Summary
Questo studio utilizza la citometria a flusso e due diverse strategie di gating su plessi coroidi cerebrali di topi perfusi isolati; questo protocollo identifica i principali sottoinsiemi di cellule immunitarie che popolano questa struttura cerebrale.
Abstract
Il cervello non è più considerato come un organo che funziona in isolamento; l'accumulo di prove suggerisce che i cambiamenti nel sistema immunitario periferico possono indirettamente modellare la funzione cerebrale. All'interfaccia tra il cervello e la circolazione sistemica, i plessi coroidi (CP), che costituiscono la barriera del liquido emato-cerebrospinale, sono stati evidenziati come un sito chiave della comunicazione periferia-cervello. I CP producono il liquido cerebrospinale, i fattori neurotrofici e le molecole di segnalazione che possono modellare l'omeostasi cerebrale. CP sono anche una nicchia immunologica attiva. In contrasto con il parenchima cerebrale, che è popolato principalmente da microglia in condizioni fisiologiche, l'eterogeneità delle cellule immunitarie CP ricapitola la diversità che si trova in altri organi periferici. La diversità e l'attività delle cellule immunitarie CP cambiano con l'invecchiamento, lo stress e la malattia e modulano l'attività dell'epitelio CP, modellando così indirettamente la funzione cerebrale. L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare la CP murina e identificare circa il 90% dei principali sottoinsiemi immunitari che li popolano. Questo metodo è uno strumento per caratterizzare le cellule immunitarie CP e comprendere la loro funzione nell'orchestrare la comunicazione periferia-cervello. Il protocollo proposto può aiutare a decifrare come le cellule immunitarie CP modulano indirettamente la funzione cerebrale in salute e in varie condizioni di malattia.
Introduction
Dalla scoperta della barriera emato-encefalica da parte di Paul Erhlich alla fine del 19 ° secolo, il cervello è stato considerato praticamente separato dagli altri organi e dal flusso sanguigno. Tuttavia, quest'ultimo decennio ha visto l'emergere del concetto che la funzione cerebrale è modellata da vari fattori biologici, come il microbiota intestinale e le cellule immunitarie sistemiche e i segnali1,2,3,4. Parallelamente, altri confini cerebrali come meningi e plessi coroidi (CP) sono stati identificati come interfacce di cross talk immuno-cerebrale attivo piuttosto che tessuti barriera inerti5,6,7,8.
I CP costituiscono la barriera del liquido emato-cerebrospinale, uno dei confini che separano il cervello e la periferia. Si trovano in ciascuno dei quattro ventricoli del cervello, cioè il terzo, il quarto e entrambi i ventricoli laterali, e sono adiacenti alle aree coinvolte nella neurogenesi come la zona subventricolare e la zona subgranulare dell'ippocampo3. Strutturalmente, i CP sono composti da una rete di capillari sanguigni fenestrati racchiusi da un monostrato di cellule epiteliali, che sono interconnesse da giunzioni strette e aderenti9,10. I principali ruoli fisiologici dell'epitelio CP coinvolgono la produzione di liquido cerebrospinale, che lava il cervello dai metaboliti di scarto e dagli aggregati proteici, e la produzione e il passaggio controllato sangue-cervello di varie molecole di segnalazione tra cui ormoni e fattori neurotrofici11,12,13. Le molecole secrete dalla CP modellano l'attività del cervello, cioè modulando la neurogenesi e la funzione microgliale14,15,16,17,18,19, il che rende la CP cruciale per l'omeostasi cerebrale. CP anche impegnarsi in varie attività immunitarie; mentre il principale tipo di cellule immunitarie nel parenchima cerebrale in condizioni non patologiche è la microglia, la diversità delle popolazioni di cellule immunitarie CP è ampia quanto negli organi periferici3,7, suggerendo che vari canali di regolazione immunitaria e segnalazione sono all'opera al CP.
