Summary
Cette étude utilise la cytométrie en flux et deux stratégies de contrôle différentes sur des plexus choroïdes cérébraux perfusés isolés; ce protocole identifie les principaux sous-ensembles de cellules immunitaires qui peuplent cette structure cérébrale.
Abstract
Le cerveau n’est plus considéré comme un organe fonctionnant isolément; L’accumulation de preuves suggère que les changements dans le système immunitaire périphérique peuvent indirectement façonner le fonctionnement du cerveau. À l’interface entre le cerveau et la circulation systémique, les plexus choroïdes (PC), qui constituent la barrière hémato-céphalo-rachidienne, ont été mis en évidence comme un site clé de la communication périphérique-cerveau. La PC produit le liquide céphalo-rachidien, les facteurs neurotrophiques et les molécules de signalisation qui peuvent façonner l’homéostasie cérébrale. La PC est également un créneau immunologique actif. Contrairement au parenchyme cérébral, qui est peuplé principalement de microglies dans des conditions physiologiques, l’hétérogénéité des cellules immunitaires CP récapitule la diversité trouvée dans d’autres organes périphériques. La diversité et l’activité des cellules immunitaires CP changent avec le vieillissement, le stress et la maladie et modulent l’activité de l’épithélium CP, façonnant ainsi indirectement la fonction cérébrale. L’objectif de ce protocole est d’isoler la PC murine et d’identifier environ 90% des principaux sous-ensembles immunitaires qui les peuplent. Cette méthode est un outil pour caractériser les cellules immunitaires CP et comprendre leur fonction dans l’orchestration de la communication périphérique-cerveau. Le protocole proposé peut aider à déchiffrer comment les cellules immunitaires CP modulent indirectement le fonctionnement du cerveau dans la santé et dans diverses maladies.
Introduction
Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du 19ème siècle, le cerveau a été considéré comme pratiquement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l’émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal et les cellules et signaux immunitaires systémiques1,2,3,4. En parallèle, d’autres frontières cérébrales telles que les méninges et les plexus choroïdes (PC) ont été identifiées comme des interfaces de diaphonie active entre le cerveau et le cerveau plutôt que comme des tissus de barrière inerte5,6,7,8.
Les CP constituent la barrière du liquide hémato-céphalo-rachidien, l’une des frontières séparant le cerveau et la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau, c’est-à-dire le troisième, le quatrième et les deux ventricules latéraux, et sont adjacents aux zones impliquées dans la neurogenèse telles que la zone sous-ventriculaire et la zone sous-granulaire de l’hippocampe3. Structurellement, les CP sont composés d’un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d’une monocouche de cellules épithéliales, qui sont interconnectées par des jonctions serrées et adhérentes9,10. Les principaux rôles physiologiques de l’épithélium CP impliquent la production de liquide céphalo-rachidien, qui chasse le cerveau des métabolites de déchets et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, y compris les hormones et les facteurs neurotrophiques11,12,13. Les molécules sécrétées par la PC façonnent l’activité du cerveau, c’est-à-dire en modulant la neurogenèse et la fonction microgliale14,15,16,17,18,19, ce qui rend la PC cruciale pour l’homéostasie cérébrale. Cp s’engage également dans diverses activités immunitaires; alors que le principal type de cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral dans des conditions non pathologiques est la microglie, la diversité des populations de cellules immunitaires CP est aussi large que dans les organes périphériques3,7, ce qui suggère que divers canaux de régulation immunitaire et de signalisation sont à l’œuvre au CP.
L’espace entre les cellules endothéliales et épithéliales, le stroma CP, est principalement peuplé de macrophages associés à la frontière (BAM), qui expriment des cytokines et des molécules pro-inflammatoires liées à la présentation de l’antigène en réponse à des signaux inflammatoires3. Un autre sous-type de macrophages, les cellules épiplexes de Kolmer, sont présentes sur la surface apicale de l’épithélium CP20. CP stroma est également une niche pour les cellules dendritiques, les cellules B, les mastocytes, les basophiles, les neutrophiles, les cellules lymphoïdes innées et les cellules T qui sont principalement des cellules T à mémoire effectrice capables de reconnaître les antigènes du système nerveux central7,21,22,23,24. En outre, la composition et l’activité des populations de cellules immunitaires au CP changent en cas de perturbation systémique ou cérébrale, par exemple, au cours du vieillissement10,14,15,21,25, de la perturbation du microbiote7, du stress26 et de la maladie27,28. Notamment, ces changements ont été suggérés pour façonner indirectement la fonction cérébrale, c’est-à-dire qu’un déplacement des lymphocytes T CP CD4+ vers l’inflammation Th2 se produit dans le vieillissement du cerveau et déclenche une signalisation immunitaire de la PC qui peut façonner le déclin cognitif associé au vieillissement14,15,21,25,29 . Éclairer les propriétés des cellules immunitaires CP serait donc crucial pour mieux comprendre leur fonction régulatrice sur la physiologie et la sécrétion de l’épithélium CP et ainsi déchiffrer leur impact indirect sur le fonctionnement du cerveau dans des conditions saines et pathologiques.
