Summary
Denne undersøgelse bruger flowcytometri og to forskellige gating strategier på isolerede perfuserede mus hjerne choroid plexuser; denne protokol identificerer de vigtigste immuncelleundergrupper, der befolker denne hjernestruktur.
Abstract
Hjernen betragtes ikke længere som et organ, der fungerer isoleret; akkumulerende beviser tyder på, at ændringer i det perifere immunsystem indirekte kan forme hjernens funktion. Ved grænsefladen mellem hjernen og den systemiske cirkulation er choroid plexuses (CP), som udgør blod-cerebrospinalvæskebarrieren, blevet fremhævet som et centralt sted for periferi-til-hjerne-kommunikation. CP producerer cerebrospinalvæsken, neurotrofiske faktorer og signalmolekyler, der kan forme hjernens homeostase. CP er også en aktiv immunologisk niche. I modsætning til hjerneparenchymen, som hovedsageligt er befolket af mikroglia under fysiologiske forhold, rekapitulerer heterogeniteten af CP-immunceller den mangfoldighed, der findes i andre perifere organer. CP-immuncellediversiteten og aktiviteten ændres med aldring, stress og sygdom og modulerer aktiviteten af CP-epitelet og derved indirekte former hjernens funktion. Målet med denne protokol er at isolere murin CP og identificere ca. 90% af de vigtigste immunundergrupper, der befolker dem. Denne metode er et værktøj til at karakterisere CP-immunceller og forstå deres funktion i orkestrering af periferi-til-hjerne-kommunikation. Den foreslåede protokol kan hjælpe med at dechiffrere, hvordan CP-immunceller indirekte modulerer hjernens funktion i sundhed og på tværs af forskellige sygdomstilstande.
Introduction
Siden opdagelsen af blod-hjerne-barrieren af Paul Erhlich i slutningen af det 19. århundrede er hjernen blevet betragtet som næsten adskilt fra de andre organer og blodbanen. Alligevel har dette sidste årti set fremkomsten af konceptet om, at hjernens funktion er formet af forskellige biologiske faktorer, såsom tarmmikrobiota og systemiske immunceller og signaler1,2,3,4. Parallelt er andre hjernegrænser såsom meninges og choroid plexuses (CP) blevet identificeret som grænseflader af aktiv immun-hjerne kryds tale snarere end inerte barrierevæv5,6,7,8.
CP udgør blod-cerebrospinalvæskebarrieren, en af grænserne, der adskiller hjernen og periferien. De er placeret i hver af de fire ventrikler i hjernen, dvs. den tredje, den fjerde og begge laterale ventrikler, og støder op til områder involveret i neurogenese, såsom hippocampus subventrikulære zone og subgranulære zone3. Strukturelt består CP af et netværk af fenestrated blodkapillærer omgivet af et monolag af epitelceller, som er forbundet med tætte og klæbende kryds9,10. Store fysiologiske roller af CP-epitelet involverer produktion af cerebrospinalvæske, som skyller hjernen fra affaldsmetabolitter og proteinaggregater, og produktion og kontrolleret blod-til-hjerne-passage af forskellige signalmolekyler, herunder hormoner og neurotrofiske faktorer11,12,13. Udskilte molekyler fra CP former hjernens aktivitet, dvs. ved at modulere neurogenese og mikroglial funktion14,15,16,17,18,19, hvilket gør CP afgørende for hjernens homeostase. CP deltager også i forskellige immunaktiviteter; mens den vigtigste immuncelletype i hjerneparenkymet under ikke-patologiske tilstande er microglia, er mangfoldigheden af CP-immuncellepopulationer lige så bred som i perifere organer3,7, hvilket tyder på, at forskellige kanaler for immunregulering og signalering er på arbejde ved CP.