Lo spazio tra le cellule endoteliali ed epiteliali, lo stroma CP, è popolato principalmente da macrofagi associati al bordo (BAM), che esprimono citochine pro-infiammatorie e molecole correlate alla presentazione dell'antigene in risposta ai segnali infiammatori3. Un altro sottotipo di macrofagi, le cellule epiplexus di Kolmer, sono presenti sulla superficie apicale dell'epitelio CP20. CP stroma è anche una nicchia per le cellule dendritiche, cellule B, mastociti, basofili, neutrofili, cellule linfoidi innate e cellule T che sono per lo più cellule T di memoria effettrici in grado di riconoscere gli antigeni del sistema nervoso centrale7,21,22,23,24. Inoltre, la composizione e l'attività delle popolazioni di cellule immunitarie al CP cambiano in caso di perturbazione sistemica o cerebrale, ad esempio durante l'invecchiamento10,14,15,21,25, la perturbazione del microbiota7, lo stress26 e la malattia27,28. In particolare, questi cambiamenti sono stati suggeriti per modellare indirettamente la funzione cerebrale, cioè uno spostamento delle cellule T CP CD4 + verso l'infiammazione Th2 si verifica nell'invecchiamento cerebrale e innesca la segnalazione immunitaria dal CP che può modellare il declino cognitivo associato all'invecchiamento14,15,21,25,29 . Illuminare le proprietà delle cellule immunitarie CP sarebbe quindi cruciale per comprendere meglio la loro funzione regolatrice sulla fisiologia e la secrezione dell'epitelio CP e quindi decifrare il loro impatto indiretto sulla funzione cerebrale in condizioni di salute e malattia.
I CP sono piccole strutture che contengono solo poche cellule immunitarie. Il loro isolamento richiede la microdissezione dopo una fase preliminare di perfusione; le cellule immunitarie nel flusso sanguigno costituirebbero altrimenti i principali contaminanti. Questo protocollo mira a caratterizzare i sottoinsiemi mieloidi e di cellule T del CP utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo identifica circa il 90% delle popolazioni di cellule immunitarie che compongono cp di topo in condizioni non infiammatorie, in conformità con lavori pubblicati di recente che utilizzano altri metodi per sezionare l'eterogeneità della CP immunitaria7,10,28. Questo protocollo potrebbe essere applicato per caratterizzare i cambiamenti nel compartimento delle cellule immunitarie CP con malattia e altri paradigmi sperimentali in vivo.
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Protocol
Tutte le procedure concordate con le linee guida della Commissione Europea per la manipolazione degli animali da laboratorio, direttiva 86/609/CEE. Sono stati approvati dai comitati etici n. 59, dal CETEA/CEEA n. 089, con il numero dap210067 e APAFIS #32382-2021070917055505 v1.
1. Preparazione dei materiali
- Conservare tutti gli anticorpi (Tabella dei materiali) a 4 °C, al riparo dall'esposizione alla luce.
- Soluzione madre DAPI (1 mg/mL): sospendere la polvere in PBS-/- (Table of Materials), aliquota e conservare a -20 °C.
- Soluzione di lavoro DAPI (0,1 mg/ml): Soluzione madre DAPI diluita con PBS-/- in un rapporto di 1:10.
- Tampone MACS (Magnetic-activated cell sorting): preparare 2 mM di acido tetraacetico etilene diammina (EDTA) e albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA) (Tabella dei materiali) in PBS-/-.
- Collagenasi IV soluzione madre (20 U/μL): sospendere la polvere in PBS+/+ (Tabella dei materiali), aliquota e conservare a -20 °C.
NOTA: La collagenasi IV richiede Che MgCl2 sia completamente attivo; non congelare-scongelare la soluzione di collagenasi IV. - Soluzione anestetico-analgesica: mescolare 150 μL di ketamina (150 mg/kg), 25 μl di xilazina (5 mg/kg) e 330 μl di buprecare (0,1 mg/kg) in 1 mL di PBS-/-.
NOTA: Preparare la soluzione anestetico-analgesica in modo estemporaneo e non conservarla più a lungo di un giorno. - Soluzione di eparina (100 U/mL): sospendere la polvere in PBS-/-.
- Preparare il sistema di inset per infusione che collega un tubo a un decanter Erlenmeyer riempito con PBS-/-. Collegare un ago da 23 G all'estremità della provetta di infusione. Aprire l'inserto dell'infusione e lasciare scorrere il PBS fino a quando non ci sono bolle nel tubo.
- Preparare la lente binoculare dotata di una luce.
2. Alloggiamento di topi C57BL/6
- Per l'analisi delle cellule mieloidi o T CP, utilizzare quattro topi per ciascuno e raggruppare i quattro CP (due da ciascun ventricolo laterale, il terzo ventricolo e il quarto ventricolo CP; per otto topi in totale). Non mettere in comune CP comporta il rischio di non riuscire a rilevare le rare popolazioni immunitarie in CP a causa della loro bassa abbondanza.
- Lascia che i topi si acclimatino per almeno 7 giorni prima di qualsiasi sperimentazione. Mantenere i topi in condizioni prive di agenti patogeni a temperatura e umidità costanti, in un ciclo luce/buio di 12/12 ore o 14/10 h, con acqua e pellet standard ad libitum.
3. Perfusione PBS e dissezione cerebrale
- Pesare ogni topo e iniettare 10 μL/g della soluzione di miscela anestetico-analgesica (fase 1.6) per via intraperitoneale.
