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Biology

माइक्रो-विच्छेदित माउस Choroid Plexuses से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव और लक्षण वर्णन

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63487
Automatic Translation
1, 2, 2, *1, *1
1Brain-Immune Communication Lab, Institut Pasteur, 2Cytometry platform, CB UTechS, Institut Pasteur
* These authors contributed equally

Summary

यह अध्ययन प्रवाह साइटोमेट्री और अलग-अलग चूहों के मस्तिष्क कोरॉइड प्लेक्सस पर दो अलग-अलग गेटिंग रणनीतियों का उपयोग करता है; यह प्रोटोकॉल मुख्य प्रतिरक्षा सेल सबसेट की पहचान करता है जो इस मस्तिष्क संरचना को पॉप्युलेट करते हैं।

Abstract

मस्तिष्क को अब अलगाव में काम करने वाले अंग के रूप में नहीं माना जाता है; संचित साक्ष्य से पता चलता है कि परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली में परिवर्तन अप्रत्यक्ष रूप से मस्तिष्क समारोह को आकार दे सकते हैं। मस्तिष्क और प्रणालीगत परिसंचरण के बीच इंटरफ़ेस पर, कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी), जो रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा का गठन करते हैं, को परिधि-से-मस्तिष्क संचार की एक प्रमुख साइट के रूप में हाइलाइट किया गया है। सीपी मस्तिष्कमेरु द्रव, न्यूरोट्रॉफिक कारकों और सिग्नलिंग अणुओं का उत्पादन करता है जो मस्तिष्क होमोस्टैसिस को आकार दे सकते हैं। सीपी भी एक सक्रिय immunological आला रहे हैं. मस्तिष्क पैरेन्काइमा के विपरीत, जो मुख्य रूप से शारीरिक परिस्थितियों में माइक्रोग्लिया द्वारा आबाद होता है, सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विषमता अन्य परिधीय अंगों में पाई जाने वाली विविधता को दोहराती है। सीपी प्रतिरक्षा कोशिका विविधता और गतिविधि उम्र बढ़ने, तनाव और बीमारी के साथ बदलती है और सीपी उपकला की गतिविधि को संशोधित करती है, जिससे अप्रत्यक्ष रूप से मस्तिष्क समारोह को आकार दिया जाता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मुरीन सीपी को अलग करना और मुख्य प्रतिरक्षा सबसेट के लगभग 90% की पहचान करना है जो उन्हें पॉप्युलेट करते हैं। यह विधि सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को चिह्नित करने और परिधि-से-मस्तिष्क संचार को व्यवस्थित करने में उनके कार्य को समझने के लिए एक उपकरण है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल यह समझने में मदद कर सकता है कि सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाएं अप्रत्यक्ष रूप से स्वास्थ्य में और विभिन्न रोग स्थितियों में मस्तिष्क समारोह को कैसे संशोधित करती हैं।

Introduction

19 वीं शताब्दी के अंत में पॉल एर्हलिच द्वारा रक्त-मस्तिष्क बाधा की खोज के बाद से, मस्तिष्क को अन्य अंगों और रक्तप्रवाह से वस्तुतः अलग माना जाता है। फिर भी, इस पिछले दशक ने इस अवधारणा के उद्भव को देखा है कि मस्तिष्क समारोह विभिन्न जैविक कारकों द्वारा आकार दिया जाता है, जैसे कि आंत माइक्रोबायोटा और प्रणालीगत प्रतिरक्षा कोशिकाएं और सिग्नल 1,2,3,4। समानांतर में, मेनिन्जेस और कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) जैसे अन्य मस्तिष्क सीमाओं को निष्क्रिय बाधा ऊतक5,6,7,8 के बजाय सक्रिय प्रतिरक्षा-मस्तिष्क क्रॉस टॉक के इंटरफेस के रूप में पहचाना गया है।

सीपी रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा का गठन करता है, मस्तिष्क और परिधि को अलग करने वाली सीमाओं में से एक। वे मस्तिष्क के चार वेंट्रिकल्स में से प्रत्येक में स्थित हैं, यानी, तीसरा, चौथा, और दोनों पार्श्व वेंट्रिकल्स, और न्यूरोजेनेसिस में शामिल क्षेत्रों जैसे कि सबवेंट्रिकुलर ज़ोन और हिप्पोकैम्पस 3 के सबग्रेन्युलर ज़ोन से सटे हुए हैं। संरचनात्मक रूप से, सीपी उपकला कोशिकाओं के एक मोनोलेयर द्वारा संलग्न फेनेस्टेड रक्त केशिकाओं के एक नेटवर्क से बना होता है, जो तंग और अनुपालन जंक्शनों 9,10 द्वारा परस्पर जुड़े होते हैं। सीपी एपिथेलियम की प्रमुख शारीरिक भूमिकाओं में मस्तिष्कमेरु द्रव का उत्पादन शामिल है, जो मस्तिष्क को अपशिष्ट चयापचयों और प्रोटीन समुच्चय से फ्लश करता है, और हार्मोन और न्यूरोट्रॉफिक कारकों सहित विभिन्न सिग्नलिंग अणुओं के उत्पादन और नियंत्रित रक्त-से-मस्तिष्क मार्ग 11,12,13। सीपी आकार मस्तिष्क की गतिविधि से स्रावित अणु, यानी, न्यूरोजेनेसिस और माइक्रोग्लियल फ़ंक्शन को संशोधित करके 14,15,16,17,18,19, जो सीपी को मस्तिष्क होमियोस्टैसिस के लिए महत्वपूर्ण बनाता है। सीपी भी विभिन्न प्रतिरक्षा गतिविधियों में संलग्न हैं; जबकि गैर-पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत मस्तिष्क पैरेन्काइमा में मुख्य प्रतिरक्षा सेल प्रकार माइक्रोग्लिया है, सीपी प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की विविधता परिधीय अंगों 3,7 के रूप में व्यापक है, यह सुझाव देते हुए कि प्रतिरक्षा विनियमन और सिग्नलिंग के विभिन्न चैनल सीपी पर काम कर रहे हैं।

