Summary
Denne studien bruker flowcytometri og to forskjellige gating strategier på isolerte perfused mus hjerne choroid plexuses; Denne protokollen identifiserer de viktigste immuncelledelsettene som fyller denne hjernestrukturen.
Abstract
Hjernen anses ikke lenger som et organ som fungerer isolert; akkumulerende bevis tyder på at endringer i det perifere immunsystemet indirekte kan forme hjernefunksjonen. Ved grensesnittet mellom hjernen og den systemiske sirkulasjonen har choroid-plexusene (CP), som utgjør blod-cerebrospinalvæskebarrieren, blitt fremhevet som et viktig sted for periferi-til-hjerne-kommunikasjon. CP produserer cerebrospinalvæsken, nevrotrofiske faktorer og signalmolekyler som kan forme hjernens homeostase. CP er også en aktiv immunologisk nisje. I motsetning til hjernen parenchyma, som er befolket hovedsakelig av mikroglia under fysiologiske forhold, recapitulates heterogeniteten til CP immunceller mangfoldet som finnes i andre perifere organer. CP-immuncellemangfoldet og aktivitetsendringen med aldring, stress og sykdom og modulerer aktiviteten til CP-epitelet, og former dermed indirekte hjernefunksjonen. Målet med denne protokollen er å isolere murine CP og identifisere ca 90% av de viktigste immunundergruppene som fyller dem. Denne metoden er et verktøy for å karakterisere CP immunceller og forstå deres funksjon i orkestrering av periferi-til-hjerne-kommunikasjon. Den foreslåtte protokollen kan bidra til å dechiffrere hvordan CP-immunceller indirekte modulerer hjernefunksjon i helse og på tvers av ulike sykdomstilstander.
Introduction
Siden oppdagelsen av blod-hjernebarrieren av Paul Erhlich på slutten av 1800-tallet, har hjernen blitt ansett som nesten skilt fra de andre organene og blodet. Likevel har dette siste tiåret sett fremveksten av konseptet om at hjernefunksjonen er formet av ulike biologiske faktorer, som tarmmikrobiota og systemiske immunceller og signaler1,2,3,4. Parallelt har andre hjernegrenser som meninger og choroidplexuses (CP) blitt identifisert som grensesnitt for aktiv immun-hjerne kryssprat i stedet for inert barriere vev5,6,7,8.
CP utgjør den blod-cerebrospinale væskebarrieren, en av grensene som skiller hjernen og periferien. De ligger i hver av de fire ventriklene i hjernen, det vil si den tredje, den fjerde og begge laterale ventriklene, og ligger ved siden av områder som er involvert i nevrogenese som subventrikulær sone og subgranulær sone av hippocampus3. Strukturelt består CP av et nettverk av fenesterte blodkapillærer vedlagt av en monolayer av epitelceller, som er sammenkoblet med tette og festekryss9,10. Store fysiologiske roller i CP-epitelet involverer produksjon av cerebrospinalvæske, som spyler hjernen fra avfallsmetabolitter og proteinaggregater, og produksjon og kontrollert blod-til-hjerne-passasje av ulike signalmolekyler, inkludert hormoner og nevrotrofiske faktorer11,12,13. Utskilte molekyler fra CP-formhjernens aktivitet, det vil si ved å modulere nevrogenese og mikroglial funksjon14,15,16,17,18,19, noe som gjør CP avgjørende for hjernens homeostase. CP deltar også i ulike immunaktiviteter; mens den viktigste immuncelletypen i hjernen parenchyma under ikke-patologiske forhold er mikroglia, er mangfoldet av CP immuncellepopulasjoner like bredt som i perifere organer3,7, noe som tyder på at ulike kanaler for immunregulering og signalering er i arbeid ved CP.
