Summary
이 연구는 분리 된 관류 된 마우스 뇌 맥락막 신경총에 대한 유세포 측정과 두 가지 게이팅 전략을 사용합니다. 이 프로토콜은이 뇌 구조를 채우는 주요 면역 세포 하위 집합을 식별합니다.
Abstract
뇌는 더 이상 고립되어 기능하는 기관으로 간주되지 않습니다. 축적 된 증거는 말초 면역 체계의 변화가 간접적으로 뇌 기능을 형성 할 수 있음을 시사합니다. 뇌와 전신 순환 사이의 계면에서, 혈액 뇌척수액 장벽을 구성하는 맥락막 신경총(CP)은 주변부와 뇌 간 통신의 핵심 부위로 강조되고 있다. CP는 뇌척수액, 신경 영양 인자 및 뇌 항상성을 형성 할 수있는 신호 전달 분자를 생산합니다. CP는 또한 활성 면역 학적 틈새 시장입니다. 생리적 조건 하에서 주로 미세아교세포에 의해 채워지는 뇌 실질과는 달리, CP 면역 세포의 이질성은 다른 말초 기관에서 발견되는 다양성을 되풀이한다. CP 면역 세포 다양성 및 활성은 노화, 스트레스 및 질병에 따라 변화하고 CP 상피의 활성을 조절하여 간접적으로 뇌 기능을 형성합니다. 이 프로토콜의 목표는 뮤린 CP를 분리하고 그들을 채우는 주요 면역 서브 세트의 약 90 %를 확인하는 것입니다. 이 방법은 CP 면역 세포를 특성화하고 주변부와 뇌 간 의사 소통을 조율하는 기능을 이해하는 도구입니다. 제안 된 프로토콜은 CP 면역 세포가 건강 및 다양한 질병 조건에서 간접적으로 뇌 기능을 조절하는 방법을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
19 세기 후반 Paul Erhlich가 혈액 - 뇌 장벽을 발견 한 이래로 뇌는 다른 장기 및 혈류와 사실상 분리 된 것으로 간주되어 왔습니다. 그러나 지난 10 년 동안 뇌 기능은 장내 미생물 및 전신 면역 세포 및 신호와 같은 다양한 생물학적 요인에 의해 형성된다는 개념의 출현을 보았습니다1,2,3,4. 동시에, 수막과 맥락막 신경총(CP)과 같은 다른 뇌 경계는 불활성 장벽 조직보다는 활성 면역-뇌 교차 대화의 계면으로 확인되었다5,6,7,8.
CP는 뇌와 주변을 분리하는 경계 중 하나 인 혈액 뇌척수액 장벽을 구성합니다. 그들은 뇌의 네 개의 심실, 즉 세 번째, 네 번째 및 양쪽 측심실 각각에 위치하고 있으며 해마의 심실 하부 영역 및 세분화 된 영역과 같은 신경 발생과 관련된 영역에 인접 해 있습니다3. 구조적으로, CP는 상피 세포의 단층으로 둘러싸인 연합 된 혈액 모세 혈관의 네트워크로 구성되며, 이들은 단단하고 부착 된 접합부에 의해 상호 연결되어 있습니다9,10. CP 상피의 주요 생리적 역할은 폐대사산물 및 단백질 응집체로부터 뇌를 세척하는 뇌척수액의 생산과 호르몬 및 신경영양 인자를 포함한 다양한 신호전달 분자의 생산 및 제어된 혈액-뇌 통과를 포함한다11,12,13. CP로부터 분비된 분자는 뇌의 활동, 즉 신경발생과 미세아교세포기능14,15,16,17,18,19을 조절함으로써 뇌의 활동을 형성하며, 이는 CP를 뇌 항상성에 결정적으로 만든다. CP는 또한 다양한 면역 활동에 관여합니다. 비병리학적 조건 하에서 뇌 실질의 주요 면역 세포 유형은 미세아교세포인 반면, CP 면역 세포 집단의 다양성은 말초 기관3,7에서와 같이 광범위하며, 이는 다양한 면역 조절 및 신호전달 채널이 CP에서 작용하고 있음을 시사한다.
내피 세포와 상피 세포 사이의 공간인 CP 스트로마는 주로 염증 신호에 반응하여 전염증성 사이토카인 및 항원 제시와 관련된 분자를 발현하는 경계-관련 대식세포(BAM)에 의해 채워진다3. 대식세포의 또 다른 아형인 콜머의 상복부 세포는 CP 상피20의 정점 표면에 존재한다. CP stroma는 또한 수지상 세포, B 세포, 비만 세포, 호염기구, 호중구, 선천성 림프계 세포 및 중추 신경계 항원을 인식 할 수있는 대부분 이펙터 기억 T 세포 인 T 세포의 틈새 시장입니다7,21,22,23,24. 또한, CP에서의 면역 세포 집단의 조성물 및 활성은 전신 또는 뇌 교란시, 예를 들어, 노화 동안10,14,15,21,25, 미생물 교란7, 스트레스26, 및 질병27,28 동안 변화한다. 주목할 만하게, 이러한 변화는 간접적으로 뇌 기능, 즉 뇌 노화에서 발생하는 Th2 염증으로의 CP CD4+ T 세포의 이동이 제안되었고, 노화와 관련된 인지 저하를 형성할 수 있는 CP로부터의 면역 신호전달을 촉발시킨다14,15,21,25,29 . 따라서 CP 면역 세포의 특성을 조명하는 것은 CP 상피 생리학 및 분비에 대한 조절 기능을 더 잘 이해하고 건강 및 질병 조건에서 뇌 기능에 대한 간접적 인 영향을 해독하는 데 중요합니다.