Les CP sont de petites structures qui ne contiennent que quelques cellules immunitaires. Leur isolement nécessite une microdissection après une étape préliminaire de perfusion; les cellules immunitaires dans la circulation sanguine constitueraient autrement des contaminants majeurs. Ce protocole vise à caractériser les sous-ensembles de cellules myéloïdes et T du CP à l’aide de la cytométrie en flux. Cette méthode identifie environ 90% des populations de cellules immunitaires qui composent la PC de souris dans des conditions non inflammatoires, conformément aux travaux récemment publiés utilisant d’autres méthodes pour disséquer l’hétérogénéité immunitaire de la CP7,10,28. Ce protocole pourrait être appliqué pour caractériser les changements dans le compartiment des cellules immunitaires CP avec la maladie et d’autres paradigmes expérimentaux in vivo.
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Protocol
Toutes les procédures ont été convenues avec les lignes directrices de la Commission européenne pour la manipulation des animaux de laboratoire, directive 86/609/CEE. Ils ont été approuvés par les comités d’éthique n° 59, par le CETEA/CEEA n° 089, sous le numéro dap210067 et aPAFIS n° 32382-2021070917055505 v1.
1. Préparation du matériel
- Conserver tous les anticorps (Table des matières) à 4 °C, à l’abri de l’exposition à la lumière.
- Solution mère DAPI (1 mg/mL) : Remettre la poudre en suspension dans pbS-/- (Table des matériaux), aliquote, et conserver à -20 °C.
- Solution de travail DAPI (0,1 mg/mL) : Diluer la solution mère DAPI avec PBS-/- dans un rapport de 1:10.
- Tampon de tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) : Préparer 2 mM d’acide tétraacétique d’éthylène diamine (EDTA) et 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) (Table des matières) dans PBS-/-.
- Solution mère de collagénase IV (20 U/μL) : Remettre la poudre en suspension dans PBS+/+ (Table des matières), aliquote, et conserver à -20 °C.
REMARQUE: Collagenase IV nécessite MgCl2 pour être pleinement actif; ne pas congeler-décongeler la solution de collagénase IV. - Solution anesthésique-analgésique : Mélanger 150 μL de kétamine (150 mg/kg), 25 μl de xylazine (5 mg/kg) et 330 μl de buprecare (0,1 mg/kg) dans 1 mL de PBS-/-.
REMARQUE: Préparez une solution anesthésique-analgésique extemporanée et ne la conservez pas plus d’une journée. - Solution d’héparine (100 U/mL) : Remettre la poudre en PBS-/-.
- Préparez le système d’encart de perfusion reliant un tube à une carafe Erlenmeyer remplie de PBS-/-. Branchez une aiguille de 23 G à l’extrémité du tube de perfusion. Ouvrez l’encart de perfusion et laissez le PBS fonctionner jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de bulles dans le tube.
- Préparez la loupe binoculaire équipée d’une lumière.
2. Boîtier des souris C57BL/6
- Pour l’analyse des cellules MYÉloïdes ou T CP, utilisez quatre souris pour chacune et regroupez les quatre CP (deux de chaque ventricule latéral, le troisième ventricule et le quatrième ventricule CP; pour huit souris au total). Ne pas mettre en commun la PC comporte le risque de ne pas détecter les populations immunitaires rares dans la PC en raison de leur faible abondance.
- Laissez les souris s’acclimater pendant au moins 7 jours avant toute expérimentation. Gardez les souris dans des conditions exemptes d’agents pathogènes à température et humidité constantes, dans un cycle lumière/obscurité de 12/12 h ou 14/10 h, avec de l’eau et des granulés standard ad libitum.
3. Perfusion pbs et dissection cérébrale
- Pondérer chaque souris et injecter 10 μL/g de la solution de mélange anesthésique-analgésique (étape 1.6) par voie intrapéritonéale.
- Attendez environ 30 minutes pour une analgésie efficace (vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les doigts de la souris).
- Placez la souris anesthésiée à plat sur le dos, sur le support de dissection, et collez ses paumes sur le support de dissection.
