Summary
Este estudio utiliza citometría de flujo y dos estrategias diferentes de gating en ratones perfundidos aislados plexos coroideos cerebrales; este protocolo identifica los principales subconjuntos de células inmunes que pueblan esta estructura cerebral.
Abstract
El cerebro ya no se considera como un órgano que funciona de forma aislada; La evidencia acumulada sugiere que los cambios en el sistema inmune periférico pueden moldear indirectamente la función cerebral. En la interfaz entre el cerebro y la circulación sistémica, los plexos coroideos (PC), que constituyen la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo, se han destacado como un sitio clave de comunicación de la periferia al cerebro. La PC produce el líquido cefalorraquídeo, los factores neurotróficos y las moléculas de señalización que pueden dar forma a la homeostasis cerebral. Los PC también son un nicho inmunológico activo. En contraste con el parénquima cerebral, que está poblado principalmente por microglia en condiciones fisiológicas, la heterogeneidad de las células inmunes CP recapitula la diversidad que se encuentra en otros órganos periféricos. La diversidad y la actividad de las células inmunes CP cambian con el envejecimiento, el estrés y la enfermedad y modulan la actividad del epitelio CP, dando forma indirectamente a la función cerebral. El objetivo de este protocolo es aislar la PC murina e identificar alrededor del 90% de los principales subconjuntos inmunes que los pueblan. Este método es una herramienta para caracterizar las células inmunes CP y comprender su función en la orquestación de la comunicación de la periferia al cerebro. El protocolo propuesto puede ayudar a descifrar cómo las células inmunes CP modulan indirectamente la función cerebral en la salud y en diversas afecciones de la enfermedad.
Introduction
Desde el descubrimiento de la barrera hematoencefálica por Paul Erhlich a finales del siglo 19, el cerebro se ha considerado virtualmente separado de los otros órganos y el torrente sanguíneo. Sin embargo, esta última década ha visto la aparición del concepto de que la función cerebral está formada por varios factores biológicos, como la microbiota intestinal y las células y señales inmunes sistémicas1,2,3,4. Paralelamente, se han identificado otros bordes cerebrales como las meninges y los plexos coroideos (PC) como interfaces de diafonía inmunocerebral activa en lugar de tejidos de barrera inertes5,6,7,8.
La PC constituye la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo, uno de los bordes que separan el cerebro y la periferia. Se localizan en cada uno de los cuatro ventrículos del cerebro, es decir, el tercero, el cuarto y ambos ventrículos laterales, y son adyacentes a áreas implicadas en la neurogénesis como la zona subventricular y la zona subgranular del hipocampo3. Estructuralmente, los CP están compuestos por una red de capilares sanguíneos fenestrados encerrados por una monocapa de células epiteliales, que están interconectadas por uniones estrechas y adheridas9,10. Las principales funciones fisiológicas del epitelio CP implican la producción de líquido cefalorraquídeo, que elimina el cerebro de los metabolitos de desecho y los agregados de proteínas, y la producción y el paso controlado de sangre a cerebro de varias moléculas de señalización, incluidas las hormonas y los factores neurotróficos11,12,13. Las moléculas secretadas de la PC dan forma a la actividad del cerebro, es decir, modulando la neurogénesis y la función microglial14,15,16,17,18,19, lo que hace que la PC sea crucial para la homeostasis cerebral. CP también participa en diversas actividades inmunes; mientras que el principal tipo de célula inmune en el parénquima cerebral en condiciones no patológicas es la microglía, la diversidad de las poblaciones de células inmunes CP es tan amplia como en los órganos periféricos3,7, lo que sugiere que varios canales de regulación inmune y señalización están en funcionamiento en la PC.