CP는 단지 몇 개의 면역 세포만을 포함하는 작은 구조이다. 그들의 분리는 관류의 예비 단계 후에 미세 해부를 필요로한다; 혈류의 면역 세포는 그렇지 않으면 주요 오염 물질을 구성 할 것입니다. 이 프로토콜은 유세포 분석기를 사용하여 CP의 골수성 및 T 세포 서브세트를 특성화하는 것을 목표로 한다. 이 방법은 비염증성 조건 하에서 마우스 CP를 구성하는 면역 세포 집단의 약 90%를 확인하는데, 이는 면역 CP 이질성을 해부하기 위한 다른 방법을 사용하는 최근 발표된 연구에 따른다7,10,28. 이 프로토콜은 생체내에서 질병 및 다른 실험적 패러다임과 함께 CP 면역 세포 구획의 변화를 특성화하는데 적용될 수 있었다.
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Protocol
모든 절차는 실험실 동물 취급에 대한 유럽 집행위원회의 지침, 지침 86/609/EEC에 동의했습니다. 그들은 윤리위원회 번호 59, CETEA/CEEA No. 089, dap210067 및 APAFIS #32382-2021070917055505 v1의 승인을 받았습니다.
1. 물질의 제조
- 모든 항체 (물질 표)를 4°C에서 저장하고, 광 노출로부터 보호한다.
- DAPI 원액 (1 mg/mL): 분말을 PBS-/- (표 물질), 분취액에 재현탁시키고, -20°C에서 저장한다.
- DAPI 작업 용액 (0.1 mg/mL): DAPI 원액을 PBS-/- 1:10의 비율로 희석합니다.
- 자기-활성화 세포 분류(MACS) 완충액: PBS-/-에서 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)(표 자료)을 준비한다.
- 콜라게나제 IV 원액 (20 U/μL): 분말을 PBS+/+ (표 물질), 분취액에 재현탁시키고, -20°C에서 보관한다.
참고: 콜라게나제 IV는 MgCl2가 완전히 활성화되어야 합니다. 콜라게나제 IV 용액을 동결-해동시키지 마십시오. - 마취제-진통제액: PBS-/-의 1 mL에 케타민 150 μL(150 mg/kg), 25 μl의 자일라진(5 mg/kg) 및 330 μl의 부프리케어(0.1 mg/kg)를 혼합한다.
참고 : 마취 - 진통제 용액을 일시적으로 준비하고 하루 이상 보관하지 마십시오. - 헤파린 용액 (100 U/mL): 분말을 PBS-/-에 재현탁시킨다.
- 튜브를 PBS-/-로 채워진 디캔터 삼각에 연결하는 주입 주입 시스템을 준비합니다. 23G 바늘을 주입 튜브의 말단에 연결하십시오. 주입 삽입물을 열고 튜브에 기포가 없을 때까지 PBS를 실행하게하십시오.
- 빛이 장착 된 쌍안 확대경을 준비하십시오.
2. C57BL/6 마우스의 하우징
- CP 골수성 또는 T 세포의 분석을 위해, 각각에 대해 네 마리의 마우스를 사용하고 네 개의 CP를 풀링한다(각 측심실에서 두 개, 세 번째 심실 및 네 번째 심실 CP; 총 여덟 마리의 마우스에 대해). CP를 풀링하지 않으면 낮은 풍부도로 인해 CP에서 희귀 한 면역 집단을 검출하지 못할 위험이 있습니다.
- 마우스가 실험 전에 적어도 7 일 동안 순응하게하십시오. 생쥐를 일정한 온도 및 습도, 12/12 h 또는 14/10 h 빛/어두운 주기, 물 및 표준 펠렛 식품 광고 리비툼으로 병원균이없는 조건에서 보관하십시오.
3. PBS 관류 및 뇌 해부
- 각 마우스의 무게를 10 μL/g의 마취제-진통제 혼합 용액(단계 1.6)을 복강내 주입한다.
- 효율적인 진통제를 위해 약 30 분 정도 기다리십시오 (마우스의 숫자를 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오).
- 마취 된 마우스를 뒤쪽, 해부 지지대 위에 평평하게 놓고 손바닥을 해부 지지대에 테이프로 붙입니다.