Rummet mellem endotel- og epitelcellerne, CP stroma, er hovedsageligt befolket af grænsesammensatte makrofager (BAM), som udtrykker proinflammatoriske cytokiner og molekyler relateret til antigenpræsentation som reaktion på inflammatoriske signaler3. En anden undertype af makrofager, Kolmers epiplexusceller, er til stede på den apikale overflade af CP-epitelet20. CP stroma er også en niche for dendritiske celler, B-celler, mastceller, basofiler, neutrofiler, medfødte lymfoide celler og T-celler, som for det meste er effektorhukommelse T-celler, der er i stand til at genkende antigener i centralnervesystemet7,21,22,23,24. Derudover ændres sammensætningen og aktiviteten af immuncellepopulationer ved CP ved systemisk eller hjerneforstyrrelse, for eksempel under aldring10,14,15,21,25, mikrobiotaforstyrrelse7, stress26 og sygdom27,28. Især blev disse ændringer foreslået til indirekte at forme hjernens funktion, dvs. et skift af CP CD4 + T-celler mod Th2-inflammation forekommer i hjernens aldring og udløser immunsignalering fra CP, der kan forme aldringsrelateret kognitiv tilbagegang14,15,21,25,29 . Belysning af CP-immuncellernes egenskaber ville således være afgørende for bedre at forstå deres regulerende funktion på CP-epitelfysiologi og sekretion og derved dechiffrere deres indirekte indvirkning på hjernens funktion under sunde og sygdomsforhold.
CP er små strukturer, der kun indeholder få immunceller. Deres isolering kræver mikrodissektion efter et indledende trin af perfusion; immunceller i blodbanen ville ellers udgøre store forurenende stoffer. Denne protokol har til formål at karakterisere myeloid- og T-celledelmængderne af CP ved hjælp af flowcytometri. Denne metode identificerer ca. 90% af de immuncellepopulationer, der komponerer muse-CP under ikke-inflammatoriske tilstande, i overensstemmelse med nyligt offentliggjorte værker ved hjælp af andre metoder til at dissekere immun-CP-heterogenitet7,10,28. Denne protokol kunne anvendes til at karakterisere ændringer i CP-immuncellerummet med sygdom og andre eksperimentelle paradigmer in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurerne var i 1 retningslinjerne fra Europa-Kommissionen for håndtering af forsøgsdyr, direktiv 86/609/EØF. De blev godkendt af de etiske udvalg nr. 59, af CETEA/CEEA nr. 089, under nummeret dap210067 og APAFIS #32382-2021070917055505 v1.
1. Forberedelse af materialerne
- Opbevar alle antistoffer (Table of Materials) ved 4 °C, beskyttet mod lyseksponering.
- DAPI-stamopløsning (1 mg/ml): Genophænne pulveret i PBS-/- (table of Materials), alikvot, og opbevar det ved -20 °C.
- DAPI-arbejdsløsning (0,1 mg/ml): Fortynd DAPI-stamopløsning med PBS-/- i et forhold på 1:10.
- Buffer til magnetisk aktiveret cellesortering (MACS): Forbered 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 0,5 % bovin serumalbumin (BSA) (tabel over materialer) i PBS-/-.
- Kollagen IV-stamopløsning (20 U/μL): Resuspend pulveret i PBS+/+ (Table of Materials), aliquot, og opbevar ved -20 °C.
BEMÆRK: Collagenase IV kræver, at MgCl2 er fuldt aktiv; frys ikke-optø Collagenase IV-opløsning. - Bedøvelsesmiddel-smertestillende opløsning: Bland 150 μL ketamin (150 mg/kg), 25 μl xylazin (5 mg/kg) og 330 μl buprecare (0,1 mg/kg) i 1 ml PBS-/-.
BEMÆRK: Forbered bedøvelsesmiddel-smertestillende opløsning extemporaneously og hold det ikke længere end en dag. - Heparinopløsning (100 U/ml): Genophæns pulveret i PBS-/-.
- Forbered infusionssættet, der forbinder et rør med en karaffel Erlenmeyer fyldt med PBS-/-. Tilslut en 23 G nål til infusionsrørets ekstremitet. Åbn infusionssættet, og lad PBS køre, indtil der ikke er bobler i røret.
- Forbered kikkertens lup udstyret med et lys.
2. Hus af C57BL/6-mus
- Til analyse af CP-myeloide eller T-celler skal du bruge fire mus til hver og samle de fire CP (to fra hver lateral ventrikel, den tredje ventrikel og den fjerde ventrikel CP; for otte mus i alt). Ikke at samle CP medfører risiko for ikke at opdage de sjældne immunpopulationer i CP på grund af deres lave overflod.
- Lad musene akklimatisere sig i mindst 7 dage før ethvert forsøg. Hold musene under patogenfrie forhold ved konstant temperatur og fugtighed i en 12/12 timer eller 14/10 timer lys / mørk cyklus med vand og standard pelletsfoder ad libitum.
3. PBS-perfusion og hjernedissektion
- Hver mus vægtes, og der injiceres 10 μL/g af den bedøvelsesmiddel-smertestillende blandingsopløsning (trin 1.6) intraperitonealt.