El espacio entre las células endoteliales y epiteliales, el estroma CP, está poblado principalmente por macrófagos asociados al borde (BAM), que expresan citoquinas proinflamatorias y moléculas relacionadas con la presentación de antígenos en respuesta a señales inflamatorias3. Otro subtipo de macrófagos, las células del epiplexo de Kolmer, están presentes en la superficie apical del epitelio CP20. El estroma CP también es un nicho para las células dendríticas, células B, mastocitos, basófilos, neutrófilos, células linfoides innatas y células T que son en su mayoría células T de memoria efectoras capaces de reconocer antígenos del sistema nervioso central7,21,22,23,24. Además, la composición y actividad de las poblaciones de células inmunes en la PC cambia con la perturbación sistémica o cerebral, por ejemplo, durante el envejecimiento10,14,15,21,25, la perturbación de la microbiota7, el estrés26 y la enfermedad27,28. En particular, se sugirió que estos cambios moldean indirectamente la función cerebral, es decir, se produce un cambio de las células T CP CD4 + hacia la inflamación Th2 en el envejecimiento cerebral y desencadena la señalización inmune de la PC que puede dar forma al deterioro cognitivo asociado al envejecimiento14,15,21,25,29 . Por lo tanto, iluminar las propiedades de las células inmunes CP sería crucial para comprender mejor su función reguladora en la fisiología y secreción del epitelio CP y, por lo tanto, descifrar su impacto indirecto en la función cerebral en condiciones sanas y de enfermedad.
La PC son pequeñas estructuras que contienen sólo unas pocas células inmunes. Su aislamiento requiere microdisección después de un paso preliminar de perfusión; de lo contrario, las células inmunes en el torrente sanguíneo constituirían contaminantes importantes. Este protocolo tiene como objetivo caracterizar los subconjuntos mieloides y de células T de la PC mediante citometría de flujo. Este método identifica alrededor del 90% de las poblaciones de células inmunes que componen la PC de ratón en condiciones no inflamatorias, de acuerdo con trabajos publicados recientemente que utilizan otros métodos para diseccionar la heterogeneidad de la PC inmune7,10,28. Este protocolo podría aplicarse para caracterizar cambios en el compartimento de células inmunes CP con enfermedad y otros paradigmas experimentales in vivo.
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Protocol
Todos los procedimientos coincidieron con las directrices de la Comisión Europea para la manipulación de animales de laboratorio, directiva 86/609/CEE. Fueron aprobados por los comités de ética Nº 59, por el CETEA/CEEA Nº 089, bajo el número dap210067 y APAFIS #32382-2021070917055505 v1.
1. Preparación de los materiales
- Conservar todos los anticuerpos (Tabla de Materiales) a 4 °C, protegidos de la exposición a la luz.
- Solución madre DAPI (1 mg/ml): Resuspender el polvo en PBS-/- (Tabla de Materiales), alícuota, y almacenar a -20 °C.
- Solución de trabajo DAPI (0,1 mg/ml): Solución madre DAPI diluida con PBS-/- en una proporción de 1:10.
- Tampón de clasificación celular activado magnéticamente (MACS): Preparar 2 mM de ácido tetraacético de etileno diamina (EDTA) y albúmina sérica bovina al 0,5% (BSA) (Tabla de Materiales) en PBS-/-.
- Solución madre de colagenasa IV (20 U/μL): Resuspender el polvo en PBS+/+ (Tabla de Materiales), alícuota, y conservar a -20 °C.
NOTA: La colagenasa IV requiere mgCl2 para estar completamente activo; no congele y descongele la solución de colagenasa IV. - Solución anestésico-analgésica: Mezclar 150 μL de ketamina (150 mg/kg), 25 μl de xilazina (5 mg/kg) y 330 μl de buprecare (0,1 mg/kg) en 1 mL de PBS-/-.
NOTA: Prepare la solución anestésico-analgésica extemporáneamente y no la conserve más de un día. - Solución de heparina (100 U/mL): Resuspend el polvo en PBS-/-.
- Prepare el sistema de inserción de infusión conectando un tubo a un decantador Erlenmeyer lleno de PBS-/-. Conecte una aguja de 23 G a la extremidad del tubo de infusión. Abra el inserto de la infusión y deje que el PBS funcione hasta que no haya burbujas en el tubo.
- Prepare la lupa binocular equipada con una luz.
2. Alojamiento de ratones C57BL/6
- Para el análisis de células CELOIDES o T CP, utilice cuatro ratones para cada uno y agrupe los cuatro CP (dos de cada ventrículo lateral, el tercer ventrículo y el cuarto ventrículo CP; para ocho ratones en total). No agrupar la PC conlleva el riesgo de no detectar las raras poblaciones inmunes en la PC debido a su baja abundancia.
- Deje que los ratones se aclimaten durante al menos 7 días antes de cualquier experimentación. Mantenga a los ratones en condiciones libres de patógenos a temperatura y humedad constantes, en un ciclo de luz / oscuridad de 12/12 h o 14/10 h, con agua y alimentos de pellets estándar ad libitum.