- 포셉으로 동물의 피부를 꼬집고 가위를 사용하여 복부, 횡격막 및 흉부를 열어 심장을 노출시킵니다.
참고 : 흉부가 열리면 뇌는 무산소가됩니다. 관류의 다음 단계를 통해 정확하고 신속하게 진행해야합니다. - 20 μL의 100 U/mL 헤파린 용액을 좌심실에 직접 주입하십시오.
- 미세한 가위로 오른쪽 심방에서 적어도 3mm의 절개를하여 혈액이 몸 밖으로 흘러 나오도록하십시오.
- 직후, 주입 튜브의 말단에 놓인 23 G 바늘을 좌심실의 끝을 통해 삽입하십시오.
- 주입 시스템을 최대로 열고 완전한 관류를 기다립니다 : 약 6 mL / min의 유속으로 23G 바늘을 사용하면 관류가 3 분 안에 완료됩니다.
참고 : 간과 같은 장기의 변색조차도 관류 효능을 증명합니다. - 주입 시스템을 닫고 심장 심실에서 바늘을 제거하십시오.
- 마우스의 손바닥에서 테이프를 제거합니다. 마우스를 복부 위치에 놓습니다.
- 포셉으로 동물의 피부를 꼬집고 가위를 사용하여 눈에서 귀까지 머리 꼭대기의 피부를 제거하십시오.
- 가위의 도움으로 눈 사이에서 두개골을 먼저 자른 다음 각 눈에서 마세터 근육 바로 위의 척수까지 옆으로 자릅니다. 이를 위해 가위의 사지를 사용하고 가위로 뇌가 손상되지 않도록 부드럽게 진행하십시오.
- 눈 사이의 사지에서 꼬집어 포셉으로 두개골을 엽니 다.
- 가위를 사용하여 척수를 자르고 집게로 뇌를 추출하여 뇌의 측면 측면에 두 점을 놓고 기울여 얼음처럼 차가운 PBS + / +로 채워진 페트리 접시에 넣으십시오. 그런 다음 CP가 즉시 수집됩니다.
참고 : 관류 효능을 확인하기 위해 뇌의 변색을 확인하십시오.
4. 뇌에서 맥락막 신경총의 해부
- 뇌 등쪽을 페트리 접시에 올려 놓고 쌍안 루페의 목표 아래에 놓습니다.
- 포셉의 도움으로 뇌를 제자리에 유지하고, 반구 사이의 중간 선을 통해 다른 포셉의 두 끝을 아래로 삽입하십시오.
- 포셉을 사용하여 캘로섬과 해마가있는 피질을 중격에서 멀리 당겨 측심실과 세 번째 심실의 일부를 노출시킵니다.
- 측면 CP를 양쪽 끝에서 불타는 측심실을 감싸는 긴 베일로 식별하십시오. 얇은 포셉의 두 끝을 사용하여 측면 CP를 잡으십시오. 해마의 후부 접힘에 의해 숨겨질 수있는 삼각형 후부 부분을 수집하도록주의하십시오.
- 대측 반구의 코퍼스 캘로섬과 해마로 피질을 중격에서 당겨 세 번째 심실 전체와 반대쪽 측심실을 노출시킵니다.
- 세 번째 CP를 미세 포셉으로 수집하고, 이는 세분화 된 표면 측면을 가진 짧은 구조로 식별 될 수 있습니다.
- 다른 측면 CP를 수집합니다.
- 소뇌와 중뇌 사이에 포셉의 두 끝을 삽입하십시오. 폰과 수질에서 소뇌를 분리하여 네 번째 심실을 노출시킵니다.
- 네 번째 CP를 측면 오른쪽 끝에서 소뇌와 수질 사이의 왼쪽 끝으로 네 번째 심실을 정렬하는 세분화 된 표면 측면이있는 긴 구상 구조로 식별하십시오. 미세한 집게로 네 번째 CP를 수집하십시오.
참고: 포셉의 실란 베이스 코팅은 포셉에 CP의 끈적임을 방지할 수 있습니다. - 다른 일곱 마리의 마우스 각각에 대해 3.1-4.9단계를 반복합니다. 한편, 수집된 CP는 얼음 위에 놓인 튜브 내에 일시적으로 보관될 수 있다.
5. 유세포 분석을 위한 시료 제조
- 750 μL의 PBS+/+로 모든 해부된 CP를 함유하는 튜브를 채운다.
참고: 튜브에 얇은 포셉을 가진 해부된 CP의 증착은 PBS+/+의 작은 부피를 가져온다. 오히려 CP 조직의 가능한 손실을 피하기 위해 기존의 부피를 750 μL로 제거하고 이를 PBS+/+ 의 신선한 750 μL로 교체하는 것보다 완료한다. - 20 U/μL 콜라게나제 IV 원액 15 μL(단계 1.5 참조)를 첨가하여 400 U/mL의 최종 농도를 측정합니다.