Mellomrommet mellom endotel- og epitelceller, CP-stromaen, er hovedsakelig befolket av grenserelaterte makrofager (BAM), som uttrykker proinflammatoriske cytokiner og molekyler relatert til antigenpresentasjon som svar på inflammatoriske signaler3. En annen undertype av makrofager, Kolmers epiplexusceller, er tilstede på den apikale overflaten av CP-epitelet20. CP stroma er også en nisje for dendrittiske celler, B-celler, mastceller, basofiler, nøytrofiler, medfødte lymfoidceller og T-celler som for det meste er effektorminne T-celler som er i stand til å gjenkjenne sentralnervesystemet antigener7,21,22,23,24. I tillegg endres sammensetningen og aktiviteten til immuncellepopulasjoner ved CP på systemisk eller hjerneperturbasjon, for eksempel under aldring av 10,14,15,21,25, mikrobiota perturbasjon7, stress26 og sykdom27,28. Spesielt ble disse endringene foreslått å indirekte forme hjernefunksjonen, det vil si et skifte av CP CD4 + T-celler mot Th2-betennelse oppstår i hjerne aldring og utløser immunsignalering fra CP som kan forme aldringsrelatert kognitiv nedgang14,15,21,25,29 . Å belyse egenskapene til CP-immuncellene vil dermed være avgjørende for å bedre forstå deres regulatoriske funksjon på CP-epitelfysiologi og sekresjon og dermed dechiffrere deres indirekte innvirkning på hjernefunksjonen under sunne og sykdomstilstander.
CP er små strukturer som bare inneholder noen få immunceller. Deres isolasjon krever mikrodisseksjon etter et foreløpig trinn i perfusjon; immunceller i blodet ellers ville utgjøre store forurensninger. Denne protokollen tar sikte på å karakterisere myeloid- og T-celledelsettene til CP ved hjelp av strømningscytometri. Denne metoden identifiserer omtrent 90% av immuncellepopulasjonene som komponerer mus CP under ikke-inflammatoriske forhold, i samsvar med nylig publiserte arbeider ved hjelp av andre metoder for å dissekere immun-CP-heterogenitet7,10,28. Denne protokollen kan brukes til å karakterisere endringer i CP immuncellerommet med sykdom og andre eksperimentelle paradigmer in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene ble avtalt med retningslinjene fra EU-kommisjonen for håndtering av forsøksdyr, direktiv 86/609/EØF. De ble godkjent av de etiske komiteene Nr. 59, av CETEA/CEEA Nr. 089, under nummeret dap210067 og APAFIS #32382-2021070917055505 v1.
1. Forberedelse av materialene
- Oppbevar alle antistoffer (Materialfortegnelser) ved 4 °C, beskyttet mot lyseksponering.
- DAPI-lageroppløsning (1 mg/ml): Resuspend pulveret i PBS-/- (Materialbord), aliquot og oppbevar ved -20 °C.
- DAPI arbeidsløsning (0,1 mg/ml): Fortynn DAPI-lagerløsningen med PBS-/- i forholdet 1:10.
- Magnetisk aktivert cellesortering (MACS)-buffer: Klargjør 2 mM etylendiamintetraatisk syre (EDTA) og 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) (Materialliste) i PBS-/-.
- Collagenase IV lagerløsning (20 U/μL): Resuspend pulveret i PBS +/+ (Materialbord), aliquot og oppbevares ved -20 °C.
MERK: Collagenase IV krever at MgCl2 er fullt aktiv; Ikke frys collagenase IV-oppløsningen. - Bedøvelses-smertestillende oppløsning: Bland 150 μL ketamin (150 mg/kg), 25 μl xylazin (5 mg/kg) og 330 μl buprecare (0,1 mg/kg) i 1 ml PBS-/-.
MERK: Forbered bedøvelsesmiddel-smertestillende løsning ekstemporaneously og ikke hold den lenger enn en dag. - Heparinoppløsning (100 U/ml): Resuspend pulveret i PBS-/-.
- Forbered infusjonsinsettsystemet som kobler et rør til en dekanter Erlenmeyer fylt med PBS-/-. Koble en 23 G nål til ekstremiteten til infusjonsrøret. Åpne infusjonssettet og la PBS gå til det ikke er noen bobler i røret.
- Forbered kikkertlusen utstyrt med et lys.
2. Boliger av C57BL / 6 mus
- For analyse av CP myeloid- eller T-celler, bruk fire mus for hver og slå sammen de fire CP (to fra hver lateral ventrikel, den tredje ventrikelen og den fjerde ventrikelen CP; for åtte mus totalt). Ikke pooling CP bærer risikoen for ikke å oppdage de sjeldne immunpopulasjonene i CP på grunn av deres lave overflod.
- La musene akklimatisere i minst 7 dager før eksperimentering. Hold musene under patogenfrie forhold ved konstant temperatur og fuktighet, i en 12/12 t eller 14/10 t lys / mørk syklus, med vann og standard pelletsmat ad libitum.