- Vent omkring 30 minutter for effektiv analgesi (kontroller dybden af anæstesi ved at klemme musens cifre).
- Placer den anæstetiserede mus fladt på ryggen, på dissektionsstøtten, og tape håndfladerne til dissektionsstøtten.
- Klem dyrets hud med tang og brug en saks, åbn maven, membranen og brystkassen for at udsætte hjertet.
BEMÆRK: Når brystkassen åbnes, bliver hjernen anoxisk. Man må gå præcist og hurtigt gennem de næste trin i perfusionen. - 20 μL 100 U/ml heparinopløsning injiceres direkte i venstre ventrikel.
- Med en fin saks skal du lave et snit på mindst 3 mm i højre atrium for at lade blodet strømme ud af kroppen.
- Umiddelbart efter indsættes 23 G-nålen placeret i infusionsrørets ekstremitet gennem spidsen af venstre ventrikel.
- Åbn infusionssystemet maksimalt, og vent på fuldstændig perfusion: Ved hjælp af en 23 G nål med en strømningshastighed på ca. 6 ml /min er perfusionen afsluttet på 3 minutter.
BEMÆRK: Den jævne misfarvning af organer som leveren vidner om perfusionseffektivitet. - Luk infusionssystemet og fjern nålen fra hjerteventriklen.
- Fjern båndet fra musens håndflader. Placer musen i en ventral position.
- Klem dyrets hud med tang og brug en saks, fjern huden på toppen af hovedet fra øjnene til ørerne.
- Ved hjælp af en saks skal du først klippe kraniet mellem øjnene og derefter sideværts fra hvert øje til rygmarven lige over massetermusklerne. Til dette skal du bruge saksens ekstremitet og fortsætte forsigtigt for at undgå at beskadige hjernen med saksen.
- Åbn kraniet med tang ved at klemme det fra ekstremiteten mellem øjnene.
- Brug en saks til at klippe rygmarven og udtrække hjernen med tang, placere deres to punkter på den laterale side af hjernen for at vippe den og placere den i en petriskål fyldt med iskold PBS +/+. CP indsamles derefter straks.
BEMÆRK: Kontroller for misfarvning af hjernen for at verificere perfusionseffektivitet.
4. Dissektion af Choroid Plexus fra hjernen
- Placer hjernens dorsale side op i petriskålen og under kikkertlamellernes mål.
- Ved hjælp af tang for at opretholde hjernen på plads skal du indsætte de to ender af en anden tang ned gennem midterlinjen mellem halvkuglerne.
- Brug tangen til at trække cortex med callosum og hippocampus væk fra septum, udsætte den laterale ventrikel og en del af den tredje ventrikel.
- Identificer den laterale CP som et langt slør, der forer den laterale ventrikel, der blusser i begge ender. Brug de to ender af en tynd tang til at fange den laterale CP. Pas på at samle den trekantede bageste del, der kan være skjult af hippocampusens bageste fold.
- Træk cortex med corpus callosum og hippocampus på den kontralaterale halvkugle væk fra septum for at udsætte hele den tredje ventrikel og den modsatte laterale ventrikel.
- Saml med fine tang den tredje CP, som kan identificeres som en kort struktur med et granulært overfladeaspekt.
- Saml den anden laterale CP.
- Indsæt de to ender af en tang ned mellem lillehjernen og mellemhjernen. Fjern lillehjernen fra pons og medulla for at udsætte den fjerde ventrikel.
- Identificer den fjerde CP som en lang kugleformet struktur med et granulært overfladeaspekt, der linjer den fjerde ventrikel fra den laterale højre ende til venstre ende mellem lillehjernen og medulla. Saml den fjerde CP med fine tang.
BEMÆRK: Silan-base belægning af tang kan forhindre klæbrighed af CP på tang. - Gentag trin 3.1-4.9 for hver af de andre syv mus. I mellemtiden kan den indsamlede CP opbevares tidsmæssigt i et rør placeret på is.
5. Forberedelse af prøver til flowcytometrianalyse
- Fyld røret, der indeholder al dissekeret CP til 750 μL PBS+/+.
BEMÆRK: Aflejringen af dissekeret CP med tynde tang i røret bringer et lille volumen PBS +/+. Udfyld hellere det eksisterende volumen til 750 μL end fjern og erstat det med frisk 750 μL PBS +/+ for at undgå et muligt tab af CP-vævet. - Der tilsættes 15 μL 20 U/μL Kollagenase IV-stamopløsning (se trin 1.5) til en slutkoncentration på 400 U/ml.