- Pincer la peau de l’animal avec une pince et utiliser des ciseaux, ouvrez l’abdomen, le diaphragme et le thorax pour exposer le cœur.
REMARQUE: Lorsque le thorax est ouvert, le cerveau devient anoxique. Il faut procéder avec précision et rapidité aux prochaines étapes de la perfusion. - Injecter 20 μL de solution d’héparine de 100 U/mL directement dans le ventricule gauche.
- Avec des ciseaux fins, faites une incision d’au moins 3 mm dans l’oreillette droite pour permettre au sang de s’écouler hors du corps.
- Immédiatement après, insérez l’aiguille de 23 G placée à l’extrémité du tube de perfusion à travers l’extrémité du ventricule gauche.
- Ouvrez le système de perfusion au maximum et attendez la perfusion complète: à l’aide d’une aiguille de 23 G, à un débit d’environ 6 mL / min, la perfusion est terminée en 3 min.
REMARQUE: La décoloration uniforme d’organes tels que le foie atteste de l’efficacité de la perfusion. - Fermez le système de perfusion et retirez l’aiguille du ventricule cardiaque.
- Retirez le ruban adhésif des paumes de la souris. Placez la souris en position ventrale.
- Pincer la peau de l’animal avec une pince et à l’aide de ciseaux, enlever la peau du haut de la tête des yeux aux oreilles.
- À l’aide de ciseaux, coupez d’abord le crâne entre les yeux, puis latéralement de chaque œil à la moelle épinière juste au-dessus des muscles masséters. Pour cela, utilisez l’extrémité des ciseaux et procédez doucement pour éviter d’endommager le cerveau avec les ciseaux.
- Ouvrez le crâne avec une pince en le pinçant de l’extrémité entre les yeux.
- Utilisez des ciseaux pour couper la moelle épinière et extraire le cerveau avec une pince, en plaçant leurs deux points sur le côté latéral du cerveau pour l’incliner et le placer dans une boîte de Petri remplie de PBS + / + glacé. Les CP sont alors immédiatement collectés.
REMARQUE: Vérifiez la décoloration du cerveau pour vérifier l’efficacité de la perfusion.
4. Dissection du plexus choroïde du cerveau
- Positionnez la face dorsale du cerveau vers le haut dans la boîte de Pétri et sous les objectifs des télescopes binoculaires.
- À l’aide de pinces pour maintenir le cerveau en place, insérez les deux extrémités d’une autre pince à travers la ligne médiane entre les hémisphères.
- Utilisez la pince pour éloigner le cortex avec le callosité et l’hippocampe du septum, exposant le ventricule latéral et une partie du troisième ventricule.
- Identifiez le CP latéral comme un long voile tapissant le ventricule latéral qui s’évase aux deux extrémités. Utilisez les deux extrémités d’une pince mince pour attraper le CP latéral. Veillez à recueillir la partie postérieure triangulaire qui peut être cachée par le pli postérieur de l’hippocampe.
- Éloignez le cortex avec le corps calleux et l’hippocampe de l’hémisphère controlatéral pour exposer tout le troisième ventricule et le ventricule latéral opposé.
- Collectez avec des pinces fines le troisième CP, qui peut être identifié comme une structure courte avec un aspect de surface granuleuse.
- Récupérez l’autre CP latéral.
- Insérez les deux extrémités d’une pince entre le cervelet et le mésencéphale. Détachez le cervelet des pons et de la médulla pour exposer le quatrième ventricule.
- Identifiez le quatrième CP comme une longue structure globulaire avec un aspect de surface granuleuse qui tapisse le quatrième ventricule de l’extrémité droite latérale à l’extrémité gauche entre le cervelet et la moelle épinière. Récupérez le quatrième CP avec de fines pinces.
REMARQUE: Le revêtement à base de silane des pinces peut empêcher l’adhérence du CP sur les pinces. - Répétez les étapes 3.1 à 4.9 pour chacune des sept autres souris. En attendant, le CP collecté peut être conservé temporellement dans un tube placé sur de la glace.
5. Préparation des échantillons pour l’analyse de cytométrie en flux
- Remplissez le tube contenant tout le CP disséqué à 750 μL de PBS+/+.
REMARQUE: Le dépôt de CP disséqué avec des pinces minces dans le tube apporte un petit volume de PBS + / +. Complétez plutôt le volume existant à 750 μL que de le retirer et de le remplacer par 750 μL frais de PBS+/+ pour éviter une éventuelle perte du tissu CP. - Ajouter 15 μL de 20 U/μL de solution mère de collagénase IV (voir étape 1.5) pour une concentration finale de 400 U/mL.