3. PBS-perfusjon og hjerne disseksjon
- Vekt hver mus og injiser 10 μL/g av den bedøvelses-smertestillende blandingsløsningen (trinn 1.6) intraperitonealt.
- Vent rundt 30 min for effektiv analgesi (se etter dybden av anestesi ved å klemme musens sifre).
- Plasser den bedøvede musen flatt på ryggen, på disseksjonsstøtten, og tape håndflatene til disseksjonsstøtten.
- Klem huden på dyret med tang og bruk saks, åpne magen, membranen og thoraxen for å eksponere hjertet.
MERK: Når thoraxen åpnes, blir hjernen anoksisk. Man må fortsette nøyaktig og raskt gjennom de neste trinnene i perfusjonen. - Injiser 20 μL 100 U/ml heparinoppløsning direkte i venstre ventrikel.
- Med fin saks, gjør et snitt på minst 3 mm i høyre atrium slik at blodet kan strømme ut av kroppen.
- Umiddelbart etter, sett inn 23 G nålen plassert i ekstremiteten av infusjonsrøret gjennom spissen av venstre ventrikel.
- Åpne infusjonssystemet maksimalt og vent på fullstendig perfusjon: Ved hjelp av en 23 G nål, med en strømningshastighet på ca. 6 ml/min, er perfusjonen fullført på 3 minutter.
MERK: Den jevne misfargingen av organer som leveren vitner om perfusjonseffekt. - Lukk infusjonssystemet og fjern nålen fra hjerte ventrikelen.
- Fjern båndet fra musens håndflater. Plasser musen i en ventral posisjon.
- Klem huden på dyret med tang og bruk saks, fjern huden på toppen av hodet fra øynene til ørene.
- Ved hjelp av saks, kutt skallen først mellom øynene og deretter lateralt fra hvert øye til ryggmargen like over massermuskulaturen. For dette, bruk ekstremiteten av saks og fortsett forsiktig for å unngå å skade hjernen med saksen.
- Åpne skallen med tang ved å klemme den fra ekstremiteten mellom øynene.
- Bruk saks til å kutte ryggmargen og trekke ut hjernen med tang, plassere sine to punkter på siden av hjernen for å vippe den og plassere den i en Petri-tallerken fylt med iskald PBS + / +. CP samles deretter umiddelbart inn.
MERK: Se etter misfarging av hjernen for å bekrefte perfusjonseffekten.
4. Disseksjon av Choroid Plexus fra hjernen
- Plasser hjernens dorsal side opp i Petri parabolen og under målene for kikkert loupes.
- Ved hjelp av tang for å opprettholde hjernen på plass, sett de to endene av en annen tang ned gjennom midtlinjen mellom halvkule.
- Bruk tang til å trekke cortex med callosum og hippocampus bort fra septum, utsette lateral ventrikel og en del av den tredje ventrikelen.
- Identifiser den laterale CP som et langt slør som fôrer den laterale ventrikelen som blusser i begge ender. Bruk de to endene av en tynn tang for å fange lateral CP. Vær forsiktig med å samle den trekantede bakre delen som kan være skjult av den bakre folden av hippocampus.
- Trekk cortex med corpus callosum og hippocampus av den kontralaterale halvkule bort fra septum for å avsløre hele tredje ventrikel og motsatt lateral ventrikel.
- Samle med fine tang den tredje CP, som kan identifiseres som en kort struktur med et granulært overflateaspektet.
- Samle den andre laterale CP.
- Sett de to endene av en tang ned mellom cerebellum og midbrain. Løsne cerebellum fra pons og medulla for å eksponere den fjerde ventrikelen.
- Identifiser den fjerde CP som en lang kuleformet struktur med et granulært overflateaspekt som linjer den fjerde ventrikelen fra den laterale høyre enden til venstre ende mellom cerebellum og medulla. Samle den fjerde CP med fine tang.
MERK: Silan-base belegg av tang kan forhindre klebrig cp på tang. - Gjenta trinn 3.1-4.9 for hver av de andre syv musene. I mellomtiden kan den innsamlede CP holdes timelig i et rør plassert på is.
5. Utarbeidelse av prøver for strømningscytometrianalyse
- Fyll røret som inneholder all dissekert CP til 750 μL PBS+/+.