- Attendere circa 30 minuti per un'analgesia efficiente (controllare la profondità dell'anestesia pizzicando le cifre del mouse).
- Posizionare il mouse anestetizzato piatto sulla schiena, sul supporto di dissezione e fissare i palmi delle mani al supporto di dissezione.
- Pizzicando la pelle dell'animale con una pinza e usando le forbici, apri l'addome, il diaframma e il torace per esporre il cuore.
NOTA: Quando il torace viene aperto, il cervello diventa anossico. Si deve procedere con precisione e rapidità attraverso i prossimi passi della perfusione. - Iniettare 20 μL di 100 U/mL di soluzione di eparina direttamente nel ventricolo sinistro.
- Con le forbici fini, fare un'incisione di almeno 3 mm nell'atrio destro per consentire al sangue di fluire fuori dal corpo.
- Subito dopo, inserire l'ago da 23 G posto all'estremità del tubo di infusione attraverso la punta del ventricolo sinistro.
- Aprire il sistema di infusione al massimo e attendere la perfusione completa: utilizzando un ago da 23 G, ad una portata di circa 6 ml / min, la perfusione è completa in 3 minuti.
NOTA: Lo scolorimento uniforme di organi come il fegato attesta l'efficacia della perfusione. - Chiudere il sistema di infusione e rimuovere l'ago dal ventricolo cardiaco.
- Rimuovere il nastro dai palmi delle mani del mouse. Posizionare il mouse in posizione ventrale.
- Pizzicando la pelle dell'animale con una pinza e usando le forbici, rimuovere la pelle della parte superiore della testa dagli occhi alle orecchie.
- Con l'aiuto delle forbici, tagliare il cranio prima tra gli occhi e poi lateralmente da ciascun occhio al midollo spinale appena sopra i muscoli masseteri. Per questo, utilizzare l'estremità delle forbici e procedere delicatamente per evitare di danneggiare il cervello con le forbici.
- Apri il cranio con una pinza pizzicandolo dall'estremità tra gli occhi.
- Usa le forbici per tagliare il midollo spinale ed estrarre il cervello con una pinza, posizionando i loro due punti sul lato laterale del cervello per inclinarlo e metterlo in una capsula di Petri piena di PBS + / + ghiacciato. I CP vengono quindi immediatamente raccolti.
NOTA: Controllare la presenza di scolorimento del cervello per verificare l'efficacia della perfusione.
4. Dissezione del plesso coroideo dal cervello
- Posizionare il lato dorsale del cervello verso l'alto nella capsula di Petri e sotto gli obiettivi delle lenti binoculari.
- Con l'aiuto di una pinza per mantenere il cervello in posizione, inserisci le due estremità di un'altra pinza verso il basso attraverso la linea mediana tra gli emisferi.
- Usa la pinza per tirare la corteccia con il calloso e l'ippocampo lontano dal setto, esponendo il ventricolo laterale e una parte del terzo ventricolo.
- Identificare il CP laterale come un lungo velo che riveste il ventricolo laterale che si sta infiammando ad entrambe le estremità. Usa le due estremità di una pinza sottile per catturare il CP laterale. Fai attenzione a raccogliere la parte posteriore triangolare che potrebbe essere nascosta dalla piega posteriore dell'ippocampo.
- Allontanare la corteccia con il corpo calloso e l'ippocampo dell'emisfero controlaterale dal setto per esporre l'intero terzo ventricolo e il ventricolo laterale opposto.
- Raccogliere con pinza fine il terzo CP, che può essere identificato come una struttura corta con un aspetto superficiale granulare.
- Raccogli l'altro CP laterale.
- Inserire le due estremità di una pinza verso il basso tra il cervelletto e il mesencefalo. Staccare il cervelletto dal ponte e dal midollo per esporre il quarto ventricolo.
- Identificare il quarto CP come una lunga struttura globulare con un aspetto superficiale granulare che riveste il quarto ventricolo dall'estremità laterale destra all'estremità sinistra tra il cervelletto e il midollo. Raccogli il quarto CP con una pinza fine.
NOTA: il rivestimento a base silana della pinza può prevenire la viscosità del CP sulla pinza. - Ripetere i passaggi 3.1-4.9 per ciascuno degli altri sette mouse. Nel frattempo, il CP raccolto può essere conservato temporalmente in un tubo posto sul ghiaccio.
5. Preparazione di campioni per l'analisi citometrica a flusso
- Riempire il tubo contenente tutti i CP sezionati a 750 μL di PBS+/+.