REMARQUE: Le DNAse I (150 μg / mL) peut empêcher l’agglutination excessive des cellules. - Incuber CP avec de la collagénase IV à 37 °C sous une légère agitation (300 tr/min) pendant 45 min.
- Pipettez doucement de haut en bas environ 10 fois pour finaliser la dissociation CP.
- Remplissez le tube CP à 1,5 mL avec un tampon MACS (voir l’étape 1.4 de la recette) pour arrêter l’activité de la collagénase IV.
REMARQUE: L’activité de la collagénase IV est arrêtée à basse température et inhibée par l’albumine sérique. - Centrifuger les cellules à 500 x g, pendant 5 min, à 4 °C. Jetez le surnageant et lavez les cellules avec 1,5 mL de tampon MACS.
- Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min, à 4 °C. Jeter les cellules surnageantes et les remettre en suspension dans 220 μL de tampon MACS.
- Séparer une aliquote de 10 μL de la suspension cellulaire à utiliser comme témoin non coloré (étape suivante 5.18).
- Séparer une aliquote de 10 μL de la suspension cellulaire à utiliser comme témoin mono-coloré DAPI (étape suivante 5.12).
- Préincuber les 200 μL restants avec un anticorps bloquant CD16/CD32 anti-souris (1:100) pendant 20 min, à 4 °C, pour bloquer les interactions non spécifiques médiées par Fc.
- Divisez les cellules en deux tubes de 100 μL (l’un pour l’analyse des cellules myéloïdes, l’autre pour l’analyse des lymphocytes T) (étape suivante 5.14).
- Prélever l’échantillon avec 10 μL de cellules pour le contrôle mono-coloré DAPI (étape 5.9) et le remplir jusqu’à 100 μL avec un tampon MACS (étape suivante 5.14).
- Préparer onze nouveaux tubes contenant 100 μL de MACS pour les anticorps mono-colorés (étape 5.14.4) et les témoins entièrement colorés (étape 5.14.5) et ajouter une goutte de billes de compensation dans chacun.
REMARQUE: Les contrôles de compensation permettront de configurer la tension du laser de détection fluorescente et d’évaluer la détection potentielle de signal non spécifique de colorant fluorescent dans les autres canaux qui seront compensés davantage. - Incubation d’anticorps d’échantillons :
- Échantillon myéloïde : Ajouter 0,1 mg/mL de DAPI (1:100) (voir étape 1.3), FITC anti-souris CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-souris CD11b (1:100), APC anti-souris CX3CR1 (1:100), BV711 anti-souris Ly6C (1:100), PE anti-souris F4/80 (1:100) et APC-Cy7 anti-souris IA-IE (1:100).
- Échantillon de lymphocytes T : Ajouter 0,1 mg/mL de DAPI (1:100), FITC anti-souris CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-souris CD11b (1:100), APC anti-souris TCRβ (1:100), PE anti-souris CD8a (1:100) et APC-Cy7 anti-souris CD4 (1:50).
- Contrôle DAPI-mono-taché (à partir de l’étape 5.12) : Ajouter 0,1 mg/mL de DAPI (1:100).
- Perles de compensation monocolores d’anticorps : Ajouter chacun des neuf anticorps précédemment utilisés pour les échantillons de cellules myéloïdes et T (même dilution), séparément (un pour chaque tube) aux neuf tubes contenant les billes.
REMARQUE: Les contrôles de compensation mono-colorés permettront de déterminer les pics positifs de fluorescence pour chacun des marqueurs fluorescents utilisés pendant l’étape de compensation. L’analyseur les comparera au signal négatif observé dans les cellules CP de contrôle non colorées. - Perles de compensation entièrement colorées par anticorps: Ajoutez tous les anticorps utilisés pour la coloration myéloïde à un tube et ceux utilisés pour la coloration des lymphocytes T à un autre.
REMARQUE: Les contrôles de compensation entièrement colorés permettront de configurer la tension de chaque détection de laser fluorescent et d’évaluer la détection potentielle de signal non spécifique de colorant fluorescent dans les autres canaux. - Incuber pendant 30-45 min sur de la glace, à l’abri de l’exposition à la lumière.
- Remplissez tous les tubes jusqu’à 1,5 mL avec un tampon MACS. Centrifuger les cellules et les billes de compensation à 500 x g, pendant 5 min, à 4 °C.
- Jeter le surnageant et laver les cellules et les billes de compensation dans 1,5 mL de tampon MACS.
- Centrifuger les cellules et les billes de compensation à 500 x g, pendant 5 min, à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules et les billes de compensation dans 500 μL de tampon MACS. Remplissez le contrôle non coloré (étape 5.8) jusqu’à 500 μL avec tampon MACS.