एंडोथेलियल और उपकला कोशिकाओं के बीच की जगह, सीपी स्ट्रोमा, मुख्य रूप से सीमा से जुड़े मैक्रोफेज (बीएएम) द्वारा आबाद है, जो भड़काऊ संकेतों के जवाब में एंटीजन प्रस्तुति से संबंधित प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स और अणुओं को व्यक्त करते हैं3। मैक्रोफेज का एक अन्य उपप्रकार, कोलमर की एपिप्लेक्सस कोशिकाएं, सीपी एपिथेलियम 20 की एपिकल सतह पर मौजूद हैं। सीपी स्ट्रोमा डेंड्राइटिक कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, बेसोफिल, न्यूट्रोफिल, जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं और टी कोशिकाओं के लिए भी एक आला है जो ज्यादातर प्रभावकारी स्मृति टी कोशिकाएं हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र एंटीजन 7,21,22,23,24 को पहचानने में सक्षम हैं। इसके अलावा, सीपी पर प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की संरचना और गतिविधि प्रणालीगत या मस्तिष्क की गड़बड़ी पर बदलजाती है, उदाहरण के लिए, उम्र बढ़ने के दौरान 10,14,15,21,25, माइक्रोबायोटा गड़बड़ी 7, तनाव 26, और रोग 27,28। विशेष रूप से, इन परिवर्तनों को अप्रत्यक्ष रूप से मस्तिष्क समारोह को आकार देने का सुझाव दिया गया था, यानी, Th2 सूजन की ओर CP CD4 + T कोशिकाओं का एक बदलाव मस्तिष्क की उम्र बढ़ने में होता है और CP से प्रतिरक्षा सिग्नलिंग को ट्रिगर करता है जो उम्र बढ़ने से जुड़े संज्ञानात्मक गिरावट को आकार दे सकता है14,15,21,25,29 . सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के गुणों को रोशन करना इस प्रकार सीपी उपकला शरीर विज्ञान और स्राव पर उनके नियामक कार्य को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण होगा और इस प्रकार स्वस्थ और रोग की स्थिति में मस्तिष्क समारोह पर उनके अप्रत्यक्ष प्रभाव को समझना होगा।

सीपी छोटी संरचनाएं हैं जिनमें केवल कुछ प्रतिरक्षा कोशिकाएं होती हैं। उनके अलगाव को परफ्यूजन के प्रारंभिक चरण के बाद माइक्रोडिसेक्शन की आवश्यकता होती है; रक्तप्रवाह में प्रतिरक्षा कोशिकाएं अन्यथा प्रमुख संदूषकों का गठन करेंगी। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके सीपी के माइलॉयड और टी सेल सबसेट को चिह्नित करना है। यह विधि प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के लगभग 90% की पहचान करती है जो गैर-भड़काऊ स्थितियों के तहत माउस सीपी की रचना करती है, हाल ही में प्रकाशित कार्यों के अनुसार प्रतिरक्षा सीपी विषमता को विच्छेदित करने के लिए अन्य तरीकों का उपयोग करके 7,10,28। इस प्रोटोकॉल को विवो में रोग और अन्य प्रयोगात्मक प्रतिमानों के साथ सीपी प्रतिरक्षा सेल डिब्बे में परिवर्तन को चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाएं प्रयोगशाला जानवरों की हैंडलिंग के लिए यूरोपीय आयोग के दिशानिर्देशों के साथ सहमत थीं, निर्देश 86/609 / ईईसी। उन्हें नैतिक समितियों संख्या 59 द्वारा अनुमोदित किया गया था, CETEA / CEEA नंबर 089 द्वारा, संख्या dap210067 और APAFIS # 32382-20210709170555505 v1 के तहत।

1. सामग्री की तैयारी

  1. सभी एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जो प्रकाश जोखिम से सुरक्षित है।
  2. DAPI स्टॉक समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल): पीबीएस में पाउडर को फिर से निलंबित करें - / - (सामग्री की तालिका), एलीकोट, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. DAPI काम समाधान (0.1 मिलीग्राम / एमएल): पीबीएस के साथ DAPI स्टॉक समाधान पतला - / - 1: 10 के अनुपात में।
  4. चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (MACS) बफर: पीबीएस में 2 mM एथिलीन डायमाइन टेट्राएसिटिक एसिड (EDTA) और 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) (सामग्री की तालिका) तैयार करें।
  5. कोलेजनेस IV स्टॉक समाधान (20 U / μL): PBS + / + (सामग्री की तालिका), एलीकोट, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर में पाउडर को फिर से निलंबित करें।
    नोट: कोलेजनेस IV को MgCl2 को पूरी तरह से सक्रिय होने की आवश्यकता होती है; फ्रीज-thaw कोलेजनेस चतुर्थ समाधान मत करो.
  6. एनेस्थेटिक-एनाल्जेसिक समाधान: पीबीएस के 1 मिलीलीटर में केटामाइन के 150 μL (150 मिलीग्राम / किग्रा), xylazine के 25 μl (5 मिलीग्राम / किग्रा), और 330 μl buprecare (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) को पीबीएस के 1 मिलीलीटर में मिलाएं।
    नोट: एनेस्थेटिक-एनाल्जेसिक समाधान को असाधारण रूप से तैयार करें और इसे एक दिन से अधिक समय तक न रखें।
  7. हेपरिन समाधान (100 यू / एमएल): पीबीएस में पाउडर को फिर से निलंबित करें - /
  8. जलसेक इनसेट प्रणाली एक ट्यूब को पीबीएस से भरे डिकेंटर एर्लेनमेयर से जोड़ने के लिए तैयार करें- / जलसेक ट्यूब के चरम पर एक 23 जी सुई कनेक्ट करें। जलसेक इनसेट खोलें और पीबीएस को तब तक चलने दें जब तक कि ट्यूब में कोई बुलबुले न हों।
  9. एक प्रकाश से सुसज्जित दूरबीन loupe तैयार करें।

2. C57BL/

  1. सीपी माइलॉयड या टी कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए, प्रत्येक के लिए चार चूहों का उपयोग करें और चार सीपी (प्रत्येक पार्श्व वेंट्रिकल से दो, तीसरा वेंट्रिकल और चौथा वेंट्रिकल सीपी; कुल मिलाकर आठ चूहों के लिए) को पूल करें। सीपी पूलिंग नहीं करने से सीपी में दुर्लभ प्रतिरक्षा आबादी का पता लगाने में विफल रहने का खतरा होता है क्योंकि उनकी कम बहुतायत होती है।
  2. किसी भी प्रयोग से पहले चूहों को कम से कम 7 दिनों के लिए अनुकूलित होने दें। चूहों को निरंतर तापमान और आर्द्रता पर रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में रखें, 12/12 घंटे या 14/10 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र में, पानी और मानक पैलेट फूड विज्ञापन लिबिटम के साथ।