BEMÆRK: DNAse I (150 μg/ml) kan forhindre overdreven celleklumpning. - Inkuber CP med Collagenase IV ved 37 °C under mild omrøring (300 rpm) i 45 min.
- Rør forsigtigt op og ned omkring 10 gange for at afslutte CP-dissociationen.
- Fyld CP-røret til 1,5 ml med MACS-buffer (se opskrift trin 1.4) for at stoppe collagenase IV-aktivitet.
BEMÆRK: Collagenase IV-aktivitet stoppes ved lav temperatur og hæmmes af serumalbumin. - Centrifugering af cellerne ved 500 x g, i 5 min, ved 4 °C. Kassér supernatanten, og vask cellerne med 1,5 ml MACS-buffer.
- Centrifugering af cellerne ved 500 x g i 5 min, ved 4 °C. Kassér supernatant- og resuspendcellerne i 220 μL MACS-buffer.
- Adskil en alikvote på 10 μL fra cellesuspensionen, der skal anvendes som ikke-tilbageholdt kontrol (næste trin 5.18).
- Adskil en alikvote på 10 μL fra cellesuspensionen, der skal anvendes som DAPI-mono-farvet kontrol (næste trin 5.12).
- Præinkuber de resterende 200 μL med anti-mus CD16/CD32 blokerende antistof (1:100) i 20 minutter ved 4 °C for at blokere uspecifikke Fc-medierede interaktioner.
- Opdel cellerne i to 100 μL-rør (det ene til myeloidcelleanalyse, det andet til analyse af T-celler) (næste trin 5.14).
- Prøven tages med 10 μL celler til DAPI-mono-farvet kontrol (trin 5.9) og fyld den op til 100 μL med MACS-buffer (næste trin 5.14).
- Forbered elleve nye rør indeholdende 100 μL MACS til antistoffet mono-farvet (trin 5.14.4) og all-stained kontroller (trin 5.14.5) og tilsæt en dråbe kompensationsperler i hver.
BEMÆRK: Kompensationskontrollerne gør det muligt at indstille spændingen på fluorescerende detektionslaser og vurdere den potentielle uspecifikke signaldetektion af fluorescerende farvestof i de andre kanaler, der vil blive yderligere kompenseret. - Antistofinkubation af prøver:
- Myeloid prøve: Tilsæt 0,1 mg/ml DAPI (1:100) (se trin 1.3), FITC anti-mus CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mus CD11b (1:100), APC anti-mus CX3CR1 (1:100), BV711 anti-mus Ly6C (1:100), PE anti-mus F4/80 (1:100) og APC-Cy7 anti-mus IA-IE (1:100).
- T-celleprøve: Tilsæt 0,1 mg/ml DAPI (1:100), FITC anti-mus CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b (1:100), APC anti-mouse TCRβ (1:100), PE anti-mouse CD8a (1:100) og APC-Cy7 anti-mouse CD4 (1:50).
- DAPI-mono-farvet kontrol (fra trin 5.12): Tilsæt 0,1 mg/ml DAPI (1:100).
- Antistof monofarvede kompensationsperler: Tilsæt hvert af de ni tidligere anvendte antistoffer til myeloide og T-celleprøver (samme fortynding), separat (et for hvert rør) til de ni rør, der indeholder perlerne.
BEMÆRK: De monofarvede kompensationskontroller gør det muligt at bestemme positive toppe af fluorescens for hver af de anvendte fluorescerende markører under kompensationstrinnet. Analysatoren sammenligner dem med det negative signal, der observeres i de ikke-tilbageholdte kontrol-CP-celler. - Antistof all-farvede kompensationsperler: Tilsæt alle de antistoffer, der anvendes til myeloidfarvning til et rør og dem, der anvendes til T-celler farvning til et andet.
BEMÆRK: De all-farvede kompensationskontroller gør det muligt at indstille spændingen for hver fluorescerende laserdetektion og vurdere den potentielle uspecifikke signaldetektion af fluorescerende farvestof i de andre kanaler. - Inkuber i 30-45 minutter på is, beskyttet mod lyseksponering.
- Fyld alle rør op til 1,5 ml med MACS-buffer. Centrifugering af cellerne og kompensationsperlerne ved 500 x g, i 5 minutter, ved 4 °C.