- Filtrer chaque tube avec des cellules CP à l’aide d’une passoire de 70 μm (échantillons de CP non colorés, de contrôle monocolore DAPI et de cellules myéloïdes et T).
6. Cytométrie en flux
REMARQUE: Le cytomètre en flux utilisé dans ce protocole est équipé des 5 lasers suivants: un laser UV de 355 nm, un laser violet de 405 nm, un laser bleu de 488 nm, un laser jaune-vert de 561 nm et un laser rouge de 637 nm.
- Effectuez les contrôles de qualité quotidiens sur le cytomètre à l’aide de l’interface de configuration du cytomètre, de suivi (CST) et des billes de contrôle CST pour assurer la cohérence entre les analyses, la qualité de l’instrument et les intensités de fluorescence cibles constantes.
- Pour mettre en place l’expérience de cytométrie en flux, créez une nouvelle expérience avec des tracés et des histogrammes bivariés. Assurez l’inclusion d’une zone de dispersion directe (FSC-A) et d’une zone de dispersion latérale (SSC-A) ainsi que de diagrammes d’histogramme pour chaque couleur afin de surveiller l’acquisition.
- Définissez la morphologie de la cellule en configurant la tension PMT pour les paramètres FSC-A et SSC-A sur les cellules CP de contrôle non colorées.
- Définir les tensions de chaque marqueur fluorescent en mettant en place les pics négatifs des fluorochromes sur les cellules CP de contrôle non colorées et les pics positifs des fluorochromes en utilisant des billes de compensation colorées avec tous les anticorps et en veillant à ce que les signaux du détecteur ne soient pas hors de l’échelle et ne soient pas trop fortement détectés dans d’autres canaux.
- Créez une matrice de compensation pour analyser chacun des contrôles de compensation monocolore. Après avoir examiné les populations FSC-A/SSC-A appropriées, vérifiez les contrôles à coloration unique sur les histogrammes et enregistrez les contrôles de compensation. Après avoir enregistré tous les échantillons à coloration unique, calculez la matrice de compensation.
- Enregistrer tous les événements détectés pour les populations de cellules myéloïdes et T.
7. Cellules myéloïdes CP gating
- Sélectionnez FSC-A par rapport à SSC-A et gate pour les cellules (en fonction de leur taille).
- Créez une porte fille pour les cellules simples avec FSC-A par rapport à la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H).
- Créez une porte fille pour les cellules vivantes avec DAPI par rapport à FSC-A pour exclure les cellules DAPI+.
- Créez une porte fille pour les cellules immunitaires CD45+ avec CD45 vs FSC-A.
- Créez une porte fille à partir des cellules CD45+ et sélectionnez CD11b vs F4/80, identifiez les deux groupes suivants : les populations CD11b+ F4/80+ et CD11b+ F4/80- (étape suivante 7.8).
- Créez une porte fille pour les cellules CD11b+ F4/80+ et sélectionnez CX3CR1 par rapport à IA-IE. Identifiez à la fois les macrophages CX3CR1+ IA-IE+ BAM qui sont en outre désignés comme CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM et CX3CR1+ IA-IE-.
- Créez une porte fille pour les macrophages CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- et sélectionnez F4/80 vs CD11b. Identifiez à la fois l’intermédiaire CD11bhigh F4/80 et les populations CD11b+ F4/80high qui sont ensuite appelées CD11bhigh F4/80intermédiate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer’s epiplexus macrophages et CD11b+ F4/80high CX3 CR1+ IA-IE-BAM, respectivement.
REMARQUE : Les cellules CX3CR1+ IA-IE- et CD11b+ F4/80haut CX3CR1+ IA-IE- cd11b-accompressées CD11b- sont apparues un peu mélangées entre les niveaux F4/80intermediate-F4/80high et CD11bhigh-CD11b+. - À partir de la population CD11b+ F4/80- (étape 7.5), porte pour Ly6C vs IA-IE. Sélectionnez à la fois les cellules DE population IA-IE+ Ly6C- et IA-IE-Ly6C+ qui correspondent principalement à des monocytes/neutrophiles.
REMARQUE: Une présence élevée de cellules IA-IE-Ly6C+ reflète probablement des problèmes dans l’efficacité de la perfusion d’animaux sans maladie inflammatoire; leur abondance devrait être faible. - Créez une porte fille pour la population CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- et sélectionnez CD11b par rapport à CX3CR1, identifiez les populations CD11bhigh CX3CR1low et CD11b+ CX3CR1-.