3. Perfusión de PBS y disección cerebral
- Pondere cada ratón e inyecte 10 μL/g de la solución de mezcla anestésico-analgésica (paso 1.6) por vía intraperitoneal.
- Espere alrededor de 30 minutos para una analgesia eficiente (verifique la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos del mouse).
- Coloque el ratón anestesiado plano sobre su espalda, sobre el soporte de disección, y pegue sus palmas al soporte de disección.
- Pellizcando la piel del animal con fórceps y usando tijeras, abra el abdomen, el diafragma y el tórax para exponer el corazón.
NOTA: Cuando se abre el tórax, el cerebro se vuelve anóxico. Uno debe proceder con precisión y rapidez a través de los siguientes pasos de la perfusión. - Inyecte 20 μL de solución de heparina de 100 U/ml directamente en el ventrículo izquierdo.
- Con tijeras finas, haga una incisión de al menos 3 mm en la aurícula derecha para permitir que la sangre fluya fuera del cuerpo.
- Inmediatamente después, inserte la aguja de 23 G colocada en la extremidad del tubo de infusión a través de la punta del ventrículo izquierdo.
- Abra el sistema de infusión al máximo y espere la perfusión completa: Usando una aguja de 23 G, a una velocidad de flujo de aproximadamente 6 ml / min, la perfusión se completa en 3 minutos.
NOTA: La decoloración uniforme de órganos como el hígado atestigua la eficacia de la perfusión. - Cierre el sistema de infusión y retire la aguja del ventrículo cardíaco.
- Retire la cinta de las palmas de las manos del ratón. Coloque el ratón en una posición ventral.
- Pellizcando la piel del animal con fórceps y usando tijeras, retire la piel de la parte superior de la cabeza desde los ojos hasta las orejas.
- Con la ayuda de tijeras, corte el cráneo primero entre los ojos y luego lateralmente desde cada ojo hasta la médula espinal justo por encima de los músculos maseteros. Para esto, use la extremidad de las tijeras y proceda suavemente para evitar dañar el cerebro con las tijeras.
- Abra el cráneo con fórceps pellizcándolo de la extremidad entre los ojos.
- Use tijeras para cortar la médula espinal y extraer el cerebro con fórceps, colocando sus dos puntos en el lado lateral del cerebro para inclinarlo y colocarlo en una placa de Petri llena de PBS +/+ helado. Los PC se recogen inmediatamente.
NOTA: Compruebe si hay decoloración del cerebro para verificar la eficacia de la perfusión.
4. Disección del plexo coroideo del cerebro
- Coloque el lado dorsal del cerebro hacia arriba en la placa de Petri y debajo de los objetivos de las lupas binoculares.
- Con la ayuda de fórceps para mantener el cerebro en su lugar, inserte los dos extremos de otras pinzas hacia abajo a través de la línea media entre los hemisferios.
- Use los fórceps para tirar de la corteza con el calloso y el hipocampo lejos del tabique, exponiendo el ventrículo lateral y una parte del tercer ventrículo.
- Identifique la PC lateral como un velo largo que recubre el ventrículo lateral que está ardiendo en ambos extremos. Use los dos extremos de un fórceps delgado para atrapar la PC lateral. Tenga cuidado de recoger la parte posterior triangular que puede estar oculta por el pliegue posterior del hipocampo.
- Tire de la corteza con el cuerpo calloso y el hipocampo del hemisferio contralateral lejos del tabique para exponer todo el tercer ventrículo y el ventrículo lateral opuesto.
- Recoger con pinzas finas el tercer CP, que se puede identificar como una estructura corta con un aspecto de superficie granular.
- Recoger el otro CP lateral.
- Inserte los dos extremos de un fórceps hacia abajo entre el cerebelo y el mesencéfalo. Separe el cerebelo de la protuberancia y la médula para exponer el cuarto ventrículo.
- Identifique la cuarta PC como una estructura globular larga con un aspecto de superficie granular que recubre el cuarto ventrículo desde el extremo lateral derecho hasta el extremo izquierdo entre el cerebelo y la médula. Recoger el cuarto PC con fórceps finos.
NOTA: El recubrimiento a base de silano de los fórceps puede prevenir la pegajosidad de la PC en los fórceps. - Repita los pasos 3.1-4.9 para cada uno de los otros siete ratones. Mientras tanto, el PC recolectado se puede mantener temporalmente en un tubo colocado sobre hielo.