- Kassér supernatanten, og vask cellerne og kompensationsperlerne i 1,5 ml MACS-buffer.
- Centrifugering af cellerne og kompensationsperlerne ved 500 x g, i 5 minutter, ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Resuspend cellerne og kompensationsperlerne i 500 μL MACS-buffer. Fyld ikke-tilbageholdt kontrol (trin 5.8) op til 500 μL med MACS-buffer.
- Filtrer hvert rør med CP-celler gennem en 70 μm sil (ufarvet CP, DAPI mono-farvet kontrol og myeloid- og T-celleprøver).
6. Flowcytometri
BEMÆRK: Flowcytometeret, der anvendes i denne protokol, er udstyret med følgende 5 lasere: en 355 nm UV-laser, en 405 nm Violet laser, en 488 nm Blå laser, en 561 nm Gulgrøn laser og en 637 nm Rød laser.
- Udfør den daglige kvalitetskontrol af cytometeret ved hjælp af cytometeropsætningen, sporingsgrænsefladen (CST) og CST-kontrolperlerne for at sikre konsistens mellem analyser, instrumentkvalitet og konsistente målfluorescensintensiteter.
- For at konfigurere flowcytometrieksperimentet skal du oprette et nyt eksperiment med bivariate plots og histogrammer. Sørg for inkludering af et fremadrettet spredningsområde (FSC-A) og sidespredningsområde (SSC-A) plots samt histogramplot for hver farve for at overvåge erhvervelsen.
- Definer cellemorfologien ved at konfigurere PMT-spændingen for FSC-A- og SSC-A-parametre på ikke-tilbageholdte kontrol-CP-celler.
- Definer spændingerne for hver fluorescerende markør ved at opsætte fluorokromernes negative toppe på ikke-plettede kontrol-CP-celler og fluorokromernes positive toppe ved hjælp af kompensationsperler farvet med alle antistoffer og sikre, at detektorsignalerne ikke er uden for skalaen og ikke er for stærkt krydsdetekteret i andre kanaler.
- Opret en kompensationsmatrix for at analysere hvert af de enkeltfarvede kompensationskontrolelementer. Efter gating på relevante FSC-A/SSC-A-populationer skal du kontrollere enkeltfarvede kontroller på histogramplotter og registrere kompensationskontroller. Efter optagelse af alle enkeltfarvede prøver beregnes kompensationsmatrixen.
- Registrer alle hændelser, der er påvist for både myeloide- og T-cellepopulationer.
7. CP myeloide celler gating
- Vælg FSC-A vs. SSC-A og gate for celler (baseret på størrelse).
- Opret en datterport til enkeltceller med FSC-A vs. fremadrettet spredningshøjde (FSC-H).
- Opret en datterport til levende celler med DAPI vs. FSC-A for at udelukke DAPI+- celler.
- Opret en datterport til CD45+ immunceller med CD45 vs. FSC-A.
- Opret en datterport fra CD45+- cellerne, og vælg CD11b vs. F4/80, identificer følgende to grupper: CD11b+ F4/80+ og CD11b+ F4/80- populationerne (næste trin 7.8).
- Opret en datterport til CD11b+ F4/80+-celler, og vælg CX3CR1 vs. IA-IE. Identificer både CX3CR1+ IA-IE+ BAM, der yderligere er denomineret som CD11b+ F4/80høje CX3CR1+ IA-IE+ BAM, og CX3CR1+ IA-IE- makrofager.
- Opret en datterport til CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- makrofager, og vælg F4/80 vs. CD11b. Identificer både CD11bhigh F4/80intermediate og CD11b+ F4/80højpopulationer, der yderligere kaldes CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmers epiplexus makrofager og CD11b+ F4/80high CX3 CR1+ IA-IE- BAM, henholdsvis.
BEMÆRK: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- og CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE-celler syntes lidt blandet mellem F4/80intermediate-F4/80high og CD11bhigh-CD11b+ niveauer. - Fra CD11b + F4/80- populationen (trin 7.5), gate til Ly6C vs. IA-IE. Vælg både IA-IE+ Ly6C-population og IA-IE-Ly6C+-celler, der hovedsageligt svarer til monocytter/neutrofiler.