NOTA: La deposizione di CP sezionato con pinze sottili nel tubo porta un piccolo volume di PBS +/ +. Piuttosto completare il volume esistente a 750 μL piuttosto che rimuoverlo e sostituirlo con 750 μL freschi di PBS+/+ per evitare una possibile perdita del tessuto CP. - Aggiungere 15 μL di soluzione madre di collagenasi IV da 20 U/μL (vedere fase 1.5) per una concentrazione finale di 400 U/mL.
NOTA: la DNAse I (150 μg/mL) può prevenire un eccessivo aggregazione cellulare. - Incubare CP con Collagenasi IV a 37 °C in lieve agitazione (300 RPM) per 45 min.
- Pipettare delicatamente su e giù circa 10 volte per finalizzare la dissociazione CP.
- Riempire il tubo CP a 1,5 ml con tampone MACS (vedere la ricetta passo 1.4) per interrompere l'attività della collagenasi IV.
NOTA: L'attività della collagenasi IV viene interrotta a bassa temperatura e inibita dall'albumina sierica. - Centrifugare le celle a 500 x g, per 5 min, a 4 °C. Scartare il surnatante e lavare le cellule con 1,5 ml di tampone MACS.
- Centrifugare le celle a 500 x g per 5 min, a 4 °C. Scartare le cellule surnanti e risospese in 220 μL di tampone MACS.
- Separare un'aliquota di 10 μL dalla sospensione cellulare da utilizzare come controllo non macchiato (fase successiva 5.18).
- Separare un'aliquota di 10 μL dalla sospensione cellulare da utilizzare come controllo DAPI-monomacchia (fase successiva 5.12).
- Preincubato i restanti 200 μL con anticorpo bloccante cd16/CD32 anti-topo (1:100) per 20 min, a 4 °C, per bloccare interazioni non specifiche mediate da Fc.
- Dividere le cellule in due tubi da 100 μL (uno per l'analisi delle cellule mieloidi, l'altro per l'analisi delle cellule T) (fase successiva 5.14).
- Prelevare il campione con 10 μL di celle per il controllo DAPI-mono-macchiato (passo 5.9) e riempirlo fino a 100 μL con tampone MACS (passaggio successivo 5.14).
- Preparare undici nuovi tubi contenenti 100 μL di MACS per i controlli monocolorati con anticorpi (fase 5.14.4) e completamente colorati (punto 5.14.5) e aggiungere una goccia di perline di compensazione in ciascuno.
NOTA: I controlli di compensazione consentiranno di impostare la tensione del laser di rilevamento fluorescente e valutare il potenziale rilevamento del segnale non specifico del colorante fluorescente negli altri canali che saranno ulteriormente compensati. - Incubazione anticorpale dei campioni:
- Campione mieloide: aggiungere 0,1 mg/mL DAPI (1:100) (vedere passaggio 1.3), FITC anti-mouse CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b (1:100), APC anti-mouse CX3CR1 (1:100), BV711 anti-mouse Ly6C (1:100), PE anti-mouse F4/80 (1:100) e APC-Cy7 anti-mouse IA-IE (1:100).
- Campione di cellule T: aggiungere 0,1 mg/mL DAPI (1:100), FITC anti-mouse CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b (1:100), APC anti-mouse TCRβ (1:100), PE anti-mouse CD8a (1:100) e APC-Cy7 anti-mouse CD4 (1:50).
- Controllo DAPI-monomacchiato (dal passaggio 5.12): aggiungere 0,1 mg/mL DAPI (1:100).
- Perle di compensazione mono-colorate di anticorpi: aggiungere ciascuno dei nove anticorpi precedentemente utilizzati per campioni di mieloidi e cellule T (stessa diluizione), separatamente (uno per ogni tubo) ai nove tubi contenenti le perline.
NOTA: I controlli di compensazione monomacchiati consentiranno la determinazione dei picchi positivi di fluorescenza per ciascuno dei marcatori fluorescenti utilizzati durante la fase di compensazione. L'analizzatore li confronterà con il segnale negativo osservato nelle celle CP di controllo non macchiate. - Perle di compensazione completamente colorate di anticorpi: aggiungi tutti gli anticorpi utilizzati per la colorazione mieloide a un tubo e quelli usati per la colorazione delle cellule T a un altro.
NOTA: i controlli di compensazione completamente macchiati consentiranno di impostare la tensione di ciascun rilevamento laser fluorescente e valutare il potenziale rilevamento del segnale non specifico del colorante fluorescente negli altri canali. - Incubare per 30-45 minuti su ghiaccio, al riparo dall'esposizione alla luce.
- Riempire tutti i tubi fino a 1,5 ml con buffer MACS. Centrifugare le celle e le perle di compensazione a 500 x g, per 5 min, a 4 °C.