8. Contrôle des lymphocytes T CP
- Sélectionnez FSC-A par rapport à SSC-A et gate pour les cellules (en fonction de leur taille).
- Créez une porte fille pour les cellules simples avec FSC-A par rapport à la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H).
- Créez une porte fille pour les cellules vivantes avec DAPI par rapport à FSC-A pour exclure les cellules DAPI+.
- Créez une porte fille pour les cellules immunitaires CD45+ avec CD45 vs FSC-A.
- Créez une porte fille à partir des cellules CD45+ et sélectionnez TCRβ vs CD11b. Excluez les cellules myéloïdes CD11b+ et sélectionnez la population de cellules T TCRβ+ CD11b.
- Créez une porte fille pour la population TCRβ+ CD11b- et sélectionnez CD4 par rapport à CD8a. Identifiez à la fois les lymphocytes T CD8-CD4+ et les lymphocytes T CD8+CD4..
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Representative Results
Les analyses de cytométrie en flux présentées ici ont révélé avec succès les principaux sous-ensembles de cellules myéloïdes et T (figure 1 et figure 2, respectivement), ainsi que leur nombre total relatif par souris d’une manière hautement reproductible (figure 3).
L’analyse par cytométrie en flux des cellules myéloïdes a montré que les CP sont peuplées de CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM, représentant près de 80% des cellules immunitaires CD45+ au CP. Ces BAM ont été divisés en deux populations différentes en fonction de leur expression du CMH-II : le BAM IA-IE+ qui constituait le groupe majeur (72 % des cellules immunitaires CD45+), conformément aux données publiées précédemment7, et l’IA-IE-BAM. La population CX3CR1+ IA-IE- intermédiaire CD11bhigh F4/80 de macrophages épiplexus de Kolmer7,2 a également été identifiée et ne représentait qu’environ 1,2 % des cellules immunitaires CD45+ CP, conformément à la littérature7. Parmi les cellules immunitaires CD11b+ F4/80-, deux populations différentes de cellules Ly6C-IA-IE+ ont été caractérisées qui correspondent probablement à des cellules dendritiques, et qui peuvent être divisées en populations CD11bhigh CX3CR1low et CD11b+ CX3CR1- qui constituaient respectivement environ 3,1% et 3,7% des cellules immunitaires CD45+ CP. La population de cellules CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE-Ly6C+, comprenant à la fois des monocytes et des neutrophiles, ne constituait que 0,5 % des cellules immunitaires CD45+ conformément aux rapports précédents et attestant de la grande efficacité de la perfusion de PBS3. Ces résultats sont en grande partie cohérents avec les données publiées précédemment évaluant les populations immunitaires CP par séquençage de l’ARN unicellulaire7.
L’analyse et la stratégie de contrôle des lymphocytes T ont mis en évidence la présence de la population mineure de cellules CD45+ CD11b-TCRβ+. Parmi eux, environ 30 à 50 lymphocytes T CD8-CD4+ et CD8+ CD4- par souris ont atteint la PC dans des conditions physiologiques, représentant respectivement 1,3 % et 0,9 % des cellules immunitaires CD45+ CP. Les lymphocytes CD4+ étaient légèrement plus abondants que les lymphocytes T CD8+, ce qui est cohérent avec les résultats précédents en termes de nombre et de proportion21,30. Cette stratégie de contrôle a également révélé une population de cellules CD45+ CD11b-TCRβ+ CD4-CD8-, qui peut inclure des cellules NKT, et un sous-ensemble de lymphocytes T régulateurs récemment décrit10,28,31. L’analyse de cytométrie en flux et les stratégies de contrôle proposées ont permis l’annotation de type cellulaire de près de 90% des cellules immunitaires (CD45+) qui composent le CP de la souris.