BEMÆRK: En høj forekomst af IA-IE-Ly6C+ celler afspejler sandsynligvis problemer i perfusionseffektiviteten hos dyr uden en inflammatorisk tilstand; deres overflod skal være lav. - Opret en datterport til CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C-population, og vælg CD11b vs. CX3CR1, identificer både CD11bhigh CX3CR1low og CD11b+ CX3CR1- populationer.
8. CP T-celler gating
- Vælg FSC-A vs. SSC-A og gate for celler (baseret på størrelse).
- Opret en datterport til enkeltceller med FSC-A vs. fremadrettet spredningshøjde (FSC-H).
- Opret en datterport til levende celler med DAPI vs. FSC-A for at udelukke DAPI+- celler.
- Opret en datterport til CD45+ immunceller med CD45 vs. FSC-A.
- Opret en datterport fra CD45+-cellerne, og vælg TCRβ vs. CD11b. Ekskluder CD11b+ myeloide celler, og vælg TCRβ+ CD11b-T-cellepopulation.
- Opret en datterport til TCRβ+ CD11b-population, og vælg CD4 vs. CD8a. Identificer både CD8- CD4+ T-celler og CD8+ CD4-T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De flowcytometrianalyser, der præsenteres her, afslørede med succes de vigtigste undergrupper af myeloide og T-celler (henholdsvis figur 1 og figur 2) og deres relative samlede antal pr. Mus på en meget reproducerbar måde (figur 3).
Flowcytometrianalysen af myeloide celler viste, at CP er befolket af CD11b + CX3CR1 + F4/80høj BAM, der repræsenterer næsten 80% af CD45 + immuncellerne ved CP. Disse BAM blev opdelt i to forskellige populationer i henhold til deres ekspression af MHC-II: IA-IE + BAM, der udgjorde hovedgruppen (72% af CD45+ immuncellerne) i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data7 og IA-IE-BAM. CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE-populationen af Kolmers epiplexus makrofager7,2 blev også identificeret og repræsenterede kun ca. 1,2% af CD45+ CP-immuncellerne, i overensstemmelse med litteraturen7. Blandt CD11b + F4/80-immuncellerne blev der karakteriseret to forskellige populationer af Ly6C-IA-IE + -celler, der sandsynligvis svarer til dendritiske celler, og som kan opdeles i CD11bhigh CX3CR1low og CD11b + CX3CR1- populationer, der udgjorde henholdsvis omkring 3,1% og 3,7% af CD45 + CP-immuncellerne. CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ cellepopulation, herunder både monocytter og neutrofiler, udgjorde kun 0,5 % af CD45+ immuncellerne i overensstemmelse med tidligere rapporter og attesterer for PBS-perfusionens høje effektivitet3. Disse resultater er stort set i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data, der vurderer CP-immunpopulationer ved enkeltcellet RNA-sekventering7.
Analyse- og gatingstrategien for T-celler fremhævede tilstedeværelsen af den mindre population af CD45 + CD11b- TCRβ + -celler. Blandt dem befolkede ca. 30-50 CD8-CD4+ og CD8+ CD4-T-celler pr. Mus CP under fysiologiske forhold, hvilket repræsenterer henholdsvis 1,3% og 0,9% af CD45+ CP-immuncellerne. CD4+-celler var lidt mere rigelige end CD8+ T-celler, hvilket er i overensstemmelse med tidligere resultater med hensyn til både antal og proportioner21,30. Denne gating-strategi afslørede også en population af CD45+ CD11b- TCRβ+ CD4-CD8-celler, som kan omfatte NKT-celler, og en nyligt beskrevet regulatorisk T-celledelmængde10,28,31. Den foreslåede flowcytometrianalyse og gatingstrategier tillod celletypeannotationen på næsten 90% af immuncellerne (CD45+), der komponerer musens CP.