3. पीबीएस परफ्यूजन और मस्तिष्क विच्छेदन

  1. प्रत्येक माउस वजन और एनेस्थेटिक-एनाल्जेसिक मिश्रण समाधान (चरण 1.6) के 10 μL / g intraperitoneally इंजेक्ट करें।
  2. कुशल एनाल्जेसिया के लिए लगभग 30 मिनट प्रतीक्षा करें (माउस के अंकों को चुटकी देकर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें)।
  3. विच्छेदन समर्थन पर, इसकी पीठ पर एनेस्थेटिक माउस फ्लैट की स्थिति, और विच्छेदन समर्थन के लिए अपनी हथेलियों को टेप करें।
  4. संदंश के साथ जानवर की त्वचा को चुटकी लेना और कैंची का उपयोग करना, दिल को उजागर करने के लिए पेट, डायाफ्राम और वक्ष को खोलना।
    नोट: जब वक्ष खोला जाता है, तो मस्तिष्क एनोक्सिक हो जाता है। एक परफ्यूजन के अगले चरणों के माध्यम से ठीक से और तेजी से आगे बढ़ना चाहिए।
  5. 100 U/mL हेपरिन समाधान के 20 μL को सीधे बाएं वेंट्रिकल में इंजेक्ट करें।
  6. ठीक कैंची के साथ, रक्त को शरीर से बाहर निकलने की अनुमति देने के लिए दाएं आलिंद में कम से कम 3 मिमी का चीरा बनाएं।
  7. इसके तुरंत बाद, बाएं वेंट्रिकल की नोक के माध्यम से जलसेक ट्यूब के छोर पर रखी गई 23 जी सुई डालें।
  8. जलसेक प्रणाली को अधिकतम पर खोलें और पूर्ण परफ्यूजन की प्रतीक्षा करें: लगभग 6 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर 23 जी सुई का उपयोग करके, परफ्यूजन 3 मिनट में पूरा हो जाता है।
    नोट: जिगर जैसे अंगों का भी मलिनकिरण परफ्यूजन प्रभावकारिता के लिए प्रमाणित करता है।
  9. जलसेक प्रणाली को बंद करें और दिल वेंट्रिकल से सुई को हटा दें।
  10. माउस की हथेलियों से टेप निकालें। माउस को एक वेंट्रल स्थिति में रखें।
  11. संदंश के साथ जानवर की त्वचा को चुटकी लेना और कैंची का उपयोग करके, सिर के शीर्ष की त्वचा को आंखों से कानों तक हटा दें।
  12. कैंची की मदद से, खोपड़ी को पहले आंखों के बीच और फिर प्रत्येक आंख से रीढ़ की हड्डी तक मैसीटर मांसपेशियों के ठीक ऊपर काटें। इसके लिए कैंची के चरम का उपयोग करें और कैंची के साथ मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए धीरे से आगे बढ़ें।
  13. आंखों के बीच के छोर से चुटकी लेकर संदंश के साथ खोपड़ी को खोलें।
  14. रीढ़ की हड्डी को काटने और संदंश के साथ मस्तिष्क को निकालने के लिए कैंची का उपयोग करें, इसे झुकाव करने के लिए मस्तिष्क के पार्श्व पक्ष पर अपने दो बिंदुओं को रखें और इसे बर्फ-ठंडे पीबीएस + / + से भरे पेट्री डिश में रखें। सीपी को तुरंत एकत्र किया जाता है।
    नोट: परफ्यूजन प्रभावकारिता को सत्यापित करने के लिए मस्तिष्क के मलिनकिरण के लिए जाँच करें।

4. मस्तिष्क से Choroid प्लेक्सस का विच्छेदन

  1. पेट्री डिश में और दूरबीन loupes के उद्देश्यों के नीचे मस्तिष्क पृष्ठीय पक्ष की स्थिति.
  2. जगह में मस्तिष्क को बनाए रखने के लिए संदंश की मदद से, गोलार्धों के बीच मध्य रेखा के माध्यम से नीचे एक और संदंश के दो सिरों को डालें।
  3. सेप्टम से दूर कॉलोसम और हिप्पोकैम्पस के साथ कॉर्टेक्स को खींचने के लिए संदंश का उपयोग करें, पार्श्व वेंट्रिकल और तीसरे वेंट्रिकल के एक हिस्से को उजागर करें।
  4. पार्श्व सीपी को पार्श्व वेंट्रिकल को अस्तर करने वाले एक लंबे घूंघट के रूप में पहचानें जो दोनों सिरों पर फड़फड़ा रहा है। पार्श्व CP को पकड़ने के लिए एक पतली संदंश के दो सिरों का उपयोग करें। त्रिकोणीय पीछे के हिस्से को इकट्ठा करने के लिए सावधान रहें जो हिप्पोकैम्पस के पीछे की तह से छिपा हो सकता है।
  5. पूरे तीसरे वेंट्रिकल और विपरीत पार्श्व वेंट्रिकल को उजागर करने के लिए सेप्टम से दूर contralateral गोलार्ध के कॉर्पस कैलोसम और हिप्पोकैम्पस के साथ कॉर्टेक्स को खींचें।
  6. ठीक संदंश के साथ इकट्ठा तीसरे सीपी, जो एक दानेदार सतह पहलू के साथ एक छोटी संरचना के रूप में पहचाना जा सकता है.
  7. अन्य पार्श्व सीपी ले लीजिए.
  8. सेरिबैलम और मिडब्रेन के बीच एक संदंश के दो सिरों को नीचे डालें। चौथे वेंट्रिकल को उजागर करने के लिए पोन्स और मज्जा से सेरिबैलम को अलग करें।
  9. चौथे सीपी को दानेदार सतह पहलू के साथ एक लंबी गोलाकार संरचना के रूप में पहचानें जो सेरिबैलम और मज्जा के बीच पार्श्व दाएं छोर से बाएं छोर तक चौथे वेंट्रिकल को लाइन करता है। ठीक संदंश के साथ चौथे सीपी ले लीजिए.
    नोट: संदंश के Silane-आधार कोटिंग संदंश पर सीपी की चिपचिपाहट को रोक सकता है।
  10. अन्य सात चूहों में से प्रत्येक के लिए चरण 3.1-4.9 दोहराएँ। इस बीच, एकत्र सीपी को बर्फ पर रखी गई ट्यूब में अस्थायी रूप से रखा जा सकता है।

5. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए नमूनों की तैयारी

  1. PBS + / + के 750 μL करने के लिए सभी विच्छेदित सीपी युक्त ट्यूब भरें।
    नोट: ट्यूब में पतली संदंश के साथ विच्छेदित सीपी का जमाव पीबीएस + / + की एक छोटी मात्रा लाता है। इसके बजाय मौजूदा मात्रा को हटाने की तुलना में 750 μL तक पूरा करें और सीपी ऊतक के संभावित नुकसान से बचने के लिए इसे पीबीएस + / + के ताजा 750 μL के साथ बदलें।
  2. 400 U/mL अंतिम सांद्रता के लिए 20 U/μL कोलेजेनेस IV स्टॉक समाधान (चरण 1.5 देखें) के 15 μL जोड़ें.
    नोट: DNAse I (150 μg/mL) अत्यधिक सेल clumping को रोक सकता है।
  3. 45 मिनट के लिए हल्के आंदोलन (300 आरपीएम) के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोलेजनेस IV के साथ सीपी इनक्यूबेट करें।
  4. सीपी पृथक्करण को अंतिम रूप देने के लिए धीरे-धीरे लगभग 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  5. कोलेजेनेस IV गतिविधि को रोकने के लिए MACS बफर के साथ 1.5 mL करने के लिए सीपी ट्यूब भरें (नुस्खा चरण 1.4 देखें)।
    नोट: कोलेजनेस IV गतिविधि कम तापमान पर बंद कर दिया जाता है और सीरम एल्ब्यूमिन द्वारा बाधित होता है।
  6. 500 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, 5 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर। supernatant को छोड़ दें और MACS बफर के 1.5 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  7. 5 मिनट के लिए 500 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर। MACS बफ़र के 220 μL में supernatant और resuspend कोशिकाओं को छोड़ दें।
  8. सेल निलंबन से 10 μL के एक ऐलीकोट को अलग करें जिसे अनस्टैंड नियंत्रण (अगला चरण 5.18) के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
  9. DAPI-मोनो-दाग नियंत्रण (अगला चरण 5.12) के रूप में उपयोग किए जाने वाले सेल निलंबन से 10 μL के एलीकोट को अलग करें।
  10. गैर-विशिष्ट एफसी-मध्यस्थता इंटरैक्शन को अवरुद्ध करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, एंटी-माउस सीडी 16 / सीडी 32 ब्लॉकिंग एंटीबॉडी (1: 100) के साथ शेष 200 μL को प्रीइंक्यूबेट करें।
  11. कोशिकाओं को दो 100 μL ट्यूबों में विभाजित करें (एक माइलॉयड कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए, दूसरा टी कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए) (अगला चरण 5.14)।
  12. DAPI-मोनो-दाग नियंत्रण (चरण 5.9) के लिए कोशिकाओं के 10 μL के साथ नमूना लें और इसे MACS बफर (अगले चरण 5.14) के साथ 100 μL तक भरें।
  13. एंटीबॉडी मोनो-दाग (चरण 5.14.4) और सभी-दाग नियंत्रण (चरण 5.14.5) के लिए एमएसीएस के 100 μL युक्त ग्यारह नए ट्यूबों को तैयार करें और प्रत्येक में मुआवजे के मोतियों की एक बूंद जोड़ें।
    नोट: मुआवजा नियंत्रण फ्लोरोसेंट डिटेक्शन लेजर के वोल्टेज को स्थापित करने की अनुमति देगा और अन्य चैनलों में फ्लोरोसेंट डाई के संभावित अनिर्दिष्ट सिग्नल डिटेक्शन का आकलन करेगा जिसे आगे मुआवजा दिया जाएगा।
  14. नमूनों की एंटीबॉडी इनक्यूबेशन:
    1. माइलॉयड नमूना जोड़ें: 0.1 मिलीग्राम / एमएल DAPI (1: 100) जोड़ें (चरण 1.3 देखें), FITC विरोधी माउस CD45 (1:100), PE-चकाचौंध 594 विरोधी माउस CD11b (1:100), APC विरोधी माउस CX3CR1 (1:100), BV711 विरोधी माउस Ly6C (1:100), पीई विरोधी माउस F4/80 (1:100), पीई विरोधी माउस F4/80 (1:100), पीई विरोधी माउस F4/80 (1:100),
    2. टी कोशिकाओं का नमूना: जोड़ें 0.1 मिलीग्राम / एमएल DAPI (1: 100), FITC विरोधी माउस CD45 (1: 100), पीई-चकाचौंध 594 विरोधी माउस CD11b (1: 100), APC विरोधी माउस TCRπ (1: 100), पीई विरोधी माउस CD8a (1: 100), और APC-Cy7 विरोधी माउस CD4 (1: 50).
    3. DAPI-मोनो-दाग नियंत्रण (चरण 5.12 से): 0.1 मिलीग्राम / एमएल DAPI (1: 100) जोड़ें।
    4. एंटीबॉडी मोनो-दाग क्षतिपूर्ति मोती: माइलॉयड और टी कोशिकाओं के नमूनों (एक ही कमजोर पड़ने) के लिए पहले से उपयोग किए जाने वाले नौ एंटीबॉडी में से प्रत्येक को जोड़ें, अलग से (प्रत्येक ट्यूब के लिए एक) मोतियों वाले नौ ट्यूबों में।
      नोट: मोनो-दाग मुआवजा नियंत्रण मुआवजा चरण के दौरान उपयोग किए गए फ्लोरोसेंट मार्करों में से प्रत्येक के लिए प्रतिदीप्ति की सकारात्मक चोटियों के निर्धारण की अनुमति देगा। विश्लेषक उनकी तुलना बिना दाग वाले नियंत्रण सीपी कोशिकाओं में देखे गए नकारात्मक संकेत से करेगा।
    5. एंटीबॉडी सभी दाग मुआवजा मोती: एक ट्यूब के लिए माइलॉयड धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले सभी एंटीबॉडी जोड़ें और टी कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाने वाले दूसरे को धुंधला करें।
      नोट: सभी दाग मुआवजा नियंत्रण प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेजर का पता लगाने के वोल्टेज की स्थापना और अन्य चैनलों में फ्लोरोसेंट डाई के संभावित अनिर्दिष्ट संकेत का पता लगाने का आकलन करने की अनुमति देगा।
    6. बर्फ पर 30-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, प्रकाश जोखिम से संरक्षित।
  15. MACS बफर के साथ 1.5 mL तक सभी ट्यूबों को भरें। 500 x g पर कोशिकाओं और क्षतिपूर्ति मोतियों को सेंट्रीफ्यूज करें, 5 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  16. supernatant त्यागें और MACS बफर के 1.5 मिलीलीटर में कोशिकाओं और क्षतिपूर्ति मोतियों को धोएं।
  17. 500 x g पर कोशिकाओं और क्षतिपूर्ति मोतियों को सेंट्रीफ्यूज करें, 5 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर। supernatant को छोड़ दें।
  18. MACS बफर के 500 μL में कोशिकाओं और क्षतिपूर्ति मोतियों को फिर से निलंबित कर दिया। MACS बफर के साथ 500 μL तक unstained नियंत्रण (चरण 5.8) भरें।
  19. एक 70 μm छलनी के माध्यम से सीपी कोशिकाओं के साथ प्रत्येक ट्यूब फ़िल्टर (unstained सीपी, DAPI मोनो दाग नियंत्रण, और माइलॉयड और टी कोशिकाओं के नमूने).

