Summary
В этом исследовании используется проточная цитометрия и две различные стратегии гатинга на изолированных перфузированных оболочках мозга мышей; этот протокол идентифицирует основные подмножества иммунных клеток, которые заполняют эту структуру мозга.
Abstract
Мозг больше не рассматривается как орган, функционирующий изолированно; Накопленные данные свидетельствуют о том, что изменения в периферической иммунной системе могут косвенно влиять на функцию мозга. На границе между мозгом и системным кровообращением сосудисто-мозговые сплетения (CP), которые составляют барьер гематоэнцефалической жидкости, были выделены в качестве ключевого места коммуникации периферии с мозгом. CP продуцирует спинномозговую жидкость, нейротрофические факторы и сигнальные молекулы, которые могут формировать гомеостаз мозга. ХП также являются активной иммунологической нишей. В отличие от паренхимы головного мозга, которая в физиологических условиях заселяется в основном микроглией, гетерогенность иммунных клеток CP повторяет разнообразие, обнаруженное в других периферических органах. Разнообразие и активность иммунных клеток CP изменяются со старением, стрессом и болезнями и модулируют активность эпителия CP, тем самым косвенно формируя функцию мозга. Целью этого протокола является выделение мышиного ДЦП и идентификация около 90% основных иммунных подмножеств, которые их населяют. Этот метод является инструментом для характеристики иммунных клеток CP и понимания их функции в организации коммуникации периферии с мозгом. Предлагаемый протокол может помочь расшифровать, как иммунные клетки CP косвенно модулируют функцию мозга в здоровье и при различных заболеваниях.
Introduction
С момента открытия гематоэнцефалического барьера Полом Эрлихом в конце 19-го века мозг считался практически отделенным от других органов и кровотока. Тем не менее, в последнее десятилетие появилась концепция о том, что функция мозга формируется различными биологическими факторами, такими как микробиота кишечника и системные иммунные клетки и сигналы1,2,3,4. Параллельно другие границы мозга, такие как мозговые оболочки и сосудисто-сросшиеся соединения (CP), были идентифицированы как интерфейсы активного перекрестного разговора между иммунитетом и мозгом, а не инертные барьерные ткани5,6,7,8.
ДЦП составляют гематоэнцефалический барьер жидкости, одну из границ, разделяющих мозг и периферию. Они расположены в каждом из четырех желудочков головного мозга, то есть в третьем, четвертом и обоих боковых желудочках, и примыкают к областям, участвующим в нейрогенезе, таким как субвентрикулярная зона и субгранулярная зона гиппокампа3. Структурно ХП состоят из сети фенестрированных кровеносных капилляров, заключенных монослоем эпителиальных клеток, которые соединены между собой плотными и адгезионными соединениями9,10. Основные физиологические роли эпителия CP включают производство спинномозговой жидкости, которая смывает мозг из отходов метаболитов и белковых агрегатов, а также производство и контролируемое прохождение кровью в мозг различных сигнальных молекул, включая гормоны и нейротрофические факторы11,12,13. Секретируемые молекулы из CP формируют активность мозга, то есть модулируя нейрогенез и функцию микроглии14,15,16,17,18,19, что делает CP критически важным для гомеостаза мозга. ХП также участвуют в различных иммунных действиях; в то время как основным типом иммунных клеток в паренхиме головного мозга при непатологических состояниях является микроглия, разнообразие популяций иммунных клеток CP столь же широко, как и в периферических органах3,7, что позволяет предположить, что на ДЦП работают различные каналы иммунной регуляции и передачи сигналов.