참고: DNAse I (150 μg/mL)는 과도한 세포 응집을 방지할 수 있습니다. - CP를 콜라게나제 IV와 함께 45분 동안 온화한 교반 (300 RPM) 하에 37°C에서 인큐베이션한다.
- CP 해리를 마무리하기 위해 약 10 번 위아래로 부드럽게 피펫하십시오.
- CP 튜브 1.5 mL를 MACS 완충액(레시피 단계 1.4 참조)으로 채워 콜라게나제 IV 활성을 정지시킨다.
참고: 콜라게나제 IV 활성은 저온에서 중단되고 혈청 알부민에 의해 억제된다. - 세포를 500 x g에서, 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 세포를 1.5 mL의 MACS 완충액으로 세척한다.
- 세포를 5분 동안, 4°C에서 500 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 버리고 세포를 220 μL의 MACS 완충액에 재현탁시킨다.
- 10 μL의 분취량을 염색되지 않은 대조군으로 사용할 세포 현탁액으로부터 분리한다(다음 단계 5.18).
- DAPI 모노염색 대조군으로 사용되는 세포 현탁액으로부터 10 μL의 분취량을 분리한다(다음 단계 5.12).
- 나머지 200 μL를 마우스 항-마우스 CD16/CD32 차단 항체 (1:100)와 함께 4°C에서 20분 동안 예비인큐베이션하여, 비특이적 Fc-매개된 상호작용을 차단한다.
- 세포를 두 개의 100 μL 튜브로 분할한다(하나는 골수성 세포 분석을 위한 것이고, 다른 하나는 T 세포 분석을 위한 것이다)(다음 단계 5.14).
- DAPI-모노염색된 대조군(단계 5.9)을 위해 10 μL의 세포로 샘플을 취하고, 이를 MACS 완충액으로 최대 100 μL까지 채운다(다음 단계 5.14).
- 항체 모노염색 (단계 5.14.4) 및 모든 염색된 대조군 (단계 5.14.5)을 위해 100 μL의 MACS를 함유하는 열한 개의 새로운 튜브를 제조하고, 각각에 보상 비드의 방울을 첨가한다.
참고: 보정 제어를 통해 형광 검출 레이저의 전압을 설정하고 다른 채널에서 형광 염료의 잠재적 비특이적 신호 검출을 평가하여 추가로 보정할 수 있습니다. - 샘플의 항체 인큐베이션:
- 골수성 샘플: 0.1 mg/mL DAPI (1:100) (단계 1.3 참조), FITC 안티-마우스 CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 안티-마우스 CD11b (1:100), APC 안티-마우스 CX3CR1 (1:100), BV711 안티-마우스 Ly6C (1:100), PE 안티-마우스 F4/80 (1:100), 및 APC-Cy7 안티마우스 IA-IE (1:100)를 첨가한다.
- T 세포 샘플: 0.1 mg/mL DAPI (1:100), FITC 항-마우스 CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 항-마우스 CD11b (1:100), APC 항-마우스 TCRβ (1:100), PE 항-마우스 CD8a (1:100), 및 APC-Cy7 항-마우스 CD4 (1:50)를 첨가한다.
- DAPI-모노 염색 대조군 (단계 5.12부터): DAPI 0.1 mg/mL (1:100)를 첨가한다.
- 항체 모노-염색된 보상 비드: 골수성 및 T 세포 샘플에 대해 이전에 사용된 아홉 개의 항체 각각을 (동일한 희석), 개별적으로 (각 튜브마다 하나씩) 비드를 함유하는 아홉 개의 튜브에 첨가한다.
참고: 모노 염색된 보상 대조군은 보상 단계 동안 사용된 각각의 형광 마커에 대한 형광의 양성 피크의 결정을 가능하게 할 것이다. 분석기는 이들을 염색되지 않은 대조군 CP 세포에서 관찰된 음성 신호와 비교할 것이다. - 항체 올-염색된 보상 비드: 골수성 염색에 사용되는 모든 항체를 한 튜브에 첨가하고 T 세포 염색에 사용되는 항체를 다른 튜브에 첨가한다.
참고: 모든 염색된 보정 컨트롤을 통해 각 형광 레이저 검출의 전압을 설정하고 다른 채널에서 형광 염료의 잠재적인 비특이적 신호 검출을 평가할 수 있습니다. - 빛에 노출되지 않도록 얼음 위에서 30-45 분 동안 배양하십시오.
- 최대 1.5mL의 모든 튜브를 MACS 버퍼로 채웁니다. 세포 및 보상 비드를 500 x g에서, 5분 동안, 4°C에서 원심분리한다.
- 상청액을 버리고 세포 및 보상 비드를 1.5 mL의 MACS 완충액으로 세척한다.
- 세포 및 보상 비드를 500 x g에서, 5분 동안, 4°C에서 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 세포 및 보상 비드를 500 μL의 MACS 완충액에 재현탁시킨다. 염색되지 않은 대조군(단계 5.8)을 최대 500μL까지 MACS 버퍼로 채운다.