- Scartare il surnatante e lavare le cellule e le perle di compensazione in 1,5 ml di tampone MACS.
- Centrifugare le celle e le perle di compensazione a 500 x g, per 5 min, a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Risospesso le celle e le perle di compensazione in 500 μL di buffer MACS. Riempire il controllo non macchiato (passaggio 5.8) fino a 500 μL con buffer MACS.
- Filtrare ogni tubo con celle CP attraverso un filtro da 70 μm (CP non macchiato, controllo monomacchia DAPI e campioni di cellule mieloidi e T).
6. Citometria a flusso
NOTA: Il citometro a flusso utilizzato in questo protocollo è dotato dei seguenti 5 laser: un laser UV da 355 nm, un laser viola da 405 nm, un laser blu da 488 nm, un laser giallo-verde da 561 nm e un laser rosso da 637 nm.
- Eseguire i controlli di qualità giornalieri sul citometro utilizzando la configurazione del citometro, l'interfaccia di tracciamento (CST) e le perle di controllo CST per garantire la coerenza tra le analisi, la qualità dello strumento e le intensità di fluorescenza target coerenti.
- Per impostare l'esperimento di citometria a flusso, creare un nuovo esperimento con grafici e istogrammi bivariati. Garantire l'inclusione di grafici FSC-A (Forward Scatter Area) e SSC-A (Side Scatter Area) e SSC-A (Side Scatter Area) e grafici a istogramma per ciascun colore per monitorare l'acquisizione.
- Definire la morfologia cellulare impostando la tensione PMT per i parametri FSC-A e SSC-A su celle CP di controllo non macchiate.
- Definire le tensioni di ciascun marcatore fluorescente impostando i picchi negativi dei fluorocromi sulle celle CP di controllo non macchiate e i picchi positivi dei fluorocromi utilizzando perline di compensazione colorate con tutti gli anticorpi e assicurando che i segnali del rivelatore non siano fuori scala e non siano troppo fortemente incrociati in altri canali.
- Creare una matrice di compensazione per analizzare ciascuno dei controlli di compensazione a colore singolo. Dopo aver provato le popolazioni FSC-A/SSC-A appropriate, controllare i controlli a macchia singola sui grafici dell'istogramma e registrare i controlli di compensazione. Dopo aver registrato tutti i campioni a macchia singola, calcolare la matrice di compensazione.
- Registrare tutti gli eventi rilevati sia per le popolazioni mieloidi che per quelle di cellule T.
7. Cellule mieloidi CP gating
- Selezionare FSC-A rispetto a SSC-A e gate per le celle (in base alle dimensioni).
- Creare un gate figlio per celle singole con FSC-A e altezza di dispersione in avanti (FSC-H).
- Creare un gate figlio per le celle vive con DAPI e FSC-A per escludere le celle DAPI+.
- Crea un cancello figlio per le cellule immunitarie CD45 + con CD45 vs FSC-A.
- Creare un gate figlio dalle celle CD45+ e selezionare CD11b vs F4/80, identificare i seguenti due gruppi: le popolazioni CD11b+ F4/80+ e CD11b+ F4/80- (passaggio successivo 7.8).
- Creare un gate figlio per le celle CD11b+ F4/80+ e selezionare CX3CR1 e IA-IE. Identificare sia CX3CR1+ IA-IE+ BAM che sono ulteriormente denominati come CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM, sia CX3CR1+ IA-IE- macrofagi.
- Creare un gate figlio per i macrofagi CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- e selezionare F4/80 vs CD11b. Identificare sia l'intermediato CD11bhigh F4/80 che il CD11b+ F4/80high popolazioni che sono ulteriormente chiamate CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer's epiplexus macrophages e CD11b+ F4/80high CX3 CR1+ IA-IE- BAM, rispettivamente.
NOTA: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- e CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- le celle sono apparse un po' mescolate tra i livelli F4/80intermediate-F4/80high e CD11bhigh-CD11b+. - Dalla popolazione CD11b+ F4/80- (passo 7.5), gate per Ly6C vs. IA-IE. Selezionare sia la popolazione IA-IE+ Ly6C- che le cellule IA-IE- Ly6C+ che corrispondono principalmente a monociti/neutrofili.
NOTA: Un'elevata presenza di cellule IA-IE- Ly6C+ probabilmente riflette problemi nell'efficacia della perfusione di animali senza una condizione infiammatoria; la loro abbondanza dovrebbe essere bassa. - Creare un gate figlio per la popolazione CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- e selezionare CD11b vs CX3CR1, identificare entrambe le popolazioni CD11bhigh CX3CR1low e CD11b+ CX3CR1-.