Пространство между эндотелиальными и эпителиальными клетками, строма CP, в основном заполнено погранично-ассоциированными макрофагами (BAM), которые экспрессируют провоспалительные цитокины и молекулы, связанные с презентацией антигена в ответ на воспалительные сигналы3. Другой подтип макрофагов, эпиплексические клетки Колмера, присутствуют на апикальной поверхности CP epithelium20. CP stroma также является нишей для дендритных клеток, В-клеток, тучных клеток, базофилов, нейтрофилов, врожденных лимфоидных клеток и Т-клеток, которые в основном являются эффекторными Т-клетками памяти, способными распознавать антигены центральной нервной системы7,21,22,23,24. Кроме того, состав и активность популяций иммунных клеток при ДЦП изменяется при системном или мозговом возмущении, например, при старении 10,14,15,21,25, возмущении микробиоты7, стрессе26 и болезни27,28. Примечательно, что эти изменения были предложены для косвенного формирования функции мозга, то есть сдвиг CP CD4 + Т-клеток в сторону воспаления Th2 происходит при старении мозга и вызывает иммунную сигнализацию от CP, которая может формировать связанное со старением снижение когнитивных функций14,15,21,25,29 . Таким образом, освещение свойств иммунных клеток CP будет иметь решающее значение для лучшего понимания их регуляторной функции по физиологии и секреции эпителия CP и, таким образом, расшифровки их косвенного воздействия на функцию мозга в здоровых и болезнетворных условиях.
CP представляют собой небольшие структуры, которые содержат только несколько иммунных клеток. Их выделение требует микродиссекции после предварительного этапа перфузии; Иммунные клетки в кровотоке в противном случае представляли бы собой основные загрязняющие вещества. Этот протокол направлен на характеристику подмножеств миелоидных и Т-клеток CP с использованием проточной цитометрии. Этот метод идентифицирует около 90% популяций иммунных клеток, которые составляют ХП мышей при невоспалительных состояниях, в соответствии с недавно опубликованными работами с использованием других методов диссекции иммунной гетерогенности ДЦП7,10,28. Этот протокол может быть применен для характеристики изменений в компартменте иммунных клеток CP с заболеванием и другими экспериментальными парадигмами in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры согласованы с руководящими принципами Европейской комиссии по обращению с лабораторными животными, директивой 86/609/EEC. Они были одобрены этическими комитетами No 59, CETEA/CEEA No 089 под номером dap210067 и APAFIS #32382-2021070917055505 v1.
1. Подготовка материалов
- Хранить все антитела (Таблица материалов) при 4 °C, защищенные от воздействия света.
- Стандартный раствор DAPI (1 мг/мл): Повторно суспендировать порошок в PBS-/- (Таблица материалов), аликвоте и хранить при -20 °C.
- Рабочий раствор DAPI (0,1 мг/мл): Разбавить стандартный раствор DAPI PBS-/- в соотношении 1:10.
- Магнитно-активированный буфер сортировки клеток (MACS): Приготовьте 2 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Таблица материалов) в PBS-/-.
- Стандартный раствор коллагеназы IV (20 Ед/мкл): Повторно суспендировать порошок в PBS+/+ (Таблица материалов), аликвоте и хранить при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеназа IV требует, чтобы MgCl2 был полностью активным; не замораживать-размораживать раствор коллагеназы IV. - Анестетикно-анальгетический раствор: Смешайте 150 мкл кетамина (150 мг/кг), 25 мкл ксилазина (5 мг/кг) и 330 мкл бупрекара (0,1 мг/кг) в 1 мл PBS-/-.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор анестетика-анальгетика экстемпорально и не держите его дольше суток. - Раствор гепарина (100 Ед/мл): Повторно суспендировать порошок в PBS-/-.
- Подготовьте систему инфузионной вставки, соединяющую трубку с графином Erlenmeyer, заполненным PBS-/-. Подключите иглу 23 г к конечности инфузионной трубки. Откройте инфузионную вставку и дайте PBS работать, пока в трубке не останется пузырьков.
- Подготовьте бинокулярную лупу, оснащенную подсветкой.
2. Корпус мышей C57BL/6
- Для анализа миелоидных или Т-клеток CP используйте четырех мышей для каждой и объедините четыре CP (по две от каждого бокового желудочка, третий желудочек и четвертый желудочек CP; всего для восьми мышей). Отсутствие объединения CP несет риск неспособности обнаружить редкие иммунные популяции в CP из-за их низкого изобилия.
- Дайте мышам акклиматизироваться в течение как минимум 7 дней до любого эксперимента. Держите мышей в условиях, свободных от патогенов, при постоянной температуре и влажности, в цикле 12/12 ч или 14/10 ч света / темноты, с водой и стандартной гранулированной пищей ad libitum.