- 각 튜브를 70 μm 스트레이너 (염색되지 않은 CP, DAPI 모노염색된 대조군, 및 골수성 및 T 세포 샘플)를 통해 CP 세포로 여과한다.
6. 유세포 측정
참고: 이 프로토콜에 사용되는 유량계에는 355nm UV 레이저, 405nm 바이올렛 레이저, 488nm 블루 레이저, 561nm 황록색 레이저 및 637nm 적색 레이저 등 5개의 레이저가 장착되어 있습니다.
- 세포계 설정, 추적(CST) 인터페이스 및 CST 제어 비드를 사용하여 세포계에 대한 일일 품질 관리 검사를 수행하여 분석, 기기 품질 및 일관된 표적 형광 강도 간의 일관성을 보장합니다.
- 유세포 분석기 실험을 설정하려면 이변량 플롯 및 히스토그램을 사용하여 새 실험을 만듭니다. 획득을 모니터링하기 위해 각 색상에 대한 전방 산란 영역(FSC-A) 및 측면 산란 영역(SSC-A) 플롯과 히스토그램 플롯이 포함되었는지 확인합니다.
- 염색되지 않은 대조군 CP 셀에서 FSC-A 및 SSC-A 파라미터에 대한 PMT 전압을 설정하여 세포 형태를 정의합니다.
- 염색되지 않은 대조군 CP 세포 상의 형광 피크의 네거티브 피크와 모든 항체로 염색된 보상 비드를 사용하여 플루오크롬의 양성 피크를 설정하고 검출기 신호가 스케일을 벗어나지 않고 다른 채널에서 너무 강하게 교차 검출되지 않도록 보장함으로써 각 형광 마커의 전압을 정의한다.
- 보정 매트릭스를 만들어 각 단색 보정 컨트롤을 분석합니다. 적절한 FSC-A/SSC-A 모집단에 게이팅한 후 히스토그램 플롯에서 단일 염색된 대조군을 확인하고 보정 컨트롤을 기록합니다. 모든 단일 염색된 샘플을 기록한 후, 보상 매트릭스를 계산한다.
- 골수성 및 T 세포 집단 둘 다에 대해 검출된 모든 사건을 기록한다.
7. CP 골수성 세포 게이팅
- FSC-A 대 SSC-A 및 셀의 게이트(크기 기준)를 선택합니다.
- FSC-A 대 순방향 산란 높이(FSC-H)를 사용하여 단일 셀에 대한 도터 게이트를 만듭니다.
- DAPI 대 FSC-A를 사용하여 라이브 셀에 대한 딸 게이트를 만들어 DAPI+ 셀을 제외합니다.
- CD45 대 FSC-A를 가진 CD45+ 면역 세포에 대한 딸 게이트를 생성하십시오.
- CD45+ 세포로부터 딸 게이트를 생성하고, CD11b 대 F4/80을 선택하고, 다음의 두 그룹을 확인한다: CD11b+ F4/80+ 및 CD11b+ F4/80- 집단 (다음 단계 7.8).
- CD11b+ F4/80+ 셀에 대한 딸 게이트를 만들고 CX3CR1 대 IA-IE를 선택합니다. CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM 및 CX3CR1+ IA-IE- 대식세포로 추가로 명명된 CX3CR1+ IA-IE+ BAM을 모두 식별합니다.
- CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- 대식세포에 대한 딸 게이트를 만들고 F4/80 대 CD11b를 선택합니다. CD11bhigh F4/80중간체와 CD11b+ F4/80high집단을 모두 확인하십시오. CD11bhigh F4/80중간체 CX3CR1+ IA-IE-Kolmer의 상복부 대식세포 및 CD11b+ F4/80high CX3 CR1 + IA-IE- BAM은 각각
참고: CD11bhigh F4/80중간체 CX3CR1+ IA-IE- 및 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- 세포는 F4/80중간체-F4/80high와 CD11bhigh-CD11b+ 수준 사이에 약간 혼합된 것으로 나타났다. - CD11b+ F4/80-집단으로부터(단계 7.5), Ly6C 대 IA-IE에 대한 게이트. IA-IE+ Ly6C- 개체군과 주로 단핵구/호중구에 해당하는 IA-IE- Ly6C+ 세포를 모두 선택합니다.
참고 : IA-IE- Ly6C + 세포의 높은 존재는 염증 상태가없는 동물의 관류 효능에 문제를 반영 할 가능성이 큽니다. 그들의 풍요로움은 낮아야 한다. - CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C-집단에 대한 딸 게이트를 생성하고, CD11b 대 CX3CR1을 선택하고, CD11bhigh CX3CR1low 및 CD11b+ CX3CR1-집단을 모두 식별한다.
8. CP T 세포 게이팅
- FSC-A 대 SSC-A 및 셀의 게이트(크기 기준)를 선택합니다.