MERK: Avsetningen av dissekert CP med tynne tang i røret gir et lite volum PBS +/+. Fullfør heller det eksisterende volumet til 750 μL enn å fjerne og erstatte det med frisk 750 μL PBS + / + for å unngå et mulig tap av CP-vevet. - Tilsett 15 μL 20 U/μL Collagenase IV lagerløsning (se trinn 1.5) for en 400 U/ml endelig konsentrasjon.
MERK: DNAse I (150 μg/ml) kan forhindre overdreven cellekumping. - Inkuber CP med Kollagené IV ved 37 °C under mild agitasjon (300 o/min) i 45 minutter.
- Pipette forsiktig opp og ned rundt 10 ganger for å fullføre CP-dissosiasjonen.
- Fyll CP-røret til 1,5 ml med MACS-buffer (se oppskrift trinn 1.4) for å stoppe kollagenaliser IV-aktivitet.
MERK: Collagenase IV-aktivitet stoppes ved lav temperatur og hemmes av serumalbumin. - Sentrifuger cellene ved 500 x g, i 5 min, ved 4 °C. Kast supernatanten og vask cellene med 1,5 ml MACS-buffer.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min, ved 4 °C. Kast supernatant- og resuspendcellene i 220 μL MACS-buffer.
- Skill en aliquot på 10 μL fra cellefjæringen som skal brukes som unstained kontroll (neste trinn 5.18).
- Skill en aliquot på 10 μL fra cellefjæringen som skal brukes som DAPI-monofarget kontroll (neste trinn 5.12).
- Preincubate de resterende 200 μL med anti-mus CD16 / CD32 blokkerende antistoff (1:100) i 20 min, ved 4 °C, for å blokkere ikke-spesifikke Fc-medierte interaksjoner.
- Del cellene i to 100 μL rør (en for myeloid celleanalyse, den andre for T-celleanalyse) (neste trinn 5.14).
- Ta prøven med 10 μL celler for DAPI-monofarget kontroll (trinn 5.9) og fyll den opp til 100 μL med MACS-buffer (neste trinn 5.14).
- Forbered elleve nye rør som inneholder 100 μL MACS for antistoffet monofarget (trinn 5.14.4) og all-stained kontroller (trinn 5.14.5) og legg til en dråpe kompensasjon perler i hver.
MERK: Kompensasjonskontrollene gjør det mulig å sette opp spenningen til fluorescerende deteksjonslaser og vurdere den potensielle uspesifiserte signaldeteksjonen av fluorescerende fargestoff i de andre kanalene som vil bli ytterligere kompensert. - Antistoffinkubasjon av prøver:
- Myeloidprøve: Legg til 0,1 mg/ml DAPI (1:100) (se trinn 1.3), FITC antimus CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 antimus CD11b (1:100), APC anti-mus CX3CR1 (1:100), BV711 anti-mus Ly6C (1:100), PE anti-mus F4/80 (1:100) og APC-Cy7 antimus IA-IE (1:100).
- Eksempel på T-celler: Add 0,1 mg/ml DAPI (1:100), FITC antimus CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 antimus CD11b (1:100), APC antimus TCRβ (1:100), PE antimus CD8a (1:100) og APC-Cy7 antimus CD4 (1:50).
- DAPI-monofarget kontroll (fra trinn 5.12): Tilsett 0,1 mg/ml DAPI (1:100).
- Antistoff monofargede kompensasjonsperler: Tilsett hvert av de ni tidligere brukte antistoffene for myeloid- og T-celleprøver (samme fortynning), separat (en for hvert rør) til de ni rørene som inneholder perlene.
MERK: De monofargede kompensasjonskontrollene vil tillate bestemmelse av positive topper av fluorescens for hver av de brukte fluorescerende markørene under kompensasjonstrinnet. Analysatoren vil sammenligne dem med det negative signalet som observeres i CP-cellene for ubegrunnet kontroll. - Antistoff all-farget kompensasjon perler: Legg til alle antistoffene som brukes til myeloid farging til ett rør og de som brukes til T-celler farging til et annet.
MERK: De fargede kompensasjonskontrollene gjør det mulig å sette opp spenningen til hver fluorescerende laserdeteksjon og vurdere potensiell uspesifisert signaldeteksjon av fluorescerende fargestoff i de andre kanalene. - Inkuber i 30-45 min på is, beskyttet mot lyseksponering.