Figure 1 : Analyse de cytométrie en flux et stratégie de contrôle des cellules myéloïdes à partir de CP de souris perfusées. Les cellules sont fermées en fonction de la taille en utilisant FSC-A vs SSC-A. Les cellules Singlet sont sélectionnées à l’aide de FSC-A vs FSC-H. Les cellules vivantes sont fermées en excluant les cellules DAPI+ sur le tracé DAPI vs FSC-A. Les cellules immunitaires CD45+ sont ensuite identifiées sur un diagramme CD45 vs FSC-A. Les populations CD11b vs F4/80, CD11b+ F4/80+ et CD11b+ F4/80- sont sélectionnées. La détermination de la population CD11b+ F4/80+ à l’aide du CX3CR1 par rapport à IA-IE, des populations CD11b+ F4/80hi CX3CR1+ IA-IE+ BAM et CX3CR1+ IA-IE- sont déterminées. Cette dernière population est ensuite fermée en utilisant F4/80 vs CD11b pour mieux séparer CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- BAM et CD11bhigh F4/80intermédiate CX3CR1+ IA-IE- Les macrophages épiplexes de Kolmer. Gating Ly6C vs IA-IE sur CD11b+ F4/80-, les deux cellules CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ qui correspondent principalement aux monocytes et aux neutrophiles et les cellules CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- qui représentent probablement la population de cellules dendritiques sont sélectionnées. Les cellules CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- sont fermées à l’aide de CD11b vs CX3CR1 permettant l’identification de cellules CD11bhigh CX3CR1low et CD11b+ CX3CR1-. Si elles ne sont pas spécifiées, les valeurs inférieures à chaque population fermée représentent la fréquence de la population parente. salut: élevé; int: intermédiaire; lo: faible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse par cytométrie en flux et stratégie de contrôle des lymphocytes T de souris perfusées. Les cellules sont fermées en fonction de la taille en utilisant FSC-A vs SSC-A. Les cellules individuelles sont sélectionnées à l’aide de FSC-A et FSC-H. Les cellules vivantes sont identifiées à l’exclusion des cellules DAPI+ sur le tracé DAPI vs FSC-A. Les cellules immunitaires CD45+ sont ensuite fermées sur un diagramme CD45 vs FSC-A. Gating CD11b vs TCRβ, CD11b- TCRβ+ sont sélectionnés. En râpant CD4 vs CD8, les proportions de lymphocytes T CD8-CD4+ et CD4-CD8+ sont déterminées. Si elles ne sont pas spécifiées, les valeurs inférieures à chaque population fermée représentent la fréquence de la population parente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Nombre des principaux sous-ensembles de cellules immunitaires au CP par souris. Moyenne du nombre total de cellules par souris des différents sous-ensembles immunitaires identifiés dans les quatre CP regroupés. Représentation : Moyenne + écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les études visant à comprendre les contributions immunologiques à l’homéostasie et à la maladie cérébrales se sont principalement concentrées sur les cellules résidant dans le parenchyme cérébral, négligeant les frontières cérébrales telles que la PC, qui sont néanmoins des contributeurs cruciaux au fonctionnement du cerveau2,3. L’analyse des populations de cellules immunitaires au CP est difficile en raison de la petite taille de la CP, du faible nombre de cellules immunitaires résidentes et de l’accès compliqué à ce tissu. La cytométrie en flux réalisée sur les cellules immunitaires totales du cerveau (CD45+) ne permet pas de caractériser les populations immunitaires rares qui résident dans la PC. Pour caractériser la composition immunitaire du CP avec une grande précision, des analyses de cytométrie en flux ont été menées sur des souris disséquées par LEP à partir de souris perfusées au PBS. Cette approche permet d’exclure les cellules CD45+ circulantes et les cellules CP CD45- telles que les péricytes, les cellules endothéliales et épithéliales32. Les stratégies de contrôle axées sur les populations de cellules myéloïdes et T identifient les principaux sous-ensembles immunitaires de la PC.
Une étape critique du protocole actuel est la perfusion PBS. Comme les cellules immunitaires CP sont rares, la contamination du sang pourrait masquer complètement leur hétérogénéité locale. La décoloration du foie et du cerveau est toujours vérifiée comme contrôle, et donc la contamination du sang est minime. Systématiquement, CD11b+ F4/80- Ly6C+, qui comprend à la fois des monocytes et des neutrophiles présents dans le sang plutôt que dans le cerveau dans des conditions non inflammatoires3, ne représentait que 0,5 % des cellules CD45+ , démontrant une grande efficacité de la perfusion de PBS. Un autre contrôle utile de l’efficacité de la perfusion du PBS pourrait être l’incorporation d’anticorps contre Ter119, un marqueur spécifique des érythrocytes. Enfin, une analyse supplémentaire de la PC à partir de sections cérébrales de souris perfusées par PBS par immunocoloration et microscopie peut également être utile pour vérifier si des cellules immunitaires sanguines qui peuvent adhérer fortement à l’endothélium ont résisté à la perfusion pbS et restent attachées à la lumière du système vasculaire.
La stratégie de contrôle myéloïde a révélé deux populations de macrophages : CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+/-BAM et CD11b+ F4/80intermédient CX3CR1+ IA-IE- cellules épiplexus de Kolmer, qui expriment des niveaux élevés de CD11b et de faibles niveaux de F4/807. Les portes des cellules épiplexes de Kolmer7,20 et IA-IE-BAM n’ont pas été clairement séparées à l’aide de marqueurs CD11b et F4/80. L’intégration du marqueur CD206 dans cette stratégie de contrôle peut aider à mieux différencier CD206+ IA-IE-BAM des cellules épiplexes de CD206low Kolmer7.