- FSC-A 대 순방향 산란 높이(FSC-H)를 사용하여 단일 셀에 대한 도터 게이트를 만듭니다.
- DAPI 대 FSC-A를 사용하여 라이브 셀에 대한 딸 게이트를 만들어 DAPI+ 셀을 제외합니다.
- CD45 대 FSC-A를 가진 CD45+ 면역 세포에 대한 딸 게이트를 생성하십시오.
- CD45+ 세포로부터 딸 게이트를 생성하고 TCRβ 대 CD11b를 선택한다. CD11b+ 골수성 세포를 배제하고 TCRβ+ CD11b-T 세포 집단을 선택한다.
- TCRβ+ CD11b-모집단에 대한 딸 게이트를 생성하고 CD4 대 CD8a를 선택하십시오. CD8-CD4+ T 세포 및 CD8+ CD4-T 세포 둘 다를 확인한다.
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Representative Results
여기에 제시된 유세포 분석 결과 골수성 및 T 세포의 주요 하위 집합 (각각 그림 1 및 그림 2)과 고도로 재현 가능한 방식으로 마우스 당 상대적 총 수가 성공적으로 밝혀졌습니다 (그림 3).
골수성 세포의 유세포 분석 결과, CP는 CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM에 의해 채워져 CP에서 CD45+ 면역 세포의 거의 80%를 차지하는 것으로 나타났다. 이들 BAM은 MHC-II의 발현에 따라 두 개의 상이한 집단으로 나뉘어졌다: 이전에 발표된 데이터7에 따라 주요 그룹(CD45+ 면역 세포의 72%)을 구성한 IA-IE+ BAM 및 IA-IE-BAM이다. 콜머의 에피플렉서스 대식세포7,2의 CD11bhigh F4/80중간 CX3CR1+ IA-IE-집단도 확인되었고, 문헌7과 일관되게 CD45+ CP 면역 세포의 약 1.2%만을 나타냈다7. CD11b+ F4/80-면역 세포 중에서, Ly6C-IA-IE+ 세포의 두 개의 상이한 집단은 수지상 세포에 상응할 가능성이 있고, CD11bhigh CX3CR1low 및 CD11b+ CX3CR1-집단으로 나눌 수 있는 것을 특징으로 하였으며, 이는 각각 CD45+ CP 면역 세포의 약 3.1% 및 3.7%를 구성하였다. CD45+ CD11b+ F4/80-IA-IE-단핵구 및 호중구 둘 다를 포함하는 Ly6C+ 세포 집단은 이전의 보고에 따라 CD45+ 면역 세포의 단지 0.5%만을 구성하였고, PBS 관류의 높은 효능에 대해 증명하였다3. 이러한 결과는 단일 세포 RNA 시퀀싱7에 의한 CP 면역 집단을 평가하는 이전에 발표된 데이터와 크게 일치한다.
T 세포의 분석 및 게이팅 전략은 CD45+ CD11b-TCRβ+ 세포의 마이너 집단의 존재를 강조했다. 그 중에서도, 생리학적 조건하에서 마우스 당 약 30-50개의 CD8-CD4+ 및 CD8+ CD4-T 세포가 CP로 채워지고, CD45+ CP 면역 세포의 1.3% 및 0.9%를 각각 나타낸다. CD4+ 세포는 CD8+ T 세포보다 약간 더 풍부하였으며, 이는 수 및 비율21,30 둘 다의 관점에서 이전의 결과와 일치한다. 이러한 게이팅 전략은 또한 NKT 세포를 포함할 수 있는 CD45+ CD11b-TCRβ+ CD4-CD8-세포 집단, 및 최근에 기술된 조절 T 세포 서브세트10,28,31의 집단을 밝혀냈다. 제안된 유세포 분석 및 게이팅 전략은 마우스 CP를 구성하는 면역 세포(CD45+)의 거의 90%의 세포 유형 주석을 허용하였다.