8. Gating delle cellule T CP
- Selezionare FSC-A rispetto a SSC-A e gate per le celle (in base alle dimensioni).
- Creare un gate figlio per celle singole con FSC-A e altezza di dispersione in avanti (FSC-H).
- Creare un gate figlio per le celle vive con DAPI e FSC-A per escludere le celle DAPI+.
- Crea un cancello figlio per le cellule immunitarie CD45 + con CD45 vs FSC-A.
- Creare un gate figlio dalle celle CD45+ e selezionare TCRβ vs. CD11b. Escludere le cellule mieloidi CD11b+ e selezionare la popolazione di cellule TCRβ+ CD11b-T.
- Creare un gate figlio per la popolazione TCRβ+ CD11b- e selezionare CD4 vs. CD8a. Identificare sia le cellule T CD8- CD4+ che le cellule T CD8+ CD4-T.
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Representative Results
Le analisi di citometria a flusso qui presentate hanno rivelato con successo i principali sottoinsiemi di cellule mieloidi e T (Figura 1 e Figura 2, rispettivamente) e il loro numero totale relativo per topo in modo altamente riproducibile (Figura 3).
L'analisi della citometria a flusso delle cellule mieloidi ha mostrato che le CP sono popolate da CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM, che rappresentano quasi l'80% delle cellule immunitarie CD45+ al CP. Questi BAM sono stati divisi in due diverse popolazioni in base alla loro espressione di MHC-II: l'IA-IE+ BAM che costituiva il gruppo principale (72% delle cellule immunitarie CD45+), in linea con i dati precedentemente pubblicati7, e l'IA-IE-BAM. È stata identificata anche la popolazione CX3CR1+ IA-IE- intermediata cd11bhigh F4/80 dei macrofagi epiplexus di Kolmer7,2 e rappresentava solo circa l'1,2% delle cellule immunitarie CP CD45+, coerentemente con la letteratura7. Tra le cellule immunitarie CD11b+ F4/80-, sono state caratterizzate due diverse popolazioni di cellule Ly6C- IA-IE+ che probabilmente corrispondono alle cellule dendritiche e che possono essere suddivise in popolazioni CD11bhigh CX3CR1low e CD11b+ CX3CR1- che costituivano rispettivamente circa il 3,1% e il 3,7% delle cellule immunitarie CD45+ CP. La popolazione cellulare CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+, comprendente sia monociti che neutrofili, costituiva solo lo 0,5% delle cellule immunitarie CD45+ in conformità con i rapporti precedenti e attestando l'elevata efficacia della perfusione PBS3. Questi risultati sono in gran parte coerenti con i dati precedentemente pubblicati che valutano le popolazioni immunitarie CP mediante sequenziamento dell'RNA a singola cellula7.
L'analisi e la strategia di gating delle cellule T hanno evidenziato la presenza della popolazione minore di cellule CD45+ CD11b- TCRβ+. Tra questi, circa 30-50 cellule T CD8- CD4+ e CD8+ CD4- per topo hanno popolato CP in condizioni fisiologiche, rappresentando rispettivamente l'1,3% e lo 0,9% delle cellule immunitarie CP CD45+. Le cellule CD4+ erano leggermente più abbondanti delle cellule T CD8+, il che è coerente con i risultati precedenti sia in termini di numero che di proporzione21,30. Questa strategia di gating ha anche rivelato una popolazione di cellule CD45+ CD11b- TCRβ+ CD4- CD8-, che possono includere cellule NKT, e un sottoinsieme di cellule T regolatorie recentemente descritto10,28,31. L'analisi della citometria a flusso proposta e le strategie di gating hanno permesso l'annotazione del tipo cellulare di quasi il 90% delle cellule immunitarie (CD45+) che compongono il CP del topo.