Figur 1: Flowcytometrianalyse og gatingstrategi for myeloide celler fra CP af perfuserede mus. Celler er gated baseret på størrelse ved hjælp af FSC-A vs. SSC-A. Singletceller vælges ved hjælp af FSC-A vs. FSC-H. Levende celler er gated ved at udelukke DAPI+ celler på DAPI vs. FSC-A plot. CD45+ immunceller identificeres derefter på et CD45 vs. FSC-A plot. Gating CD11b vs. F4/80, CD11b + F4/80+ og CD11b + F4/80- populationer vælges. Gating CD11b + F4/80+ population ved hjælp af CX3CR1 vs. IA-IE, både CD11b + F4 / 80hi CX3CR1 + IA-IE + BAM og CX3CR1 + IA-IE- populationer bestemmes. Denne sidstnævnte population er derefter gated ved hjælp af F4/80 vs. CD11b for bedre at adskille CD11b + F4/80high CX3CR1+ IA-IE- BAM og CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmers epiplexus makrofager. Gating Ly6C vs. IA-IE på CD11b + F4/80-, begge CD11b + F4/80- IA-IE- Ly6C + celler, der hovedsageligt svarer til monocytter og neutrofiler og CD11b + F4/80- IA-IE + Ly6C- celler, der sandsynligvis repræsenterer dendritiske celler population, vælges. CD11b + F4/80- IA-IE + Ly6C-celler er gated ved hjælp af CD11b vs. CX3CR1, hvilket muliggør identifikation af CD11bhigh CX3CR1low og CD11b + CX3CR1- celler. Hvis det ikke er angivet, repræsenterer værdier under hver gated population hyppigheden af den overordnede population. hej: høj; int: mellemliggende; lo: lav. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Flowcytometrianalyse og gatingstrategi for T-celler fra CP af perfuserede mus. Celler er gated baseret på størrelse ved hjælp af FSC-A vs. SSC-A. Enkeltceller vælges ved hjælp af FSC-A vs. FSC-H. Levende celler identificeres eksklusive DAPI+- celler på DAPI vs. FSC-A-plot. CD45+ immunceller er derefter gated på en CD45 vs. FSC-A plot. Gating CD11b vs. TCRβ, CD11b- TCRβ+ er valgt. Gating CD4 vs. CD8 bestemmes proportionerne af CD8- CD4+ og CD4- CD8+ T-celler. Hvis det ikke er angivet, repræsenterer værdier under hver gated population hyppigheden af den overordnede population. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tal for de vigtigste immuncelleundergrupper ved CP pr. Mus. Gennemsnit af det samlede antal celler pr. mus i de forskellige immunundergrupper, der er identificeret i de fire CP, der er samlet sammen. Repræsentation: Middel + standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelser, der sigter mod at forstå de immunologiske bidrag til hjernens homeostase og sygdom, har hovedsageligt fokuseret på celler, der befinder sig i hjernens parenchyma, idet de forsømmer hjernegrænser som CP, som ikke desto mindre er afgørende bidragydere til hjernens funktion2,3. Analysen af immuncellepopulationer ved CP er udfordrende på grund af den lille størrelse af CP, lavt antal bosiddende immunceller og kompliceret adgang til dette væv. Flowcytometri udført på totale hjerneimmunceller (CD45+) tillader ikke karakterisering af de sjældne immunpopulationer, der befinder sig i CP. For at karakterisere immunsammensætningen af CP med høj præcision blev flowcytometrianalyser udført på CP dissekeret fra PBS-perfusionerede mus. Denne fremgangsmåde gør det muligt at udelukke cirkulerende CD45+-celler og CP CD45-celler såsom pericytter, endotel- og epitelceller32. Gating-strategierne med fokus på myeloid- og T-cellepopulationer identificerer de vigtigste CP-immunundergrupper.
Et kritisk trin i den nuværende protokol er PBS-perfusionen. Da CP-immuncellerne er sjældne, kan blodforurening fuldstændig maskere deres lokale heterogenitet. Misfarvning af lever og hjerne kontrolleres altid som kontrol, og derfor er blodforurening minimal. Konsekvent tegnede CD11b + F4/80- Ly6C+, som omfatter både monocytter og neutrofiler, der er til stede i blodet snarere end hjernen under ikke-inflammatoriske tilstande3, kun 0,5% af CD45+ cellerne, hvilket viser en høj effektivitet af PBS-perfusion. En anden nyttig kontrol for PBS-perfusionseffektivitet kan være inkorporeringen af antistoffer mod Ter119, en markør, der er specifik for erytrocytter. Endelig kan en yderligere analyse af CP fra PBS-perfuserede musehjernesektioner ved immunstaining og mikroskopi også være nyttig til at kontrollere, om eventuelle blodimmunceller, der kan være stærkt klæbende til endotelet, har modstået PBS-perfusionen og forbliver fastgjort ved vaskulaturens lumen.
Myeloid gating-strategien afslørede to populationer af makrofager: CD11b + F4/80high CX3CR1+ IA-IE+/-BAM og CD11b+ F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmers epiplexusceller, som udtrykker høje niveauer af CD11b og lave niveauer af F4/807. Portene til Kolmers epiplexusceller7,20 og IA-IE-BAM blev ikke klart adskilt ved hjælp af CD11b- og F4/80-markører. Inkorporering af CD206-markøren i denne gating-strategi kan bidrage til bedre at differentiere CD206+ IA-IE-BAM fra CD206low Kolmers epiplexusceller7.