3. Перфузия PBS и рассечение мозга
- Массируйте каждую мышь и вводите 10 мкл/г раствора анестетикно-анальгетической смеси (стадия 1.6) внутрибрюшинно.
- Подождите около 30 минут для эффективного обезболивания (проверьте глубину анестезии, зажав пальцы мыши).
- Расположите обезболенную мышь на спине, на опоре для рассечения, и прикрепите ладони к опоре рассечения.
- Защемляя кожу животного щипцами и ножницами, вскройте живот, диафрагму и грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда грудная клетка открыта, мозг становится бескислородным. Нужно точно и быстро пройти через следующие этапы перфузии. - Вводят 20 мкл 100 Ед/мл раствора гепарина непосредственно в левый желудочек.
- Тонкими ножницами сделайте разрез не менее 3 мм в правом предсердии, чтобы кровь текла из тела.
- Сразу после этого вставьте иглу 23 Г, помещенную на оконечность инфузионной трубки через кончик левого желудочка.
- Откройте инфузионную систему на максимуме и дождитесь полной перфузии: используя иглу 23 г, при скорости потока около 6 мл / мин, перфузия завершается через 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Равномерное обесцвечивание органов, таких как печень, свидетельствует об эффективности перфузии. - Закройте инфузионную систему и извлеките иглу из сердечного желудочка.
- Снимите ленту с ладоней мыши. Поместите мышь в вентральное положение.
- Зажав кожу животного щипцами и ножницами, удалите кожу верхней части головы от глаз до ушей.
- С помощью ножниц прорежьте череп сначала между глазами, а затем латерально от каждого глаза до спинного мозга чуть выше мышц массажера. Для этого используйте конечность ножниц и действуйте осторожно, чтобы не повредить мозг ножницами.
- Откройте череп щипцами, зажав его от конечности между глазами.
- Используйте ножницы, чтобы разрезать спинной мозг и извлечь мозг щипцами, разместив их две точки на боковой стороне мозга, чтобы наклонить его и поместить в чашку Петри, наполненную ледяным PBS + / +. Затем CP немедленно собираются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте наличие обесцвечивания мозга, чтобы проверить эффективность перфузии.
4. Рассечение сосудистого сплетения из головного мозга
- Расположите спинную сторону мозга вверх в чашке Петри и ниже целей бинокулярных луп.
- С помощью щипцов для поддержания мозга на месте вставляют два конца другого щипца вниз через среднюю линию между полушариями.
- Используйте щипцы, чтобы оттянуть кору с мозолью и гиппокампом от перегородки, обнажая боковой желудочек и часть третьего желудочка.
- Определите боковой CP как длинную вуаль, выстилающую боковой желудочек, который вспыхивает на обоих концах. Используйте два конца тонких щипцов, чтобы поймать боковую ДЦП. Будьте осторожны, чтобы собрать треугольную заднюю часть, которая может быть скрыта задней складкой гиппокампа.
- Оттяните кору с мозолистым телом и гиппокампом контралатерального полушария подальше от перегородки, чтобы обнажить весь третий желудочек и противоположный боковой желудочек.
- Соберите тонкими щипцами третий ХП, который можно идентифицировать как короткую структуру с зернистым аспектом поверхности.
- Соберите другой боковой CP.
- Вставьте два конца щипца вниз между мозжечком и средним мозгом. Отделите мозжечок от понса и продолговатого мозга, чтобы обнажить четвертый желудочек.
- Определите четвертый CP как длинную шаровидную структуру с зернистым аспектом поверхности, который выстилает четвертый желудочек от бокового правого конца к левому концу между мозжечком и мозгом. Соберите четвертый КП тонкими щипцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Силановое покрытие щипцов может предотвратить липкость ХП на щипцах. - Повторите шаги 3.1-4.9 для каждой из семи других мышей. В то же время собранный КП можно хранить временно в трубке, помещенной на лед.
5. Подготовка образцов к анализу проточной цитометрии
- Заполните пробирку, содержащую весь рассеченный CP до 750 мкл PBS+/+.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осаждение рассеченного CP тонкими щипцами в трубке приносит небольшой объем PBS+/+. Скорее заполните существующий объем до 750 мкл, чем удалите и замените его свежими 750 мкл PBS+/+ , чтобы избежать возможной потери ткани CP. - Добавьте 15 мкл 20 Ед/мкл раствора коллагеназы IV (см. этап 1.5) для получения конечной концентрации 400 Ед/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: DNAse I (150 мкг/мл) может предотвратить чрезмерное слипание клеток. - Инкубировать CP с коллагеназой IV при 37 °C при мягком перемешивании (300 об/мин) в течение 45 мин.