도 1: 관류된 마우스의 CP로부터의 골수성 세포의 유세포 분석 및 게이팅 전략. 셀은 FSC-A 대 SSC-A를 사용하여 크기에 따라 게이팅됩니다. 일중항 세포는 FSC-A 대 FSC-H를 사용하여 선택된다. 살아있는 세포는 DAPI 대 FSC-A 플롯에서 DAPI+ 셀을 제외함으로써 게이팅된다. CD45+ 면역 세포는 CD45 대 FSC-A 플롯 상에서 확인된다. 게이팅 CD11b 대 F4/80, CD11b+ F4/80+ 및 CD11b+ F4/80-집단이 선택된다. CX3CR1 대 IA-IE를 사용하는 게이팅 CD11b+ F4/80+ 모집단, CD11b+ F4/80hi CX3CR1+ IA-IE+ BAM 및 CX3CR1+ IA-IE-집단 모두 결정된다. 이 후자의 집단은 F4/80 대 CD11b를 사용하여 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE-BAM 및 CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- 콜머의 상복부 대식세포를 더 잘 분리하기 위해 게이팅된다. 게이팅 Ly6C 대 IA-IE 상의 CD11b+ F4/80-, CD11b+ F4/80-IA-IE-Ly6C+ 세포 둘 다 주로 단핵구 및 호중구에 상응하는 Ly6C+ 세포 및 CD11b+ F4/80-IA-IE+ Ly6C-세포 집단을 나타낼 가능성이 있는 수지상 세포 집단이 선택된다. CD11b+ F4/80-IA-IE+ Ly6C-세포는 CD11b 대 CX3CR1을 사용하여 게이팅되어 CD11bhigh CX3CR1low 및 CD11b+ CX3CR1-세포의 식별을 가능하게 한다. 지정하지 않으면 각 게이트 모집단 아래의 값은 부모 모집단의 빈도를 나타냅니다. 안녕: 높은; int : 중간; lo: 낮음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 관류된 마우스의 CP로부터의 T 세포의 유세포 분석 및 게이팅 전략. 셀은 FSC-A 대 SSC-A를 사용하여 크기에 따라 게이팅됩니다. 단일 셀은 FSC-A 대 FSC-H를 사용하여 선택됩니다. 살아있는 세포는 DAPI 대 FSC-A 플롯 상에서 DAPI+ 세포를 제외하고 확인된다. CD45+ 면역 세포는 이어서 CD45 대 FSC-A 플롯 상에 게이팅된다. 게이팅 CD11b 대 TCRβ, CD11b-TCRβ+가 선택된다. 게이팅 CD4 대 CD8, CD8-CD4+ 및 CD4-CD8+ T 세포의 비율이 결정된다. 지정하지 않으면 각 게이트 모집단 아래의 값은 부모 모집단의 빈도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 마우스 당 CP에서의 주요 면역 세포 서브세트의 수. 함께 풀링된 네 개의 CP에서 확인된 상이한 면역 서브세트의 마우스 당 총 세포 수의 평균. 표현: 평균 + 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
뇌 항상성 및 질병에 대한 면역학적 기여를 이해하려는 연구는 주로 뇌 실질 내에 존재하는 세포에 초점을 맞추었고, 그럼에도 불구하고 뇌 기능에 중요한 기여자인 CP와 같은 뇌 경계를 무시했다2,3. CP에서 면역 세포 집단의 분석은 CP의 크기가 작고, 상주 면역 세포의 수가 적으며,이 조직에 대한 복잡한 접근으로 인해 어렵습니다. 총 뇌 면역 세포 (CD45+)에 대해 수행 된 유세포 측정은 CP에 상주하는 희귀 한 면역 집단의 특성화를 허용하지 않습니다. CP의 면역 조성을 높은 정밀도로 특성화하기 위해, PBS 관류 마우스로부터 해부된 CP에 대해 유세포 분석을 수행하였다. 이러한 접근법은 순환하는 CD45+ 세포 및 CP CD45-세포, 예컨대 혈관주위세포, 내피 및 상피 세포의 배제를 허용한다32. 골수성 및 T 세포 집단에 초점을 맞춘 게이팅 전략은 주요 CP 면역 서브세트를 확인한다.
현재 프로토콜의 중요한 단계는 PBS 관류이다. CP 면역 세포가 드물기 때문에 혈액 오염은 국소 이질성을 완전히 가릴 수 있습니다. 간과 뇌 변색은 항상 대조군으로 확인되므로 혈액 오염이 최소화됩니다. 일관되게, CD11b+ F4/80-Ly6C+는 비염증성 조건3에서 뇌가 아닌 혈액에 존재하는 단핵구 및 호중구를 모두 포함하며, CD45+ 세포의 단지 0.5%만을 차지하여, PBS 관류의 높은 효능을 입증하였다. PBS 관류 효능에 대한 또 다른 유용한 조절은 적혈구에 특이적인 마커인 Ter119에 대한 항체의 혼입일 수 있다. 마지막으로, 면역염색 및 현미경에 의한 PBS 관류 마우스 뇌 절편으로부터의 CP의 추가적인 분석은 또한 내피에 강하게 부착될 수 있는 임의의 혈액 면역 세포가 PBS 관류에 저항하고 혈관구조의 내강에서 부착되어 남아 있는지를 검증하는데 유용할 수 있다.
골수성 게이팅 전략은 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+/-BAM 및 CD11b+ F4/80중간 CX3CR1+ IA-IE- 콜머의 상복부 세포라는 두 집단의 대식세포를 밝혀냈으며, 이는 높은 수준의 CD11b와 낮은 수준의 F4/807을 발현한다. 콜머의 에피플렉서스 세포7,20 및 IA-IE-BAM의 게이트는 CD11b 및 F4/80 마커를 사용하여 명확하게 분리되지 않았다. CD206 마커를 이러한 게이팅 전략에 혼입시키는 것은 CD206+ IA-IE-BAM을 CD206low Kolmer의 epiplexus 세포로부터 더 잘 분화시키는 것을 도울 수 있다7.