- Fyll alle rør opp til 1,5 ml med MACS-buffer. Sentrifuger cellene og kompensasjonsperlene ved 500 x g, i 5 min, ved 4 °C.
- Kast supernatanten og vask cellene og kompensasjonsperlene i 1,5 ml MACS-buffer.
- Sentrifuger cellene og kompensasjonsperlene ved 500 x g, i 5 min, ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Resuspend cellene og kompensasjon perler i 500 μL AV MACS buffer. Fyll ubegrunnet kontroll (trinn 5.8) opp til 500 μL med MACS-buffer.
- Filtrer hvert rør med CP-celler gjennom en 70 μm sil (unstained CP, DAPI mono-farget kontroll, og myeloid- og T-celleprøver).
6. Flowcytometri
MERK: Strømningscytometeret som brukes i denne protokollen er utstyrt med følgende 5 lasere: en 355 nm UV-laser, en 405 nm fiolett laser, en 488 nm blå laser, en 561 nm gulgrønn laser og en 637 nm rød laser.
- Utfør de daglige kvalitetskontrollkontrollene på cytometeret ved hjelp av cytometeroppsettet, sporingsgrensesnittet (CST) og CST-kontrollperlene for å sikre konsistens mellom analyser, instrumentkvalitet og konsistente målfluorescensintensiteter.
- For å sette opp flowcytometrieksperimentet, lag et nytt eksperiment med bivariate tomter og histogrammer. Sikre inkludering av et fremoverspredningsområde (FSC-A) og sidespredningsområde (SSC-A) samt histogramplott for hver farge for å overvåke oppkjøpet.
- Definer cellemorfologien ved å sette opp PMT-spenningen for FSC-A- og SSC-A-parametere på unstained control CP-celler.
- Definer spenningene til hver fluorescerende markør ved å sette opp de negative toppene i fluorokromene på unstained kontroll CP-celler og de positive toppene i fluorokromene ved hjelp av kompensasjonsperler farget med alle antistoffer og sikre at detektorsignalene ikke er utenfor skalaen og ikke er for sterkt kryssetektert i andre kanaler.
- Opprett en kompensasjonsmatrise for å analysere hver av kompensasjonskontrollene med én farge. Når du har stirret på passende FSC-A/SSC-A-populasjoner, kontrollerer du enkeltfargede kontroller på histogramplott og registrerer kompensasjonskontroller. Etter å ha registrert alle enkeltfargede prøver, beregn kompensasjonsmatrisen.
- Registrer alle hendelser som er oppdaget for både myeloid- og T-cellepopulasjoner.
7. CP myeloid celler gating
- Velg FSC-A vs. SSC-A og gate for celler (basert på størrelse).
- Opprett en datterport for enkeltceller med FSC-A vs. fremoverspredningshøyde (FSC-H).
- Opprett en datterport for aktive celler med DAPI vs. FSC-A for å utelate DAPI+ -celler.
- Opprett en datterport for CD45+ immunceller med CD45 vs. FSC-A.
- Opprett en datterport fra CD45+- cellene, og velg CD11b vs. F4/80, identifiser følgende to grupper: CD11b+ F4/80+ og CD11b+ F4/80- populasjonene (neste trinn 7.8).
- Opprett en datterport for CD11b+ F4/80+-celler, og velg CX3CR1 vs. IA-IE. Identifiser både CX3CR1+ IA-IE+ BAM som er ytterligere denominert som CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM og CX3CR1+ IA-IE- makrofager.
- Opprett en datterport for CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- makrofager, og velg F4/80 vs. CD11b. Identifiser både CD11bhigh F4/80intermediate og CD11b+ F4/80high-populasjonene som ytterligere kalles CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmers epiplexusmakrofager og CD11b+ F4/80high CX3 CR1+ IA-IE- BAM, henholdsvis.
MERK: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- og CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- celler dukket opp litt blandet mellom F4/80intermediate-F4/80high og CD11bhigh-CD11b+ nivåer. - Fra CD11b+ F4/80- populasjonen (trinn 7.5), port for Ly6C vs. IA-IE. Velg både IA-IE+ Ly6C- populasjon og IA-IE- Ly6C+ celler som hovedsakelig tilsvarer monocytter/nøytrofiler.