5. Preparación de muestras para análisis de citometría de flujo
- Llene el tubo que contiene toda la CP diseccionada a 750 μL de PBS+/+.
NOTA: La deposición de CP diseccionada con pinzas delgadas en el tubo trae un pequeño volumen de PBS+/+. Más bien complete el volumen existente a 750 μL que eliminarlo y reemplazarlo con 750 μL frescos de PBS +/ + para evitar una posible pérdida del tejido CP. - Añadir 15 μL de solución madre de 20 U/μL de colagenasa IV (ver paso 1.5) para una concentración final de 400 U/ml.
NOTA: El ADN I (150 μg/ml) puede prevenir la aglomeración excesiva de células. - Incubar CP con colagenasa IV a 37 °C bajo agitación leve (300 RPM) durante 45 min.
- Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo alrededor de 10 veces para finalizar la disociación de CP.
- Llene el tubo CP a 1,5 ml con tampón MACS (consulte el paso 1.4 de la receta) para detener la actividad de la colagenasa IV.
NOTA: La actividad de la colagenasa IV se detiene a baja temperatura y es inhibida por la albúmina sérica. - Centrifugar las células a 500 x g, durante 5 min, a 4 °C. Deseche el sobrenadante y lave las células con 1,5 ml de tampón MACS.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min, a 4 °C. Deseche las células sobrenadantes y resuspendidas en 220 μL de tampón MACS.
- Separe una alícuota de 10 μL de la suspensión celular para ser utilizada como control no teñido (siguiente paso 5.18).
- Separe una alícuota de 10 μL de la suspensión celular para ser utilizada como control de teñido mono-DAPI (siguiente paso 5.12).
- Preincubar los 200 μL restantes con anticuerpos bloqueadores CD16/CD32 anti-ratón (1:100) durante 20 min, a 4 °C, para bloquear las interacciones inespecíficas mediadas por Fc.
- Divida las células en dos tubos de 100 μL (uno para el análisis de células mieloides, el otro para el análisis de células T) (siguiente paso 5.14).
- Tome la muestra con 10 μL de células para el control DAPI-mono-teñido (paso 5.9) y llénela hasta 100 μL con tampón MACS (siguiente paso 5.14).
- Preparar once tubos nuevos que contengan 100 μL de MACS para los controles monomantados con anticuerpos (paso 5.14.4) y todos los controles teñidos (paso 5.14.5) y añadir una gota de perlas de compensación en cada uno.
NOTA: Los controles de compensación permitirán configurar el voltaje del láser de detección fluorescente y evaluar la posible detección de señal inespecífica del tinte fluorescente en los otros canales que se compensarán aún más. - Incubación de muestras de anticuerpos:
- Muestra mieloide: Agregue 0,1 mg/ml de DAPI (1:100) (consulte el paso 1.3), FITC anti-mouse CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b (1:100), APC anti-mouse CX3CR1 (1:100), BV711 anti-mouse Ly6C (1:100), PE anti-mouse F4/80 (1:100) y APC-Cy7 anti-mouse IA-IE (1:100).
- Muestra de células T: Agregue 0.1 mg/mL DAPI (1:100), FITC anti-mouse CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b (1:100), APC anti-mouse TCRβ (1:100), PE anti-mouse CD8a (1:100) y APC-Cy7 anti-mouse CD4 (1:50).
- Control dapi-mono-teñido (a partir del paso 5.12): Añadir 0,1 mg/ml DAPI (1:100).
- Perlas de compensación monoteñidas de anticuerpos: Agregue cada uno de los nueve anticuerpos utilizados anteriormente para muestras de células mieloides y T (misma dilución), por separado (uno para cada tubo) a los nueve tubos que contienen las perlas.
NOTA: Los controles de compensación mono-teñida permitirán la determinación de picos positivos de fluorescencia para cada uno de los marcadores fluorescentes utilizados durante el paso de compensación. El analizador los comparará con la señal negativa observada en las células CP de control no teñidas. - Perlas de compensación de anticuerpos totalmente teñidas: Agregue todos los anticuerpos utilizados para la tinción mieloide a un tubo y los utilizados para la tinción de células T a otro.
NOTA: Los controles de compensación totalmente manchados permitirán configurar el voltaje de cada detección láser fluorescente y evaluar la posible detección de señales inespecíficas de tinte fluorescente en los otros canales. - Incubar durante 30-45 min sobre hielo, protegido de la exposición a la luz.