CP 면역세포의 거의 7%는 CD11b+ F4/80-Ly6C-IA-IE+인 것으로 나타났다. 이러한 하위세트는 CD11b 및 CX3CR1 발현의 그들의 수준에 따라 두 집단으로 구성되었다. 이들 세포는 수지상 세포에 상응할 가능성이 높지만, 이는 FACS3 또는 면역형광33에 의한 그들의 CD11c 발현을 분석함으로써 확인될 것으로 남아있다. CD11b+ F4/80- Ly6C- IA-IE+ 집단은 또한 비만 세포를 포함할 가능성이 높다. CD117 및 c-kit의 검출을 위한 항체를 게이팅 전략에 통합하면 CD11c+ 수지상 세포와 구별하는 데 도움이 될 것이다3,34. CP 면역 세포 중 CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ 세포의 비율을 결정하였다. 그러나, 이들은 단핵구와 호중구를 모두 포함하며, CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ 세포의 게이팅 전략에 Ly6G 마커를 첨가하면 Ly6G+ 호중구에 대한 Ly6G-단핵구의 비율이 결정될 것이다. 기술된 CD45+ CD11b-TCRβ+ 집단 이상으로, CD45+ CD11b-집단에 대한 게이팅 전략은 NK 세포를 확인하기 위해 NK1.1 및 CD11c 마커를 사용하여, γδ T 세포를 분석하는 TCRγδ, B 세포를 특성화하기 위한 CD19 및/또는 B220, 및 혈장 세포를 확인하기 위한 CD138을 사용하여 풍부해질 수 있다3. 리포터 유전자의 발현도 이 분석에 포함될 수 있다. 예를 들어, Foxp3-GFP 트랜스제닉 마우스를 사용하는 것은 CP-상주 T 조절(Treg) 세포3,30을 확인하는데 도움이 될 수 있다. 마지막으로, 이러한 프로토콜은 또한 전사 인자 또는 사이토카인21의 세포내 염색을 통합할 수 있다.
뇌 실질의 면역 세포가 광범위하게 연구 된 반면, CP3,35,36과 같은 뇌 장벽을 채우는 면역 세포에 대해서는 훨씬 덜 알려져 있습니다. 마우스의 CP는 뇌의 네 가지 다른 영역에 위치한 작은 조직이며, 그들의 분리는 매우 복잡한 미세 해부를 필요로합니다. 이 때문에 CP는 대부분 이미징을 사용하여 연구되었습니다. 전체 CP 해부 조직 또는 뇌 절편에서 CP 면역 세포를 염색한 후 현미경 분석을 통해 CP 면역 메커니즘에 대한 이해에 큰 진보를 이루었습니다.14,15,21,22,26,27,29,30,33 . 그러나, 이 방법은 한 번에 단지 네 개 내지 여섯 개의 마커만이 분석될 수 있기 때문에 CP 면역세포 다양성의 광범위한 분석을 허용하지 않는다. 또한, CD4+ 또는 CD8+ T 세포와 같은 일부 하위집단은 CP에서 매우 드물며, 현미경을 이용한 그들의 표현형의 정량적 분석은 어려울 것이다. 유세포 분석 접근법은 모든 면역 세포에 대해 수십 개의 마커를 병렬로 분석 할 수있게하여 CP 면역 조성물의 정량적 평가에 더 적합한 도구를 제공합니다.
보다 최근에, 단일 핵 전사 기술(snRNA-seq)은 CP 이질성을 연구하는 강력한 방법으로서 나왔다10,28. 그러나, CP 면역 세포들이 CP 세포의 단지 작은 부분만을 구성하기 때문에 CP 면역 세포를 분석하는데 적합하지 않다. snRNA-seq 는 그들이 조직에 존재하는 비율로 세포를 샘플링하기 때문에, 면역 세포는 snRNA-seq에서 과소 대표되며, 그들의 낮은 숫자는 심층 분석을위한 장애물을 제기합니다10,28.
단세포 전사체(scRNA-seq)는 단리된 CP 면역세포의 면역세포 이질성을 정밀하게 매핑하기 위해 최근에 적용되었다7. scRNA-seq 는 매우 복잡하고 비용이 많이 들지만 유세포 측정은 CP에서 면역 하위집단을 조사하는 데 더 접근하기 쉬운 방법으로 작용할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜은 세포 분류 프로토콜의 일부로 작용할 수 있습니다.이 프로토콜은 선택된 세포 하위 유형이 scRNA-seq 또는 벌크 RNA 분석과 같은 분자 방법으로 분석하기 위해 FACS를 사용하여 분류됩니다.
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Disclosures
저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
Institut Pasteur Animalerie Centrale과 CB-UTechS 시설 회원들에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 작업은 파스퇴르 연구소에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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