Près de 7% des cellules immunitaires CP semblaient être CD11b+ F4/80- Ly6C- IA-IE+. Ce sous-ensemble était composé de deux populations selon leurs niveaux d’expression de CD11b et de CX3CR1. Ces cellules correspondent probablement à des cellules dendritiques, mais cela reste à confirmer en analysant leur expression de CD11c soit par FACS3, soit par immunofluorescence33. La population CD11b+ F4/80- Ly6C-IA-IE+ comprend probablement aussi probablement des mastocytes. L’incorporation d’anticorps pour la détection de CD117 et de c-kit dans la stratégie de contrôle aiderait à les distinguer des cellules dendritiques CD11c+3,34. La proportion de cellules CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ parmi les cellules immunitaires CP a été déterminée. Cependant, ils comprennent à la fois des monocytes et des neutrophiles, et l’ajout du marqueur Ly6G à la stratégie de contrôle des cellules CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ déterminerait le rapport entre les monocytes Ly6G et les neutrophiles Ly6G+. Au-delà de la population CD45+ CD11b-TCRβ+ décrite, la stratégie de contrôle des populations CD45+ CD11b- peut être enrichie à l’aide de marqueurs NK1.1 et CD11c pour identifier les cellules NK, TCRγδ pour analyser les lymphocytes T γδ, CD19 et/ou B220 pour caractériser les lymphocytes B et CD138 pour identifier les plasmocytes3. L’expression des gènes rapporteurs peut également être incluse dans cette analyse. Par exemple, l’utilisation de souris transgéniques Foxp3-GFP pourrait être utile pour identifier les cellules T régulatrices résidentes de la CP (Treg)3,30. Enfin, ce protocole peut également intégrer une coloration intracellulaire des facteurs de transcription ou des cytokines21.
Alors que les cellules immunitaires du parenchyme cérébral ont été largement étudiées, on en sait beaucoup moins sur les cellules immunitaires peuplant les barrières cérébrales, telles que le CP3,35,36. Les CP chez la souris sont de petits tissus situés dans quatre zones différentes du cerveau, et leur isolement nécessite une microdissection assez complexe. Pour cette raison, les CP ont été principalement étudiés à l’aide de l’imagerie. La coloration des cellules immunitaires CP à partir de tissus disséqués PC entiers ou de coupes cérébrales suivie d’une analyse microscopique a fourni des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes immunitaires CP14,15,21,22,26,27,29,30,33 . Cependant, cette méthode ne permet pas une analyse approfondie de la diversité des cellules immunitaires CP car seulement quatre à six marqueurs peuvent être analysés à la fois. De plus, certaines sous-populations telles que les lymphocytes T CD4+ ou CD8+ sont assez rares au CP, et l’analyse quantitative de leurs phénotypes par microscopie serait difficile. L’approche de cytométrie en flux permet l’analyse de dizaines de marqueurs en parallèle pour chaque cellule immunitaire, fournissant un outil mieux adapté pour l’évaluation quantitative de la composition immunitaire CP.
Plus récemment, la technologie transcriptomique à noyau unique (snRNA-seq) est apparue comme une méthode puissante pour étudier l’hétérogénéité de la CP10,28. Cependant, il n’est pas bien adapté à l’analyse des cellules immunitaires CP car elles ne constituent qu’une petite fraction des cellules CP. Étant donné que l’ARNN-seq échantillonne les cellules à la proportion de leur présence dans le tissu, les cellules immunitaires sont sous-représentées dans la séquence d’ARNN et leur faible nombre constitue un obstacle à une analyse approfondie10,28.
La transcriptomique unicellulaire (scRNA-seq) a récemment été appliquée pour cartographier avec précision l’hétérogénéité des cellules immunitaires des cellules immunitaires CP isolées7. Bien que scRNA-seq soit assez complexe et coûteux à réaliser, la cytométrie en flux peut servir de moyen plus accessible d’étudier les sous-populations immunitaires au CP. Enfin, ce protocole peut faire partie d’un protocole de tri cellulaire, où les sous-types de cellules sélectionnés sont triés à l’aide de FACS pour l’analyse avec des méthodes moléculaires, telles que scRNA-seq ou analyse d’ARN en vrac.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions l’Institut Pasteur Animalerie Centrale et les membres de l’établissement CB-UTechS pour leur aide. Ces travaux ont été soutenus financièrement par l’Institut Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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