- Llene todos los tubos hasta 1,5 ml con búfer MACS. Centrifugar las células y perlas de compensación a 500 x g, durante 5 min, a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y lave las celdas y las perlas de compensación en 1,5 ml de tampón MACS.
- Centrifugar las células y perlas de compensación a 500 x g, durante 5 min, a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspendir las células y las perlas de compensación en 500 μL de tampón MACS. Rellene el control sin manchas (paso 5.8) hasta 500 μL con el búfer MACS.
- Filtre cada tubo con células CP a través de un colador de 70 μm (CP no teñido, control monoteñido DAPI y muestras de células mieloides y T).
6. Citometría de flujo
NOTA: El citómetro de flujo utilizado en este protocolo está equipado con los siguientes 5 láseres: un láser UV de 355 nm, un láser violeta de 405 nm, un láser azul de 488 nm, un láser amarillo-verde de 561 nm y un láser rojo de 637 nm.
- Realice las comprobaciones diarias de control de calidad en el citómetro utilizando la configuración del citómetro, la interfaz de seguimiento (CST) y las perlas de control CST para garantizar la consistencia entre los análisis, la calidad del instrumento y las intensidades de fluorescencia objetivo consistentes.
- Para configurar el experimento de citometría de flujo, cree un nuevo experimento con gráficos bivariados e histogramas. Asegúrese de incluir un área de dispersión frontal (FSC-A) y un área de dispersión lateral (SSC-A), así como gráficos de histograma para cada color para monitorear la adquisición.
- Defina la morfología celular configurando el voltaje PMT para los parámetros FSC-A y SSC-A en celdas CP de control no teñidas.
- Defina los voltajes de cada marcador fluorescente configurando los picos negativos de los fluorocromos en las células CP de control no teñidas y los picos positivos de los fluorocromos utilizando perlas de compensación teñidas con todos los anticuerpos y asegurando que las señales del detector no estén fuera de la escala y no se detecten demasiado fuertemente cruzadas en otros canales.
- Cree una matriz de compensación para analizar cada uno de los controles de compensación de un solo color. Después de marcar las poblaciones apropiadas de FSC-A /SSC-A, verifique los controles de una sola mancha en las parcelas de histograma y registre los controles de compensación. Después de registrar todas las muestras de una sola teñida, calcule la matriz de compensación.
- Registre todos los eventos detectados tanto para las poblaciones mieloides como para las de células T.
7. Cierre de células mieloides CP
- Seleccione FSC-A frente a SSC-A y compuerta para las celdas (según el tamaño).
- Cree una puerta hija para celdas individuales con FSC-A frente a altura de dispersión hacia adelante (FSC-H).
- Cree una puerta hija para células vivas con DAPI frente a FSC-A para excluir las celdas DAPI+ .
- Cree una puerta hija para las células inmunes CD45 + con CD45 vs. FSC-A.
- Cree una puerta hija a partir de las celdas CD45+ y seleccione CD11b vs. F4/80, identifique los siguientes dos grupos: las poblaciones CD11b+ F4/80+ y CD11b+ F4/80- (siguiente paso 7.8).
- Cree una puerta secundaria para celdas CD11b+ F4/80+ y seleccione CX3CR1 frente a IA-IE. Identifique tanto CX3CR1+ IA-IE+ BAM que se denominan además como CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM, como CX3CR1+ IA-IE- macrófagos.
- Cree una puerta hija para los macrófagos CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- y seleccione F4/80 frente a CD11b. Identifique tanto las poblaciones CD11bhigh F4/80intermediate como CD11b+ F4/80high que se denominan además CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Los macrófagos del epiplexo de Kolmer y CD11b+ F4/80high CX3 CR1+ IA-IE- BAM, respectivamente.
NOTA: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- y CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- las células aparecieron un poco entremezcladas entre los niveles F4/80intermediate-F4/80high y CD11bhigh-CD11b+. - De la población CD11b+ F4/80- (paso 7.5), puerta para Ly6C vs. IA-IE. Seleccionar tanto células de población IA-IE+ Ly6C- como células IA-IE-Ly6C+ que correspondan principalmente a monocitos/neutrófilos.
