cambiare il nome di default altrimenti le macro di Excel report non troveranno il file (il formato è il nome dell'immagine con l'aggiunta di "CLa.txt" per la lunghezza dello spazio aereo degli accordi.
      NOTA: Se il programma non fa misurazioni, il valore di soglia può essere troppo basso (deve essere> 1). In questo caso, il ricercatore re-soglie l'immagine con un valore più alto.
   7. em> 4.2.7. Per alveolari misurazioni dell'area (oltre e corda lunghezze), eseguire l'ulteriore [4] e [5] macro pure.
   8. em> 4.2.8. Continuare fino a quando tutte le immagini sono state analizzate.
3. Analizzando i risultati utilizzando Excel Rapporto Macro
   1. Aprire Excel Rapporto 20x.xls. Attivare manualmente macro, se necessario, a seconda delle impostazioni di sicurezza di default nella versione di Excel in uso.
   2. Osservare un elenco di macro nella finestra Macro (vedi tabella 1).
      NOTA: CL_Air_1 riporta lunghezza della corda degli spazi aerei per un singolo animale (cartella). CL_Air_Multi riporta lunghezza della corda degli spazi aerei per più animali (cartelle). AP_No_Edge_1 riporta l'area degli alveoli senza contatti bordo di un animale singolo (cartella) .AP_No_Edge_Multi riporta superficie degli alveoli senza contatti bordo per più animali (cartelle). AP_With_Edge_1 riporta area di alveoli con contatti bordo per un singolo animale (cartella). AP_With_Edge_Multi riporta area di alveoli con bordo contatti per più cartelle.
   3. Scegliere la macro CL_Air_Multi segnalare alveolari misure di lunghezza corda per più cartelle corrispondenti alle immagini da più topi. Il programma riporta tutti i file _CLa.txt nelle cartelle selezionate. Omettere un file _CLa.txt (se necessario) spostandolo in una sottocartella della cartella corrente o rinominare la parte _CLa.
   4. Dalla finestra del file, selezionare una cartella alla volta evidenziando la cartella, quindi selezionare OK (il programma non supporta la selezione multipla in una sola volta). Come si seleziona ogni cartella, osservare nel foglio di lavoro. Selezionare "Annulla" o chiudere la finestra del file per continuare.
      NOTA: a seconda della versione di Excel, il ricercatore potrebbe essere necessario tornare indietro di un livello cartella dopo aver selezionato ogni cartella.
   5. Osservare un foglio di lavoro separato per ogni cartella, che mostra le statistiche per ogni file _CLa.txt seguito da statistiche per i dati di lunghezza accordi combinati da tutti i file _CLa.txt.
   6. Rinominare e salvare il foglio di calcolo. Il nome del file predefinito è il nome della cartella principale con l'aggiunta di _CLa.xls. Chiudere il foglio di lavoro prima di selezionare un'altra macro.