Figura 1: Analisi della citometria a flusso e strategia di gating di cellule mieloidi da CP di topi perfusi. Le celle sono chiuse in base alle dimensioni utilizzando FSC-A vs SSC-A. Le celle singoletto vengono selezionate utilizzando FSC-A rispetto a FSC-H. Le cellule vive sono chiuse escludendo le celle DAPI+ sul grafico DAPI vs. FSC-A. Le cellule immunitarie CD45+ vengono quindi identificate su un grafico CD45 vs FSC-A. Gating CD11b vs. F4/80, le popolazioni CD11b+ F4/80+ e CD11b+ F4/80- sono selezionate. Gating CD11b+ F4/80+ popolazione utilizzando CX3CR1 vs. IA-IE, vengono determinate sia le popolazioni CD11b+ F4/80hi CX3CR1+ IA-IE+ BAM che le popolazioni CX3CR1+ IA-IE-. Quest'ultima popolazione viene quindi recintata utilizzando F4/80 vs CD11b per separare meglio CD11b + F4 / 80high CX3CR1 + IA-IE- BAM e CD11bhigh F4 / 80intermediare CX3CR1 + IA-IE- Kolmer epiplexus macrophages. Vengono selezionate le cellule Gating Ly6C vs. IA-IE su CD11b+ F4/80-, sia CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ che corrispondono principalmente a monociti e neutrofili che CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- cellule che probabilmente rappresentano la popolazione di cellule dendritiche. Le celle CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- sono gated utilizzando CD11b vs CX3CR1 consentendo l'identificazione delle celle CD11bhigh CX3CR1low e CD11b+ CX3CR1-. Se non specificato, i valori al di sotto di ogni popolazione gated rappresentano la frequenza della popolazione madre. ciao: alto; int: intermedio; lo: basso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi della citometria a flusso e strategia di gating di cellule T da CP di topi perfusi. Le celle sono chiuse in base alle dimensioni utilizzando FSC-A vs SSC-A. Le celle singole vengono selezionate utilizzando FSC-A rispetto a FSC-H. Le cellule vive sono identificate escludendo le cellule DAPI+ sul grafico DAPI vs. FSC-A. Le cellule immunitarie CD45 + vengono quindi chiuse su un grafico CD45 vs FSC-A. Gating CD11b vs TCRβ, CD11b- TCRβ+ sono selezionati. Gating CD4 vs. CD8, vengono determinate le proporzioni delle cellule T CD8-CD4+ e CD4-CD8+. Se non specificato, i valori al di sotto di ogni popolazione gated rappresentano la frequenza della popolazione madre. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Numeri dei principali sottoinsiemi di cellule immunitarie al CP per topo. Media del numero totale di cellule per topo dei diversi sottoinsiemi immunitari identificati nei quattro CP raggruppati insieme. Rappresentazione: Media + deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli studi volti a comprendere i contributi immunologici all'omeostasi cerebrale e alla malattia si sono concentrati principalmente sulle cellule che risiedono all'interno del parenchima cerebrale, trascurando i confini cerebrali come la CP, che sono tuttavia contributi cruciali alla funzione cerebrale2,3. L'analisi delle popolazioni di cellule immunitarie a CP è difficile a causa delle piccole dimensioni di CP, del basso numero di cellule immunitarie residenti e del complicato accesso a questo tessuto. La citometria a flusso eseguita su cellule immunitarie cerebrali totali (CD45+) non consente la caratterizzazione delle rare popolazioni immunitarie che risiedono nella CP. Per caratterizzare la composizione immunitaria del CP con elevata precisione, sono state condotte analisi citometriche a flusso su CP sezionate da topi perfusi PBS. Questo approccio consente l'esclusione delle cellule CD45+ circolanti e delle cellule CP CD45- come periciti, cellule endoteliali ed epiteliali32. Le strategie di gating incentrate sulle popolazioni mieloidi e di cellule T identificano i principali sottoinsiemi immunitari CP.
Un passo critico del protocollo attuale è la perfusione PBS. Poiché le cellule immunitarie CP sono rare, la contaminazione del sangue potrebbe mascherare completamente la loro eterogeneità locale. Lo scolorimento del fegato e del cervello viene sempre controllato come controllo e quindi la contaminazione del sangue è minima. Coerentemente, CD11b+ F4/80- Ly6C+, che comprende sia monociti che neutrofili presenti nel sangue piuttosto che nel cervello in condizioni non infiammatorie3, ha rappresentato solo lo 0,5% delle cellule CD45+ , dimostrando un'elevata efficacia della perfusione PBS. Un altro controllo utile per l'efficacia della perfusione PBS potrebbe essere l'incorporazione di anticorpi contro Ter119, un marcatore specifico per gli eritrociti. Infine, un'ulteriore analisi della CP da sezioni cerebrali di topo perfuse PBS mediante immunocolorazione e microscopia può anche essere utile per verificare se eventuali cellule immunitarie del sangue che possono essere fortemente aderenti all'endotelio hanno resistito alla perfusione PBS e rimangono attaccate al lume della vascolarizzazione.
La strategia di gating mieloide ha rivelato due popolazioni di macrofagi: CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+/-BAM e CD11b+ F4/80intermediano le cellule epiplexus di CX3CR1+ IA-IE- Kolmer, che esprimono alti livelli di CD11b e bassi livelli di F4/807. Le porte delle celle epiplexus di Kolmer7,20 e IA-IE-BAM non erano chiaramente separate usando marcatori CD11b e F4/80. L'incorporazione del marcatore CD206 in questa strategia di gating può aiutare a differenziare meglio CD206+ IA-IE-BAM dalle cellule epiplexus di CD206low Kolmer7.