NOTA: Una alta presencia de células IA-IE-Ly6C+ probablemente refleja problemas en la eficacia de la perfusión de animales sin una condición inflamatoria; su abundancia debe ser baja. - Cree una puerta hija para la población CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- y seleccione CD11b vs. CX3CR1, identifique las poblaciones CD11bhigh CX3CR1low y CD11b+ CX3CR1-.
8. Gating de células T CP
- Seleccione FSC-A frente a SSC-A y compuerta para las celdas (según el tamaño).
- Cree una puerta hija para celdas individuales con FSC-A frente a altura de dispersión hacia adelante (FSC-H).
- Cree una puerta hija para células vivas con DAPI frente a FSC-A para excluir las celdas DAPI+ .
- Cree una puerta hija para las células inmunes CD45 + con CD45 vs. FSC-A.
- Cree una puerta hija a partir de las células CD45+ y seleccione TCRβ frente a CD11b. Excluya las células mieloides CD11b+ y seleccione la población de células T TCRβ+ CD11b- .
- Cree una puerta hija para la población TCRβ+ CD11b- y seleccione CD4 frente a CD8a. Identifique tanto las células T CD8-CD4+ como las células T CD8+ CD4-.
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Representative Results
Los análisis de citometría de flujo presentados aquí revelaron con éxito los principales subconjuntos de células mieloides y T (Figura 1 y Figura 2, respectivamente), y su número total relativo por ratón de una manera altamente reproducible (Figura 3).
El análisis de citometría de flujo de células mieloides mostró que las CP están pobladas por CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM, representando casi el 80% de las células inmunes CD45+ en el CP. Estos BAM se dividieron en dos poblaciones diferentes según su expresión de MHC-II: el IA-IE+ BAM que constituía el grupo principal (72% de las células inmunes CD45+), en línea con los datos publicados anteriormente7, y el IA-IE-BAM. También se identificó la población CD11bigh F4/80intermediada CX3CR1+ IA-IE- de macrófagos epiplexos de Kolmer7,2 y sólo representó alrededor del 1,2% de las células inmunes CP CD45+, de acuerdo con la literatura7. Entre las células inmunes CD11b+ F4/80-, se caracterizaron dos poblaciones diferentes de células Ly6C-IA-IE+ que probablemente corresponden a células dendríticas, y que se pueden dividir en poblaciones CD11bigh CX3CR1low y CD11b+ CX3CR1- que constituyeron alrededor del 3,1% y el 3,7% de las células inmunes CD45+ CP, respectivamente. La población de células CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ incluyendo tanto monocitos como neutrófilos constituyó solo el 0,5% de las células inmunes CD45+ de acuerdo con informes previos y atestiguando la alta eficacia de la perfusión pbS3. Estos resultados son en gran medida consistentes con los datos publicados previamente que evalúan las poblaciones inmunes CP mediante secuenciación de ARN unicelular7.
La estrategia de análisis y gating de linfocitos T puso de manifiesto la presencia de la población menor de células CD45+ CD11b-TCRβ+. Entre ellos, alrededor de 30-50 células T CD8-CD4+ y CD8+ CD4- por ratón poblaron CP en condiciones fisiológicas, representando el 1,3% y el 0,9% de las células inmunes CD45+ CP, respectivamente. Las células CD4+ fueron ligeramente más abundantes que las células T CD8+, lo que es consistente con los resultados anteriores tanto en términos de número como de proporción21,30. Esta estrategia de gating también reveló una población de células CD45+ CD11b- TCRβ+ CD4- CD8-, que pueden incluir células NKT, y un subconjunto de células T reguladoras recientemente descrito10,28,31. El análisis de citometría de flujo propuesto y las estrategias de gating permitieron la anotación de tipo celular de casi el 90% de las células inmunes (CD45+) que componen el CP del ratón.