MERK: En høy tilstedeværelse av IA-IE- Ly6C + celler reflekterer sannsynligvis problemer i perfusjonseffekten av dyr uten en inflammatorisk tilstand; deres overflod bør være lav. - Opprett en datterport for CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- populasjon og velg CD11b vs. CX3CR1- populasjoner.
8. CP T celler gating
- Velg FSC-A vs. SSC-A og gate for celler (basert på størrelse).
- Opprett en datterport for enkeltceller med FSC-A vs. fremoverspredningshøyde (FSC-H).
- Opprett en datterport for aktive celler med DAPI vs. FSC-A for å utelate DAPI+ -celler.
- Opprett en datterport for CD45+ immunceller med CD45 vs. FSC-A.
- Opprett en datterport fra CD45+- cellene, og velg TCRβ vs. CD11b. Utelat CD11b+ myeloidceller, og velg TCRβ+ CD11b- T-cellenes populasjon.
- Opprett en datterport for TCRβ+ CD11b-populasjon, og velg CD4 vs. CD8a. Identifiser både CD8- CD4+ T-celler og CD8+ CD4- T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strømningscytometrianalysene som presenteres her, avslørte vellykket de store undergruppene av myeloide og T-celler (henholdsvis figur 1 og figur 2), og deres relative totale antall per mus på en svært reproduserbar måte (figur 3).
Strømningscytometrianalysen av myeloide celler viste at CP er befolket av CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM, som representerer nesten 80% av CD45+ immuncellene ved CP. Disse BAM ble delt inn i to forskjellige populasjoner i henhold til deres uttrykk for MHC-II: IA-IE + BAM som utgjorde den store gruppen (72% av CD45 + immunceller), i tråd med tidligere publiserte data7, og IA-IE-BAM. CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- populasjonen av Kolmers epiplexusmakrofager7,2 ble også identifisert og representerte bare ca. 1,2% av CD45+ CP immunceller, konsekvent med litteraturen7. Blant CD11b+ F4/80-immuncellene er To forskjellige populasjoner av Ly6C- IA-IE + celler ble karakterisert som sannsynligvis tilsvarer dendrittiske celler, og som kan deles inn i CD11bhigh CX3CR1low og CD11b + CX3CR1- populasjoner som utgjorde rundt henholdsvis 3.1% og 3.7% av CD45 + CP immunceller. CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ cellepopulasjon inkludert både monocytter og nøytrofiler utgjorde bare 0,5% av CD45+ immunceller i samsvar med tidligere rapporter og attester for den høye effekten av PBS-perfusjonen3. Disse resultatene er i stor grad i samsvar med tidligere publiserte data som vurderer CP-immunpopulasjoner ved encellet RNA-sekvensering7.
Analyse- og gatingstrategien til T-celler fremhevet tilstedeværelsen av den mindre befolkningen i CD45 + CD11b- TCRβ + celler. Blant dem, ca 30-50 CD8- CD4 + og CD8 + CD4- T celler per mus befolket CP under fysiologiske forhold, representerer henholdsvis 1,3% og 0,9% av CD45 + CP immunceller. CD4+-cellene var litt mer tallrike enn CD8+ T-celler, noe som samsvarer med tidligere resultater både når det gjelder tall og andel21,30. Denne gating strategien avslørte også en populasjon av CD45 + CD11b- TCRβ + CD4- CD8-celler, som kan inkludere NKT-celler, og et nylig beskrevet regulatorisk T-celledelsett10,28,31. Den foreslåtte strømningscytometrianalysen og gatingstrategiene tillot celletypemerknaden til nesten 90% av immuncellene (CD45+) som komponerer musen CP.