Quasi il 7% delle cellule immunitarie CP sembrava essere CD11b + F4 / 80- Ly6C- IA-IE +. Questo sottogruppo era composto da due popolazioni in base ai loro livelli di espressione di CD11b e CX3CR1. Queste cellule probabilmente corrispondono alle cellule dendritiche, ma questo rimane da confermare analizzando la loro espressione CD11c tramite FACS3 o immunofluorescenza33. La popolazione CD11b+ F4/80- Ly6C- IA-IE+ probabilmente include anche mastociti. Incorporare anticorpi per il rilevamento di CD117 e c-kit nella strategia di gating aiuterebbe a distinguerli dalle cellule dendritiche CD11c+3,34. È stata determinata la proporzione di cellule CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ tra le cellule immunitarie CP. Tuttavia, includono sia monociti che neutrofili e l'aggiunta del marcatore Ly6G alla strategia di gating delle cellule CD45 + CD11b + F4 / 80 + Ly6C + determinerebbe il rapporto tra monociti Ly6G e neutrofili Ly6G +. Oltre alla popolazione CD45+ CD11b-TCRβ+ descritta, la strategia di gating sulle popolazioni CD45+ CD11b- può essere arricchita utilizzando marcatori NK1.1 e CD11c per identificare le cellule NK, TCRγδ per analizzare le cellule T γδ, CD19 e/o B220 per caratterizzare le cellule B e CD138 per identificare le plasmacellule3. Anche l'espressione di geni reporter può essere inclusa in questa analisi. Ad esempio, l'utilizzo di topi transgenici Foxp3-GFP potrebbe essere utile per identificare le cellule T regolatorie (Treg) residenti in CP3,30. Infine, questo protocollo può anche incorporare la colorazione intracellulare di fattori di trascrizione o citochine21.
Mentre le cellule immunitarie del parenchima cerebrale sono state ampiamente studiate, molto meno si sa sulle cellule immunitarie che popolano le barriere cerebrali, come il CP3,35,36. I CP nei topi sono piccoli tessuti situati in quattro diverse aree del cervello e il loro isolamento richiede una microdissezione piuttosto complessa. Per questo motivo, i CP sono stati per lo più studiati utilizzando l'imaging. La colorazione delle cellule immunitarie CP dall'intero tessuto sezionato CP o da sezioni cerebrali seguita da analisi microscopiche ha fornito importanti progressi nella comprensione dei meccanismi immunitari CP14,15,21,22,26,27,29,30,33 . Tuttavia, questo metodo non consente un'analisi approfondita della diversità delle cellule immunitarie CP in quanto è possibile analizzare solo da quattro a sei marcatori alla volta. Inoltre, alcune sottopopolazioni come le cellule T CD4 + o CD8 + sono piuttosto rare al CP e l'analisi quantitativa dei loro fenotipi con la microscopia sarebbe impegnativa. L'approccio della citometria a flusso consente l'analisi di decine di marcatori in parallelo per ogni cellula immunitaria, fornendo uno strumento più adatto per la valutazione quantitativa della composizione immunitaria CP.
Più recentemente, la tecnologia trascrittomica a nuclei singoli (snRNA-seq) è risultata un metodo potente per studiare l'eterogeneità CP10,28. Tuttavia, non è adatto per analizzare le cellule immunitarie CP in quanto costituiscono solo una piccola frazione delle cellule CP. Poiché snRNA-seq campiona le cellule nella proporzione in cui sono presenti nel tessuto, le cellule immunitarie sono sottorappresentate nello snRNA-seq e il loro basso numero rappresenta un ostacolo per l'analisi approfondita10,28.
La trascrittomica a singola cellula (scRNA-seq) è stata recentemente applicata per mappare con precisione l'eterogeneità delle cellule immunitarie delle cellule immunitarie CP isolate7. Mentre scRNA-seq è piuttosto complesso e costoso da eseguire, la citometria a flusso può servire come un modo più accessibile per esaminare le sottopopolazioni immunitarie presso il CP. Infine, questo protocollo può servire come parte di un protocollo di selezione cellulare, in cui i sottotipi selezionati di cellule vengono ordinati utilizzando FACS per l'analisi con metodi molecolari, come scRNA-seq o analisi di RNA di massa.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo l'Institut Pasteur Animalerie Centrale e i membri della struttura CB-UTechS per il loro aiuto. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dall'Institut Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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