Figura 1: Análisis de citometría de flujo y estrategia de gating de células mieloides de CP de ratones perfundidos. Las celdas se cierran según el tamaño utilizando FSC-A vs. SSC-A. Las células singlete se seleccionan utilizando FSC-A vs. FSC-H. Las células vivas se cierran excluyendo las células DAPI+ en la gráfica DAPI vs. FSC-A. Las células inmunes CD45 + se identifican en una gráfica CD45 vs. FSC-A. Se seleccionan las poblaciones CD11b vs. F4/80, CD11b+ F4/80+ y CD11b+ F4/80-. En la población de CD11b+ F4/80+ utilizando CX3CR1 vs. IA-IE, se determinan tanto las poblaciones CD11b+ F4/80hi CX3CR1+ IA-IE+ BAM como CX3CR1+ IA-IE-. Esta última población se cierra utilizando F4/80 vs. CD11b para separar mejor CD11b + F4 / 80high CX3CR1 + IA-IE- BAM y CD11bhigh F4 / 80intermediato CX3CR1 + IA-IE- los macrófagos del epiplexo de Kolmer. Se seleccionan las células Ly6C vs. IA-IE en CD11b+ F4/80-, tanto las células CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ que corresponden principalmente a monocitos y neutrófilos como las células CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- que probablemente representan la población de células dendríticas. Las células CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- están cerradas utilizando CD11b vs. CX3CR1, lo que permite la identificación de células CD11bigh CX3CR1low y CD11b+ CX3CR1-. Si no se especifica, los valores por debajo de cada población cerrada representan la frecuencia de la población madre. hola: alto; int: intermedio; lo: bajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de citometría de flujo y estrategia de gating de linfocitos T de CP de ratones perfundidos. Las celdas se cierran según el tamaño utilizando FSC-A vs. SSC-A. Las células individuales se seleccionan utilizando FSC-A vs. FSC-H. Las células vivas se identifican excluyendo las células DAPI+ en la gráfica DAPI vs. FSC-A. Las células inmunes CD45 + se cierran en una gráfica CD45 vs. FSC-A. Se seleccionan gating CD11b vs. TCRβ, CD11b- TCRβ+. Al cerrar CD4 vs. CD8, se determinan las proporciones de células T CD8-CD4+ y CD4-CD8+. Si no se especifica, los valores por debajo de cada población cerrada representan la frecuencia de la población madre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Números de los principales subconjuntos de células inmunes en el PC por ratón. Media del número total de células por ratón de los diferentes subconjuntos inmunes identificados en los cuatro PC agrupados. Representación: Media + desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los estudios destinados a comprender las contribuciones inmunológicas a la homeostasis y la enfermedad cerebral se han centrado principalmente en las células que residen dentro del parénquima cerebral, descuidando las fronteras cerebrales como la PC, que sin embargo son contribuyentes cruciales a la función cerebral2,3. El análisis de las poblaciones de células inmunes en CP es un desafío debido al pequeño tamaño de CP, el bajo número de células inmunes residentes y el acceso complicado a este tejido. La citometría de flujo realizada en células inmunes cerebrales totales (CD45+) no permite la caracterización de las poblaciones inmunes raras que residen en la PC. Para caracterizar la composición inmune de la PC con alta precisión, se realizaron análisis de citometría de flujo en CP diseccionada de ratones perfundidos con PBS. Este enfoque permite la exclusión de células CD45+ circulantes y células CP CD45- como pericitos, células endoteliales y epiteliales32. Las estrategias de gating centradas en las poblaciones de células mieloides y T identifican los principales subconjuntos inmunes de CP.
Un paso crítico del protocolo actual es la perfusión PBS. Como las células inmunes CP son raras, la contaminación de la sangre podría enmascarar completamente su heterogeneidad local. La decoloración del hígado y el cerebro siempre se verifica como control y, por lo tanto, la contaminación de la sangre es mínima. Consistentemente, CD11b+ F4/80- Ly6C+, que incluye tanto monocitos como neutrófilos presentes en la sangre en lugar de en el cerebro en condiciones no inflamatorias3, representó solo el 0,5% de las células CD45+ , demostrando una alta eficacia de la perfusión de PBS. Otro control útil para la eficacia de la perfusión de PBS podría ser la incorporación de anticuerpos contra Ter119, un marcador específico para los eritrocitos. Finalmente, un análisis adicional de la PC de las secciones cerebrales de ratón perfundidas por PBS mediante inmunotinción y microscopía también puede ser útil para verificar si las células inmunes de la sangre que pueden estar fuertemente adheridas al endotelio han resistido la perfusión de PBS y permanecen unidas a la luz de la vasculatura.
La estrategia de gating mieloide reveló dos poblaciones de macrófagos: CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+/-BAM y CD11b+ F4/80intermediato CX3CR1+ IA-IE- Células del epiplexo de Kolmer, que expresan altos niveles de CD11b y bajos niveles de F4/807. Las puertas de las células del epiplexo de Kolmer7,20 e IA-IE-BAM no estaban claramente separadas utilizando marcadores CD11b y F4/80. La incorporación del marcador CD206 en esta estrategia de cierre puede ayudar a diferenciar mejor CD206+ IA-IE-BAM de las células del epiplexo de CD206low Kolmer7.