6. प्रवाह cytometry

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला प्रवाह साइटोमीटर निम्नलिखित 5 लेज़रों से सुसज्जित है: एक 355 एनएम यूवी लेजर, एक 405 एनएम वायलेट लेजर, एक 488 एनएम ब्लू लेजर, एक 561 एनएम पीला-हरा लेजर और एक 637 एनएम लाल लेजर।

  1. साइटोमीटर सेटअप, ट्रैकिंग (सीएसटी) इंटरफ़ेस का उपयोग करके साइटोमीटर पर दैनिक गुणवत्ता नियंत्रण जांच करें, और विश्लेषण, उपकरण की गुणवत्ता और लगातार लक्ष्य प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए सीएसटी नियंत्रण मोतियों को नियंत्रण मोतियों।
  2. प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोग स्थापित करने के लिए, bivariate भूखंडों और हिस्टोग्राम के साथ एक नया प्रयोग बनाएँ। अधिग्रहण की निगरानी के लिए प्रत्येक रंग के लिए एक फॉरवर्ड स्कैटर क्षेत्र (एफएससी-ए) और साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) भूखंडों के साथ-साथ हिस्टोग्राम भूखंडों को शामिल करना सुनिश्चित करें।
  3. बिना दाग नियंत्रण सीपी कोशिकाओं पर FSC-A और SSC-A पैरामीटर के लिए PMT वोल्टेज सेट करके सेल आकृति विज्ञान को परिभाषित करें।
  4. प्रत्येक फ्लोरोसेंट मार्कर के वोल्टेज को अनसनेटेड नियंत्रण सीपी कोशिकाओं पर फ्लोरोक्रोम की नकारात्मक चोटियों की स्थापना करके परिभाषित करें और सभी एंटीबॉडी के साथ मुआवजे के मोतियों का उपयोग करके फ्लोरोक्रोम की सकारात्मक चोटियों का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करें कि डिटेक्टर सिग्नल पैमाने से बाहर नहीं हैं और अन्य चैनलों में बहुत दृढ़ता से क्रॉस-डिटेक्ट नहीं किए गए हैं।
  5. एकल-रंग मुआवजा नियंत्रणों में से प्रत्येक का विश्लेषण करने के लिए एक मुआवजा मैट्रिक्स बनाएँ। उपयुक्त FSC-A/SSC-A आबादी पर गेटिंग करने के बाद, हिस्टोग्राम भूखंडों और रिकॉर्ड मुआवजा नियंत्रणों पर एकल-दाग नियंत्रणों की जांच करें। सभी एकल-दाग वाले नमूनों को रिकॉर्ड करने के बाद, मुआवजे के मैट्रिक्स की गणना करें।
  6. माइलॉयड और टी सेल आबादी दोनों के लिए पता लगाए गए सभी ईवेंट रिकॉर्ड करें।

7. सीपी माइलॉयड कोशिकाओं गेटिंग

  1. FSC-A बनाम SSC-A और कोशिकाओं के लिए गेट (आकार के आधार पर) का चयन करें।
  2. FSC-A बनाम आगे तितर बितर ऊंचाई (FSC-H) के साथ एकल कोशिकाओं के लिए एक बेटी गेट बनाएँ।
  3. DAPI + कक्षों को बाहर करने के लिए DAPI बनाम FSC-A के साथ लाइव कक्षों के लिए एक बेटी गेट बनाएँ।
  4. CD45 बनाम FSC-A के साथ CD45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए एक बेटी गेट बनाएँ।
  5. CD45+ कक्षों से एक बेटी गेट बनाएँ और CD11b बनाम F4/80 का चयन करें, निम्नलिखित दो समूहों की पहचान करें: CD11b+ F4/80+ और CD11b+ F4/80- आबादी (अगला चरण 7.8).
  6. CD11b+ F4/80+ कोशिकाओं के लिए एक बेटी गेट बनाएँ और CX3CR1 बनाम IA-IE का चयन करें। CX3CR1+ IA-IE+ BAM दोनों की पहचान करें जिन्हें CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM, और CX3CR1+ IA-IE-मैक्रोफेज के रूप में नामित किया गया है।
  7. CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE-मैक्रोफेज के लिए एक बेटी गेट बनाएँ और F4/80 बनाम CD11b का चयन करें। CD11bhigh F4/80intermediate और CD11b+ F4/80उच्च आबादी दोनों की पहचान करें जिन्हें आगे CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer के एपिप्लेक्सस मैक्रोफेज और CD11b CR1+ IA-IE- BAM, क्रमशः।
    नोट: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- और CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- कोशिकाएं F4/80intermediate-F4/80high और CD11bhigh-CD11b+ स्तरों के बीच थोड़ा intermixed दिखाई दीं।
  8. CD11b+ F4/80- जनसंख्या (चरण 7.5) से, Ly6C बनाम IA-IE के लिए गेट। IA-IE+ Ly6C- जनसंख्या और IA-IE- Ly6C+ कोशिकाओं दोनों का चयन करें जो मुख्य रूप से मोनोसाइट्स / न्यूट्रोफिल के अनुरूप हैं।
    नोट: IA-IE-Ly6C + कोशिकाओं की एक उच्च उपस्थिति संभवतः एक भड़काऊ स्थिति के बिना जानवरों की परफ्यूजन प्रभावकारिता में समस्याओं को दर्शाती है; उनकी बहुतायत कम होनी चाहिए।
  9. CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- जनसंख्या के लिए एक बेटी गेट बनाएँ और CD11b बनाम CX3CR1 का चयन करें, CD11bhigh CX3CR1low और CD11b+ CX3CR1- आबादी दोनों की पहचान करें।