Figur 1: Strømningscytometrianalyse og gatingstrategi for myeloide celler fra CP av perfused mus. Celler er inngjerdet basert på størrelse ved hjelp av FSC-A vs. SSC-A. Enkeltceller merkes ved hjelp av FSC-A vs. FSC-H. Levende celler er inngjerdet ved å utelate DAPI+-celler på DAPI- kontra FSC-A-plott. CD45+ immunceller identifiseres deretter på en CD45 vs. FSC-A-plott. Gating CD11b vs. F4/80, CD11b+ F4/80+ og CD11b+ F4/80- populasjoner er valgt. Gating CD11b+ F4/80+ populasjon ved hjelp av CX3CR1 vs. IA-IE, både CD11b+ F4/80hi CX3CR1+ IA-IE + BAM og CX3CR1 + IA-IE- populasjoner bestemmes. Denne sistnevnte populasjonen blir deretter inngjerdet ved hjelp av F4/80 vs. CD11b for bedre å skille CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- BAM og CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmers epiplexusmakrofager. Gating Ly6C vs. IA-IE på CD11b+ F4/80-, både CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ celler som hovedsakelig tilsvarer monocytter og nøytrofiler og CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- celler som sannsynligvis representerer dendrittiske celler populasjon er valgt. CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C-celler er inngjerdet ved hjelp av CD11b vs. CX3CR1 som tillater identifikasjon av CD11bhigh CX3CR1low- og CD11b+ CX3CR1-celler. Hvis de ikke er angitt, representerer verdier under hver inngjerdede populasjon hyppigheten av den overordnede populasjonen. hei: høy; int: mellomliggende; lo: lav. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flow cytometrianalyse og gating strategi av T-celler fra CP av perfused mus. Celler er inngjerdet basert på størrelse ved hjelp av FSC-A vs. SSC-A. Enkeltceller merkes ved hjelp av FSC-A vs. FSC-H. Levende celler identifiseres uten DAPI+ -celler på DAPI- kontra FSC-A-plott. CD45+ immunceller blir deretter inngjerdet på en CD45 vs. FSC-A-tomt. Gating CD11b vs. TCRβ, CD11b- TCRβ+ er valgt. Gating CD4 vs. CD8, er proporsjonene av CD8- CD4 + og CD4- CD8 + T celler bestemt. Hvis de ikke er angitt, representerer verdier under hver inngjerdede populasjon hyppigheten av den overordnede populasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Antall av de store immuncelledelsettene ved CP per mus. Gjennomsnittet av det totale antallet celler per mus i de forskjellige immundelsettene identifisert i de fire CP samlet sammen. Representasjon: Gjennomsnitt + standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier som tar sikte på å forstå de immunologiske bidragene til hjernens homeostase og sykdom har hovedsakelig fokusert på celler som ligger i hjerneparenchyma, og forsømmer hjernegrenser som CP, som likevel er avgjørende bidragsytere til hjernefunksjon2,3. Analysen av immuncellepopulasjoner ved CP er utfordrende på grunn av den lille størrelsen på CP, lavt antall bosatte immunceller og komplisert tilgang til dette vevet. Flowcytometri utført på totale hjerneimmunceller (CD45+) tillater ikke karakterisering av de sjeldne immunpopulasjonene som ligger i CP. For å karakterisere immunsammensetningen til CP med høy presisjon ble det utført strømningscytometrianalyser på CP dissekert fra PBS-perfused mus. Denne tilnærmingen tillater utelukkelse av sirkulerende CD45+ celler og CP CD45-celler som pericytter, endotel- og epitelceller32. Gating strategiene med fokus på myeloid- og T-cellepopulasjoner identifiserer de viktigste CP-immunundergruppene.
Et kritisk trinn i gjeldende protokoll er PBS-perfusjonen. Siden CP-immuncellene er sjeldne, kan blodforurensning helt maskere deres lokale heterogenitet. Lever- og hjerne misfarging kontrolleres alltid som kontroll, og derfor er blodforurensning minimal. Konsekvent utgjorde CD11b+ F4/80- Ly6C+, som inkluderer både monocytter og nøytrofiler tilstede i blodet i stedet for hjernen under ikke-inflammatoriske tilstander3, bare 0,5% av CD45+ cellene, noe som viser en høy effekt av PBS-perfusjon. En annen nyttig kontroll for PBS perfusjonseffekt kan være inkorporering av antistoffer mot Ter119, en markør som er spesifikk for erytrocytter. Til slutt kan en ytterligere analyse av CP fra PBS-perfunderte musehjerneseseksjoner ved immunstaining og mikroskopi også være nyttig for å verifisere om noen blodimmunceller som kan være sterkt tilhenger av endotelet har motstått PBS-perfusjonen og forbli festet på lumen i vaskulaturen.
Myeloid gating-strategien avslørte to populasjoner av makrofager: CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+/-BAM og CD11b+ F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmers epiplexusceller, som uttrykker høye nivåer av CD11b og lave nivåer av F4/807. Portene til Kolmers epiplexusceller7,20 og IA-IE- BAM ble ikke tydelig separert ved hjelp av CD11b- og F4/80-markører. Inkorporering av CD206-markøren i denne gatingstrategien kan bidra til å bedre skille CD206+ IA-IE- BAM fra CD206low Kolmers epiplexusceller7.