Casi el 7% de las células inmunes CP parecían ser CD11b + F4 / 80- Ly6C- IA-IE +. Este subconjunto estaba compuesto por dos poblaciones según sus niveles de expresión de CD11b y CX3CR1. Es probable que estas células correspondan a células dendríticas, pero esto aún no se ha confirmado mediante el análisis de su expresión de CD11c, ya sea por FACS3 o inmunofluorescencia33. La población CD11b+ F4/80- Ly6C- IA-IE+ probablemente también incluye mastocitos. La incorporación de anticuerpos para la detección de CD117 y c-kit en la estrategia de gating ayudaría a distinguirlos de las células dendríticas CD11c+3,34. Se determinó la proporción de células CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ entre las células inmunes CP. Sin embargo, incluyen tanto monocitos como neutrófilos, y la adición del marcador Ly6G a la estrategia de cierre de células CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ determinaría la proporción de monocitos Ly6G- a neutrófilos Ly6G+. Más allá de la población CD45+ CD11b- TCRβ+ descrita, la estrategia de gating en poblaciones CD45+ CD11b- puede enriquecerse utilizando marcadores NK1.1 y CD11c para identificar células NK, TCRγδ para analizar células T γδ, CD19 y/o B220 para caracterizar células B, y CD138 para identificar células plasmáticas3. La expresión de genes reporteros también se puede incluir en este análisis. Por ejemplo, el uso de ratones transgénicos Foxp3-GFP podría ser útil para identificar células reguladoras T (Treg) residentes en CP3,30. Por último, este protocolo también puede incorporar tinción intracelular de factores de transcripción o citoquinas21.
Mientras que las células inmunes del parénquima cerebral han sido ampliamente estudiadas, se sabe mucho menos sobre las células inmunes que pueblan las barreras cerebrales, como la CP3,35,36. La PC en ratones son pequeños tejidos ubicados en cuatro áreas diferentes del cerebro, y su aislamiento requiere una microdisección bastante compleja. Debido a esto, la PC se estudió principalmente utilizando imágenes. La tinción de células inmunes CP de tejido diseccionado CP completo o de secciones cerebrales seguidas de análisis microscópicos proporcionó avances importantes en la comprensión de los mecanismos inmunes CP14,15,21,22,26,27,29,30,33 . Sin embargo, este método no permite un análisis extenso de la diversidad de células inmunes CP, ya que solo se pueden analizar de cuatro a seis marcadores a la vez. Además, algunas subpoblaciones como las células T CD4 + o CD8 + son bastante raras en la CP, y el análisis cuantitativo de sus fenotipos con microscopía sería un desafío. El enfoque de citometría de flujo permite el análisis de decenas de marcadores en paralelo para cada célula inmune, proporcionando una herramienta más adecuada para la evaluación cuantitativa de la composición inmune CP.
Más recientemente, la tecnología transcriptómica de núcleos únicos (snRNA-seq) surgió como un método poderoso para estudiar la heterogeneidad de la PC10,28. Sin embargo, no es adecuado para analizar las células inmunes CP, ya que constituyen solo una pequeña fracción de las células CP. Dado que el snRNA-seq muestrea las células en la proporción en que están presentes en el tejido, las células inmunes están subrepresentadas en el snRNA-seq, y su bajo número representa un obstáculo para el análisis en profundidad10,28.
Recientemente se ha aplicado transcriptómica unicelular (scRNA-seq) para mapear con precisión la heterogeneidad de las células inmunes de las células inmunes CP aisladas7. Si bien scRNA-seq es bastante complejo y costoso de realizar, la citometría de flujo puede servir como una forma más accesible de inspeccionar las subpoblaciones inmunes en el CP. Por último, este protocolo puede servir como parte de un protocolo de clasificación celular, donde los subtipos seleccionados de células se clasifican utilizando FACS para el análisis con métodos moleculares, como scRNA-seq o análisis de ARN a granel.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos al Institut Pasteur Animalerie Centrale y a los miembros de las instalaciones de CB-UTechS por su ayuda. Este trabajo fue apoyado financieramente por el Institut Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -W.
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