8. सीपी टी कोशिकाओं गेटिंग

  1. FSC-A बनाम SSC-A और कोशिकाओं के लिए गेट (आकार के आधार पर) का चयन करें।
  2. FSC-A बनाम आगे तितर बितर ऊंचाई (FSC-H) के साथ एकल कोशिकाओं के लिए एक बेटी गेट बनाएँ।
  3. DAPI + कक्षों को बाहर करने के लिए DAPI बनाम FSC-A के साथ लाइव कक्षों के लिए एक बेटी गेट बनाएँ।
  4. CD45 बनाम FSC-A के साथ CD45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए एक बेटी गेट बनाएँ।
  5. CD45+ कक्षों से एक बेटी गेट बनाएँ और TCRπ बनाम CD11b का चयन करें। CD11b+ माइलॉयड कक्षों को बाहर निकालें और TCRπ+ CD11b- T कोशिकाओं की जनसंख्या का चयन करें.
  6. TCR के लिए एक बेटी गेट बनाएँ + CD11b- जनसंख्या और CD4 बनाम CD8a का चयन करें। CD8- CD4+ T कोशिकाओं और CD8+ CD4-T कोशिकाओं दोनों की पहचान करें.

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण ने माइलॉयड और टी कोशिकाओं के प्रमुख सबसेट (चित्रा 1 और चित्रा 2, क्रमशः), और अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से प्रति माउस उनकी सापेक्ष कुल संख्या (चित्रा 3) का सफलतापूर्वक खुलासा किया।

माइलॉयड कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला है कि सीपी CD11b + CX3CR1 + F4 / 80high BAM द्वारा आबाद हैं, जो सीपी में CD45 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लगभग 80% का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन बीएएम को एमएचसी-II की उनकी अभिव्यक्ति के अनुसार दो अलग-अलग आबादी में विभाजित किया गया था: आईए-आईई + बीएएम जिसने पहले प्रकाशित डेटा 7 और आईए-आईई- बीएएम के अनुरूप प्रमुख समूह (सीडी 45 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं का 72%) का गठन किया था। CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- कोल्मर के एपिप्लेक्सस मैक्रोफेज 7,2 की आबादी की भी पहचान की गई थी और केवल CD45 + CP प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लगभग 1.2% का प्रतिनिधित्व किया गया था, लगातार साहित्य 7 के साथ। CD11b + F4 /80- प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच, Ly6C- IA-IE + कोशिकाओं की दो अलग-अलग आबादी की विशेषता थी जो संभवतः डेंड्राइटिक कोशिकाओं के अनुरूप थीं, और इसे CD11bhigh CX3CR1low और CD11b + CX3CR1 में विभाजित किया जा सकता है- आबादी जो क्रमशः CD45 + CP प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लगभग 3.1% और 3.7% का गठन करती है। CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ सेल जनसंख्या जिसमें मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल दोनों शामिल हैं, ने पिछली रिपोर्टों के अनुसार CD45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं का केवल 0.5% का गठन किया और PBS परफ्यूजन 3 की उच्च प्रभावकारिता के लिए प्रमाणित किया। ये परिणाम काफी हद तक पहले से प्रकाशित डेटा के अनुरूप हैं जो एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण 7 द्वारा सीपी प्रतिरक्षा आबादी का आकलन करते हैं।

टी कोशिकाओं के विश्लेषण और गेटिंग रणनीति ने CD45+ CD11b- TCRπ + कोशिकाओं की मामूली आबादी की उपस्थिति पर प्रकाश डाला। उनमें से, लगभग 30-50 CD8- CD4+ और CD8+ CD4- T कोशिकाएं प्रति माउस ने शारीरिक परिस्थितियों में सीपी को पॉप्युलेट किया, जो क्रमशः CD45+ CP प्रतिरक्षा कोशिकाओं के 1.3% और 0.9% का प्रतिनिधित्व करता है। CD4+ कोशिकाएं CD8+ T कोशिकाओं की तुलना में थोड़ी अधिक प्रचुर मात्रा में थीं, जो संख्या और अनुपात दोनों के संदर्भ में पिछले परिणामों के अनुरूप हैं21,30। इस गेटिंग रणनीति ने CD45 + CD11b- TCR π + CD4- CD8- कोशिकाओं की आबादी का भी खुलासा किया, जिसमें NKT कोशिकाएं शामिल हो सकती हैं, और हाल ही में वर्णित नियामक T सेल सबसेट 10,28,31। प्रस्तावित प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और गेटिंग रणनीतियों ने माउस सीपी की रचना करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं (सीडी 45 +) के लगभग 90% के सेल प्रकार एनोटेशन की अनुमति दी।