Næsten 7% af CP-immuncellerne syntes at være CD11b + F4/80- Ly6C- IA-IE+. Denne delmængde var sammensat af to populationer i henhold til deres niveauer af CD11b og CX3CR1 ekspression. Disse celler svarer sandsynligvis til dendritiske celler, men dette skal bekræftes ved at analysere deres CD11c-ekspression enten ved FACS3 eller immunofluorescens33. CD11b + F4/80- Ly6C- IA-IE + populationen omfatter sandsynligvis også mastceller. Inkorporering af antistoffer til påvisning af CD117 og c-kit i gating-strategien ville bidrage til at skelne dem fra CD11c + dendritiske celler3,34. Andelen af CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+-celler blandt CP-immunceller blev bestemt. De inkluderer imidlertid både monocytter og neutrofiler, og tilføjelsen af Ly6G-markøren til gating-strategien for CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+-celler ville bestemme forholdet mellem Ly6G-monocytter og Ly6G+-neutrofiler. Ud over den beskrevne CD45+ CD11b-TCRβ+-population kan gating-strategien på CD45+ CD11b-populationer beriges ved hjælp af NK1.1- og CD11c-markører til at identificere NK-celler, TCRγδ til at analysere γδ T-celler, CD19 og/eller B220 til at karakterisere B-celler og CD138 til at identificere plasmaceller3. Ekspression af reportergener kan også indgå i denne analyse. For eksempel kan brug af Foxp3-GFP transgene mus være nyttigt til at identificere CP-residente T-regulatoriske (Treg) celler3,30. Endelig kan denne protokol også inkorporere intracellulær farvning af transkriptionsfaktorer eller cytokiner21.
Mens immuncellerne i hjerneparenchymen er blevet grundigt undersøgt, er der meget mindre kendt om immunceller, der befolker hjernebarrierer, såsom CP3,35,36. CP i mus er små væv placeret i fire forskellige områder af hjernen, og deres isolering kræver en ret kompleks mikrodissektion. På grund af dette blev CP for det meste undersøgt ved hjælp af billeddannelse. Farvning af CP-immunceller fra hele CP-dissekeret væv eller fra hjernesektioner efterfulgt af mikroskopisk analyse gav store fremskridt i forståelsen af CP-immunmekanismer14,15,21,22,26,27,29,30,33 . Denne metode tillader imidlertid ikke omfattende analyse af CP-immuncellediversiteten, da kun fire til seks markører kan analyseres ad gangen. Derudover er nogle underpopulationer såsom CD4 + eller CD8 + T-celler ret sjældne ved CP, og kvantitativ analyse af deres fænotyper med mikroskopi ville være udfordrende. Flowcytometrimetoden gør det muligt at analysere snesevis af markører parallelt for hver immuncelle, hvilket giver et bedre egnet værktøj til kvantitativ vurdering af CP-immunsammensætningen.
For nylig kom enkeltkerner transkriptomisk teknologi (snRNA-seq) ud som en kraftfuld metode til at studere CP heterogenitet10,28. Det er imidlertid ikke velegnet til analyse af CP-immunceller, da de kun udgør en lille brøkdel af CP-cellerne. Da snRNA-seq prøver cellerne i den andel, de er til stede i vævet, er immuncellerne underrepræsenteret i snRNA-seq, og deres lave tal udgør en hindring for dybdegående analyse10,28.
Enkeltcelletranskriptomik (scRNA-seq) er for nylig blevet anvendt til præcist at kortlægge immuncelleheterogeniteten af isolerede CP-immunceller7. Mens scRNA-seq er ret kompleks og dyr at udføre, kan flowcytometri tjene som en mere tilgængelig måde at kortlægge immunsubpopulationer ved CP. Endelig kan denne protokol tjene som en del af en cellesorteringsprotokol, hvor de udvalgte undertyper af celler sorteres ved hjælp af FACS til analyse med molekylære metoder, såsom scRNA-seq eller bulk RNA-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Institut Pasteur Animalerie Centrale og CB-UTechS-facilitetsmedlemmerne for deres hjælp. Dette arbejde blev støttet økonomisk af Institut Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -W.
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