Nesten 7% av CP-immuncellene så ut til å være CD11b + F4 / 80 - Ly6C - IA-IE +. Dette delsettet består av to populasjoner i henhold til deres nivåer av CD11b- og CX3CR1-uttrykk. Disse cellene tilsvarer sannsynligvis dendrittiske celler, men dette gjenstår å bekrefte ved å analysere CD11c-uttrykket enten ved FACS3 eller immunfluorescence33. CD11b+ F4/80- Ly6C- IA-IE + populasjonen inkluderer sannsynligvis også mastceller. Å inkorporere antistoffer for påvisning av CD117 og c-kit i gatingstrategien vil bidra til å skille dem fra CD11c + dendrittiske celler3,34. Andelen CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+-celler blant CP-immunceller ble bestemt. Imidlertid inkluderer de både monocytter og nøytrofiler, og tillegg av Ly6G-markøren til gatingstrategien til CD45 + CD11b + F4 / 80 + Ly6C + -celler vil bestemme forholdet mellom Ly6G- monocytter til Ly6G + nøytrofiler. Utover den beskrevne CD45+ CD11b- TCRβ+ befolkningen, kan gatingstrategien på CD45+ CD11b-populasjoner berikes ved hjelp av NK1.1- og CD11c-markører for å identifisere NK-celler, TCRγδ for å analysere γδ T-celler, CD19 og/eller B220 for å karakterisere B-celler, og CD138 for å identifisere plasmaceller3. Uttrykk for reportergener kan også inngå i denne analysen. Bruk av Foxp3-GFP-transgene mus kan for eksempel være nyttig for å identifisere CP-residente T-regulatoriske celler (Treg)3,30. Til slutt kan denne protokollen også inkorporere intracellulær farging av transkripsjonsfaktorer eller cytokiner21.
Mens immuncellene i hjernen parenchyma har blitt grundig studert, er mye mindre kjent om immunceller som fyller hjernebarrierer, for eksempel CP3,35,36. CP hos mus er små vev som ligger i fire forskjellige områder av hjernen, og isolasjonen krever en ganske kompleks mikrodeseksjon. På grunn av dette ble CP for det meste studert ved hjelp av avbildning. Farging av CP-immunceller fra hele CP dissekert vev eller fra hjerneseksjoner etterfulgt av mikroskopisk analyse ga store fremskritt i forståelsen av CP-immunmekanismer14,15,21,22,26,27,29,30,33 . Denne metoden tillater imidlertid ikke omfattende analyse av CP-immuncellemangfoldet, da bare fire til seks markører kan analyseres om gangen. I tillegg er noen subpopulations som CD4 + eller CD8 + T celler ganske sjeldne på CP, og kvantitativ analyse av deres fenotyper med mikroskopi ville være utfordrende. Strømningscytometritilnærmingen gjør det mulig å analysere titalls markører parallelt for hver immuncelle, noe som gir et bedre egnet verktøy for kvantitativ vurdering av CP-immunsammensetningen.
Mer nylig kom single nuclei transcriptomic technology (snRNA-seq) ut som en kraftig metode for å studere CP heterogeneity10,28. Det er imidlertid ikke godt egnet for å analysere CP-immunceller, da de bare utgjør en liten brøkdel av CP-cellene. Siden snRNA-seq prøver cellene i den andelen de er til stede i vevet, er immuncellene underrepresentert i snRNA-seq, og deres lave tall utgjør et hinder for grundig analyse10,28.
Encellet transkripsjon (scRNA-seq) har nylig blitt brukt til å nøyaktig kartlegge immuncelle heterogeniteten til isolerte CP-immunceller7. Mens scRNA-seq er ganske kompleks og kostbar å utføre, kan strømningscytometri tjene som en mer tilgjengelig måte å kartlegge immununderbefolkninger ved CP. Til slutt kan denne protokollen tjene som en del av en cellesorteringsprotokoll, der de valgte undertypene av celler sorteres ved hjelp av FACS for analyse med molekylære metoder, for eksempel scRNA-seq eller bulk RNA-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Institut Pasteur Animalerie Centrale og cb-UTechS-anleggsmedlemmene for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet økonomisk av Institut Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -W.
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