5. Piccolo Airway ritocca

1. La colorazione e l'acquisizione di immagini
   1. Macchia sezioni polmonari con colorazione tricromica di Masson utilizzando un kit commerciale e seguire le istruzioni del produttore.
   2. Cattura immagini di tutte le vie aeree in entrambi i polmoni che possono essere alloggiati completamente (compreso lo strato blu all'esterno le vie aeree che è lo strato di proteine ​​ECM che vengono depositati) all'interno di un'area di immagine utilizzando l'obiettivo 20X sul microscopio.
      NOTA: Larger vie aeree non sono associati con un aumento deposizione di proteine ​​ECM in topi CS-esposti.
   3. Salvare le immagini a colori come file jpeg.
2. L'analisi delle immagini: Aprire il file di immaginenel programma software di analisi dell'immagine.
   1. Aprire e il nome del file di registro per registrare le misurazioni.
   2. Selezionate uno strumento di disegno di linea. Disegnare 4 linee attraversano il lume vie aeree (diametro interno) per misurare le dimensioni delle vie aeree e solo includono quei airways avente le dimensioni desiderate nell'analisi. Successivamente, elaborare 12 linee equidistanti (nella posizione nelle vie aeree corrispondenti ai numeri di un orologio) estendentesi dal bordo dello strato avventiziale battuta le vie aeree verso il bordo della regione blu-tinto circondata le vie aeree per misurare lo spessore dello strato di proteine ​​ECM depositati fuori le vie aeree (Figura 5). Evitare le zone in cui le vie aeree interagisce con altre vie respiratorie o vasi di misura.
   3. Primo record di tutte le linee di diametro interno nel file di registro, e quindi registrare le 12 linee che misurano lo spessore dello strato di ECM blu intorno alle vie respiratorie.
   4. Chiudere l'immagine quindi aprire l'immagine successiva.
   <li> Ripetere questa procedura fino a quando tutte le immagini per l'animale sono stati registrati in una cartella.
   5. Iniziare dal passaggio 5.2 per la cartella successiva che contiene le immagini catturate su sezioni polmonari dal prossimo animale. Uscire dal programma dopo aver completato l'analisi di tutte le vie in sezioni polmonari da tutti gli animali dell'esperimento.
   6. Inserire le 4 misure di diametro interno e 12 ECM strato di proteine ​​misure di spessore registrati per ciascuna delle vie aeree per ogni mouse nei file di registro dati in un foglio di calcolo Excel. La media dei diametro e proteine ​​ECM misure di spessore strato per ogni animale.
   7. Convertire le misure da pixel a micron.
   8. Gruppo le vie aeree in base alla loro dimensione, diametro interno (ad es., 300-399 micron, 400-499 micron, ecc) e confrontare ECM spessore strato di proteine ​​misure intorno vie respiratorie che hanno dimensioni simili per l'aria contro topi fumo esposti (ad es., airways aventi un diametro di 300-899 micron;
   9. Se necessario, sezioni polmonari immunostain per le proteine ​​singole (compresi collagene interstiziale e proteine ​​della membrana basale) ed effettuare un'analisi simile per quantificare deposizione di proteine ​​di interesse utilizzando questo metodo.

Representative Results

Questo protocollo inizia con l'esposizione del corpo intero di topi per CS. Un'adeguata sorveglianza e la manutenzione del dispositivo e monitoraggio dei TPM conta garantire esposizioni fumo costanti (Figura 1). È importante che il ricercatore pratica la tecnica di gonfiaggio polmonare utilizzando il dispositivo di gonfiaggio

Questo protocollo inizia con l'esposizione del corpo intero di topi per CS. Un'adeguata sorveglianza e la manutenzione del dispositivo e monitoraggio dei TPM conta garantire esposizioni fumo costanti (Figura 1). È importante che le pratiche ricercatore la tecnica gonfiaggio polmonare utilizzando il dispositivo di gonfiaggio (Figura 2) e accuratamente rimuove il polmone dopo il gonfiaggio per ottenere sezioni polmonari ben gonfiati per l'analisi accurata dell'allargamento spazio aereo. La figura 3A mostra un polmone ben gonfiato mentre la figura 3B mostra un polmone male gonfiato. Figura 3C mostra l'immagine di una sezione polmone gonfiato preparato per la soglia sTEP (macrofagi negli spazi alveolari sono dipinte di bianco, e navi e bronchi sono dipinte di nero per generare. Il passo della soglia crea un'immagine binaria in cui tutti i pixel nello spazio alveolare sono il bianco e tutti i pixel in aree del polmone che non sono alveoli sono nere (Figura 3D). Figura 3E e 3F mostrano la corda alveolare verticale e orizzontale lunghezze che le macro generano, rispettivamente.

Test di funzionalità polmonare mostrano modesti (e non statisticamente significativo) a sinistra cambiamenti nel volume di pressione (PV) loop riflette modesta perdita del ritorno elastico del polmone coerente con l'enfisema lieve che si sviluppa in C57BL / 6 topi WT esposti al CS per 6 mesi ( Figura 4A). Cambiamenti significativi sinistra nelle anse fotovoltaici sono osservati solo in ceppi murini che sono molto sensibili agli effetti di CS o in topi gene-targeting CS-esposti aventi un fenotipo dell'enfisema più grave di CS-esposti C57BL / 6 topi WT.