Figure 1
चित्रा 1: प्रवाह cytometry विश्लेषण और perfused चूहों के सीपी से माइलॉयड कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति. कोशिकाओं को एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए का उपयोग करके आकार के आधार पर गेटेड किया जाता है। Singlet कोशिकाओं FSC-A बनाम FSC-H का उपयोग कर चयनित कर रहे हैं। लाइव कोशिकाओं को DAPI बनाम FSC-A प्लॉट पर DAPI + कोशिकाओं को छोड़कर गेटेड किया जाता है। CD45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तब CD45 बनाम FSC-A प्लॉट पर पहचाना जाता है। गेटिंग CD11b बनाम F4/80, CD11b+ F4/80+ और CD11b+ F4/80- आबादी का चयन किया जाता है। CX3CR1 बनाम IA-IE का उपयोग करके CD11b+ F4/80+ जनसंख्या को गेटिंग करना, CD11b+ F4/80hi CX3CR1+ IA-IE+ BAM और CX3CR1+ IA-IE- दोनों आबादी निर्धारित की जाती है। इस बाद की आबादी को तब F4/80 बनाम CD11b का उपयोग करके CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE-BAM और CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- कोल्मर के एपिप्लेक्सस मैक्रोफेज को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए गेटेड किया जाता है। CD11b+ F4/80 पर गेटिंग Ly6C बनाम IA-IE- CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ कोशिकाएं जो मुख्य रूप से मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल और CD11b + F4/80- IA-IE+ Ly6C- कोशिकाओं के अनुरूप होती हैं, जो संभवतः डेंड्राइटिक कोशिकाओं की आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं, उनका चयन किया जाता है। CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- कोशिकाओं को CD11b बनाम CX3CR1 का उपयोग करके गेटेड किया जाता है, जिससे CD11bhigh CX3CR1low और CD11b+ CX3CR1- कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है। यदि निर्दिष्ट नहीं किया गया है, तो प्रत्येक गेटेड जनसंख्या के नीचे मान मूल जनसंख्या की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं। हाय: उच्च; int: मध्यवर्ती; लो: कम. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रवाह cytometry विश्लेषण और perfused चूहों के सीपी से टी कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति. कोशिकाओं को एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए का उपयोग करके आकार के आधार पर गेटेड किया जाता है। एकल कोशिकाओं को FSC-A बनाम FSC-H का उपयोग करके चुना जाता है। DAPI बनाम FSC-A प्लॉट पर DAPI + कक्षों को छोड़कर लाइव कोशिकाओं की पहचान की जाती है। CD45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तब एक CD45 बनाम FSC-A प्लॉट पर गेटेड किया जाता है। गेटिंग CD11b बनाम TCRπ, CD11b- TCRπ + का चयन किया जाता है। गेटिंग CD4 बनाम CD8, CD8- CD4+ और CD4- CD8+ T कोशिकाओं के अनुपात निर्धारित किए जाते हैं। यदि निर्दिष्ट नहीं किया गया है, तो प्रत्येक गेटेड जनसंख्या के नीचे मान मूल जनसंख्या की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रति माउस सीपी पर प्रमुख प्रतिरक्षा सेल सबसेट की संख्या। चार सीपी एक साथ पूल में पहचाने गए विभिन्न प्रतिरक्षा उपसमुच्चय के प्रति माउस कोशिकाओं की कुल संख्या का माध्य। प्रतिनिधित्व: माध्य + मानक विचलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मस्तिष्क होमियोस्टैसिस और बीमारी के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी योगदान को समझने के उद्देश्य से किए गए अध्ययनों ने मुख्य रूप से मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर रहने वाली कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है, सीपी जैसे मस्तिष्क की सीमाओं की उपेक्षा की है, जो अभी भी मस्तिष्क समारोह 2,3 के लिए महत्वपूर्ण योगदानकर्ता हैं। सीपी में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का विश्लेषण सीपी के छोटे आकार, निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कम संख्या और इस ऊतक तक जटिल पहुंच के कारण चुनौतीपूर्ण है। कुल मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं (CD45+) पर किए गए फ्लो साइटोमेट्री सीपी में रहने वाली दुर्लभ प्रतिरक्षा आबादी के लक्षण वर्णन की अनुमति नहीं देता है। उच्च परिशुद्धता के साथ सीपी की प्रतिरक्षा संरचना को चिह्नित करने के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण पीबीएस-परफ्यूज्ड चूहों से विच्छेदित सीपी पर आयोजित किए गए थे। यह दृष्टिकोण परिसंचारी CD45+ कोशिकाओं और CP CD45- कोशिकाओं जैसे पेरिसाइट, एंडोथेलियल और उपकला कोशिकाओं के बहिष्करण की अनुमति देता है32। माइलॉयड और टी सेल आबादी पर ध्यान केंद्रित करने वाली गेटिंग रणनीतियां मुख्य सीपी प्रतिरक्षा सबसेट की पहचान करती हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण चरण PBS परफ्यूजन है। चूंकि सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाएं दुर्लभ हैं, इसलिए रक्त संदूषण पूरी तरह से उनकी स्थानीय विषमता को मुखौटा कर सकता है। जिगर और मस्तिष्क मलिनकिरण हमेशा नियंत्रण के रूप में जांच की जाती है, और इसलिए रक्त संदूषण न्यूनतम है। लगातार, CD11b + F4 / 80 - Ly6C + , जिसमें गैर-भड़काऊ स्थितियों में मस्तिष्क के बजाय रक्त में मौजूद मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल दोनों शामिल हैं3, CD45 + कोशिकाओं के केवल 0.5% के लिए जिम्मेदार है, जो पीबीएस परफ्यूजन की उच्च प्रभावकारिता का प्रदर्शन करता है। पीबीएस परफ्यूजन प्रभावकारिता के लिए एक और सहायक नियंत्रण Ter119 के खिलाफ एंटीबॉडी का समावेश हो सकता है, जो एरिथ्रोसाइट्स के लिए विशिष्ट मार्कर है। अंत में, इम्यूनोस्टेनिंग और माइक्रोस्कोपी द्वारा पीबीएस-परफ्यूज्ड माउस मस्तिष्क वर्गों से सीपी का एक अतिरिक्त विश्लेषण यह सत्यापित करने के लिए भी उपयोगी हो सकता है कि क्या किसी भी रक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एंडोथेलियम के लिए दृढ़ता से पालन किया जा सकता है, ने पीबीएस परफ्यूजन का विरोध किया है और वास्कुलचर के लुमेन में संलग्न रहता है।

माइलॉयड गेटिंग रणनीति ने मैक्रोफेज की दो आबादी का खुलासा किया: CD11b + F4 / 80high CX3CR1 + IA-IE + / - BAM और CD11b + F4 / 80intermediate CX3CR1 + IA-IE- Kolmer की एपिप्लेक्सस कोशिकाएं, जो CD11b के उच्च स्तर और F4/807 के निम्न स्तर को व्यक्त करती हैं। कोल्मर के एपिप्लेक्सस कोशिकाओं 7,20 और आईए-आईई-बीएएम के गेट को सीडी 11 बी और एफ 4/80 मार्करों का उपयोग करके स्पष्ट रूप से अलग नहीं किया गया था। इस गेटिंग रणनीति में CD206 मार्कर को शामिल करने से CD206 + IA-IE- BAM को CD206low Kolmer के epiplexus cells7 से बेहतर अंतर करने में मदद मिल सकती है।

सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं का लगभग 7% CD11b + F4 / 80- Ly6C- IA-IE + प्रतीत होता है। यह सबसेट CD11b और CX3CR1 अभिव्यक्ति के अपने स्तर के अनुसार दो आबादी से बना था। ये कोशिकाएं संभवतः डेंड्राइटिक कोशिकाओं के अनुरूप हैं, लेकिन यह उनके CD11c अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके या तो FACS3 या immunofluorescence33 द्वारा पुष्टि की जानी बाकी है। CD11b+ F4/80- Ly6C- IA-IE+ जनसंख्या में मास्ट कोशिकाएं भी शामिल हैं। गेटिंग रणनीति में CD117 और c-किट का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी को शामिल करने से उन्हें CD11c + डेंड्राइटिक कोशिकाओं 3,34 से अलग करने में मदद मिलेगी। CP प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ कोशिकाओं का अनुपात निर्धारित किया गया था। हालांकि, उनमें मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल दोनों शामिल हैं, और CD45 + CD11b + F4 / 80 + Ly6C + कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति में Ly6G मार्कर के अलावा Ly6G + न्यूट्रोफिल के लिए Ly6G- मोनोसाइट्स के अनुपात को निर्धारित करेगा। वर्णित CD45+ CD11b- TCRπ+ जनसंख्या से परे, CD45+ CD11b पर गेटिंग रणनीति- NK कोशिकाओं की पहचान करने के लिए NK1.1 और CD11c मार्करों का उपयोग करके आबादी को समृद्ध किया जा सकता है, TCRπ को विश्लेषण करने के लिए ΠΠ T कोशिकाओं, CD19 और / या B220 का विश्लेषण करने के लिए B कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए, और CD138 प्लाज्मा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति को भी इस विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Foxp3-GFP ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करना CP-निवासी T नियामक (Treg) कोशिकाओं 3,30 की पहचान करने में सहायक हो सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारकों या साइटोकिन्स 21 के इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग को भी शामिल कर सकता है।

जबकि मस्तिष्क पैरेन्काइमा की प्रतिरक्षा कोशिकाओं का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, बहुत कम प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बारे में जाना जाता है जो मस्तिष्क की बाधाओं को पॉप्युलेट करते हैं, जैसे कि सीपी 3,35,36। चूहों में सीपी मस्तिष्क के चार अलग-अलग क्षेत्रों में स्थित छोटे ऊतक होते हैं, और उनके अलगाव के लिए काफी जटिल माइक्रोडिसेक्शन की आवश्यकता होती है। इस वजह से, सीपी का ज्यादातर इमेजिंग का उपयोग करके अध्ययन किया गया था। पूरे सीपी विच्छेदित ऊतक से या सूक्ष्म विश्लेषण के बाद मस्तिष्क वर्गों से सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के धुंधला होने से सीपी प्रतिरक्षा तंत्र की समझ में प्रमुख प्रगति हुई14,15,21,22,26,27,29,30,33 . हालांकि, यह विधि सीपी प्रतिरक्षा कोशिका विविधता के व्यापक विश्लेषण की अनुमति नहीं देती है क्योंकि एक समय में केवल चार से छह मार्करों का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, कुछ उप-आबादी जैसे कि सीडी 4 + या सीडी 8 + टी कोशिकाएं सीपी में काफी दुर्लभ हैं, और माइक्रोस्कोपी के साथ उनके फेनोटाइप का मात्रात्मक विश्लेषण चुनौतीपूर्ण होगा। प्रवाह साइटोमेट्री दृष्टिकोण प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका के लिए समानांतर में दसियों मार्करों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, सीपी प्रतिरक्षा संरचना के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक बेहतर-अनुकूल उपकरण प्रदान करता है।

हाल ही में, एकल नाभिक ट्रांसक्रिप्टोमिक तकनीक (snRNA-seq) सीपी विषमता 10,28 का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली विधि के रूप में सामने आई। हालांकि, यह सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है क्योंकि वे सीपी कोशिकाओं का केवल एक छोटा सा अंश बनाते हैं। चूंकि snRNA-seq ऊतक में मौजूद अनुपात में कोशिकाओं का नमूना लेता है, इसलिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को snRNA-seq में कम दर्शाया जाता है, और उनकी कम संख्या गहराई से विश्लेषण 10,28 के लिए एक बाधा पैदा करती है।

एकल सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स (scRNA-seq) को हाल ही में अलग-थलग सीपी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की प्रतिरक्षा कोशिका विषमता को ठीक से मैप करने के लिए लागू किया गया है7। जबकि scRNA-seq प्रदर्शन करने के लिए काफी जटिल और महंगा है, फ्लो साइटोमेट्री CP पर प्रतिरक्षा उप-आबादी का सर्वेक्षण करने के लिए एक अधिक सुलभ तरीके के रूप में काम कर सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल एक सेल सॉर्टिंग प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में काम कर सकता है, जहां कोशिकाओं के चयनित उपप्रकारों को आणविक विधियों के साथ विश्लेषण के लिए FACS का उपयोग करके क्रमबद्ध किया जाता है, जैसे scRNA-seq या बल्क RNA विश्लेषण।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम Institute Pasteur Animalerie Centrale और CB-UTechS सुविधा सदस्यों को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को Institute Pasteur द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Flow cytometry antibody
Albumin, bovine MP Biomedicals 160069 Blocking reagent
APC anti-mouse CX3CR1 BioLegend 149008 Flow cytometry antibody
APC anti-mouse TCRb BioLegend 109212 Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse CD4 BioLegend 100414 Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE BioLegend 107628 Flow cytometry antibody
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry analyzer
BV711 anti-mouse Ly6C BioLegend 128037 Flow cytometry antibody
Collagenase IV Gibco 17104-019 Enzyme to dissociate CP tissue
DAPI Thermo Scientific 62248 Live/dead marker
EDTA Ion chelator
fine scissors FST 14058-11 Dissection tool
FITC anti-mouse CD45 BioLegend 103108 Flow cytometry antibody
Flow controller infusion inset CareFusion RG-3-C Blood perfusion inset
FlowJo software BD Biosciences Analysis software
forceps FST 11018-12 Dissection tool
Heparin Sigma-Aldrich H3149-10KU Anticoagulant
Imalgene Boehringer Ingelheim Ketamine, anesthesic
OneComp eBeads Invitrogen 01-1111-42 Control beads to realize compensation
PBS-/- Gibco 14190-094 Buffer
PBS+/+ Gibco 14040-091 Buffer
PE anti-mouse CD8a BioLegend 100708 Flow cytometry antibody
PE anti-mouse F4/80 BioLegend 123110 Flow cytometry antibody
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b BioLegend 101256 Flow cytometry antibody
Rompun Bayer Xylazine, anesthesic
thin forceps Dumoxel Biology 11242-40 Dissection tool
Vetergesic Ceva Buprenorphin, analgesic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जीव विज्ञान अंक 180
माइक्रो-विच्छेदित माउस Choroid Plexuses से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव और लक्षण वर्णन
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Dominguez-Belloso, A., Schmutz, S.,… More

Dominguez-Belloso, A., Schmutz, S., Novault, S., Travier, L., Deczkowska, A. Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses. J. Vis. Exp. (180), e63487, doi:10.3791/63487 (2022).

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