Ficoure 5 mostra immagini rappresentative tricromica macchiato sezioni polmonari di Masson di C57BL / 6 topi WT esposti all'aria (figura 5A) o CS (Figura 5B) per 6 mesi che illustrano aumenti ECM deposizione di proteine ​​intorno piccole vie respiratorie negli animali CS-esposti. Figura 5C illustra come un programma software di analisi di immagine quantifica ECM proteina deposizione attorno alle vie respiratorie avente il diametro interno desiderato. Figura 5D mostra l'analisi di proteine ​​ECM deposizione attorno vie aeree con un diametro di 300-899 micron di CS-esposti C57BL / 6 topi WT.

Figura 1. Un cartone del sistema di esposizione sigaretta corpo intero. Un dispositivo di esposizione al fumo è collegato a una camera di esposizione al fumo. Smoke si estrae dalla camera di raccolta side-stream e il fumo si estrae dallale sigarette dalla pompa, e entrambi i campioni fumo sono mescolati e diluiti con aria ambiente nella miscelazione e diluizione camera (a sinistra), e poi il fumo scorre nella camera di esposizione. Il ricercatore pone topi nelle loro gabbie in camera di esposizione (a destra); topi sono in grado di muoversi liberamente nelle loro gabbie, e avere accesso al cibo e all'acqua per la durata dell'esposizione fumo.

Figura 2. inflazione dei polmoni murini. Il ricercatore riempie un pallone con PBS sterile, guarnizioni con un tappo di gomma, e inverte e assicura una distanza di 25 cm sopra il cuore dell'animale utilizzando un supporto ad anello. Un set di donazione per via endovenosa offre la PBS ai polmoni attraverso la cannula tracheale. Una pipetta cut-down sierologica viene inserito attraverso il tappo di gomma e questo permette all'aria nel pallone per sostituire il volume di PBS che possa scorrere nel lungs dei topi per gravità.

Figura 3. Analisi enfisema. (A) mostra un'immagine rappresentativa di Gill's-macchia gonfiato sezioni polmonari da topi esposti all'aria o CS per 6 mesi, le frecce nere indicano una nave e macrofagi alveolari. (B) mostra una immagine rappresentativa di un polmone sotto-gonfiato che non è adatto per l'analisi. (A) mostra il "prima" e (C) mostra il "dopo" immagine di una sezione polmone rappresentativo che il ricercatore prepara per la generazione di un'immagine binaria. Le frecce nere in (A) e (C) indicano sia un recipiente (che il ricercatore dipinge nero (C)) o macrofagi alveolari (che il ricercatore vernici bianche in (C)). (D) < / Strong> mostra l'immagine binaria dopo il ricercatore esegue la fase di soglia. (E) e (F) mostra la corda alveolare orizzontale e verticale lunghezze che il ricercatore genera rispettivamente. Ingrandimento di tutte le immagini è x bar 200. Scala che rappresenta 400 micron è mostrato in (A).

Curve Figura 4. alveolare lunghezza della corda e pressione-volume. (A) mostra una tipica analisi di lunghezze accordo alveolari in C57BL / 6 topi WT esposti all'aria (n = 13) o CS (n = 24) per 6 mesi. L'asterisco indica p <0,001. (B) mostra cicli tipici fotovoltaici effettuate su C57BL / 6 topi WT esposti all'aria (n = 13) o CS (n = 14) per 6 mesi. I dati sono espressi come media + SEM.

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Figura 5. Piccolo rimodellamento delle vie aeree (SAR) di valutazione. (A) e (B) mostrano immagini rappresentative di tricromica macchiato sezioni polmonari di Masson da C57BL / 6 topi WT esposti all'aria (A) o CS (B) per 6 mesi. (C) mostra come il software di analisi di immagine analizza SAR nei topi CS-esposti. (D) mostra misurazioni tipici dello spessore dello strato di proteine ​​della matrice extracellulare depositata intorno piccole vie aeree avente un diametro di 300-899 m in C57BL / 6 topi WT esposti all'aria (n = 11) o CS (n = 16) per 6 mesi. I dati sono espressi come media + SEM e asterisco indica p <0.05.

Barre di scala sono mostrati sulle immagini di ciascuna sezione polmone.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032