- Осторожно пипетку вверх и вниз около 10 раз, чтобы завершить диссоциацию CP.
- Заполните cp-пробирку до 1,5 мл буфером MACS (см. этап рецепта 1.4), чтобы остановить активность коллагеназы IV.
ПРИМЕЧАНИЕ: Активность коллагеназы IV прекращается при низкой температуре и ингибируется сывороточным альбумином. - Центрифугировать ячейки при 500 х г, в течение 5 мин, при 4 °C. Выбросьте супернатант и промыть клетки 1,5 мл буфера MACS.
- Центрифугировать ячейки при 500 х г в течение 5 мин, при 4 °C. Отбросьте супернатантные и повторно суспендированные клетки в буфере MACS объемом 220 мкл.
- Отделить аликвоту в 10 мкл от клеточной суспензии, которая будет использоваться в качестве неиспорченного контроля (следующий этап 5.18).
- Отделить аликвоту в 10 мкл от клеточной суспензии, которая будет использоваться в качестве DAPI-моно-окрашенного контроля (следующий шаг 5.12).
- Преинкубируйте оставшиеся 200 мкл антимышечным CD16/CD32 блокирующим антителом (1:100) в течение 20 мин, при 4 °C, чтобы блокировать неспецифические Fc-опосредованные взаимодействия.
- Разделите клетки на две трубки по 100 мкл (одна для анализа миелоидных клеток, другая для анализа Т-клеток) (следующий шаг 5.14).
- Возьмите образец с 10 мкл клеток для DAPI-моно-окрашенного контроля (шаг 5.9) и заполните его до 100 мкл буфером MACS (следующий шаг 5.14).
- Подготовьте одиннадцать новых пробирок, содержащих 100 мкл MACS для антитела, моноокрашенного (этап 5.14.4) и полностью окрашенного контроля (этап 5.14.5), и добавьте каплю компенсационных шариков в каждую.
ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсационные элементы управления позволят установить напряжение флуоресцентного детекторного лазера и оценить потенциальный неспецифический сигнал обнаружения флуоресцентного красителя в других каналах, которые будут дополнительно компенсированы. - Инкубация образцов антителами:
- Миелоидный образец: Добавьте 0,1 мг/мл DAPI (1:100) (см. шаг 1.3), FITC против мыши CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 против мыши CD11b (1:100), APC против мыши CX3CR1 (1:100), BV711 против мыши Ly6C (1:100), PE анти-мышь F4/80 (1:100) и APC-Cy7 против мыши IA-IE (1:100).
- Образец Т-клеток: Добавьте 0,1 мг / мл DAPI (1: 100), FITC против мыши CD45 (1: 100), PE-Dazzle 594 против мыши CD11b (1: 100), APC против мыши TCRβ (1: 100), PE против мыши CD8a (1: 100) и APC-Cy7 против мыши CD4 (1: 50).
- КОНТРОЛЬ DAPI-моно-окрашивания (из шага 5.12): Добавьте 0,1 мг/мл DAPI (1:100).
- Моноокрашенные компенсационные шарики антител: Добавьте каждое из девяти ранее использованных антител для образцов миелоидных и Т-клеток (одно и то же разведение) отдельно (по одному на каждую трубку) к девяти пробиркам, содержащим шарики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Моноокрашенные компенсационные элементы управления позволят определить положительные пики флуоресценции для каждого из используемых флуоресцентных маркеров на этапе компенсации. Анализатор сравнит их с отрицательным сигналом, наблюдаемым в неокрашенных контрольных ХП-клетках. - Полностью окрашенные компенсационные шарики антител: Добавьте все антитела, используемые для окрашивания миелоидов, в одну трубку и те, которые используются для окрашивания Т-клеток, в другую.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью окрашенные элементы управления компенсацией позволят установить напряжение каждого флуоресцентного лазерного обнаружения и оценить потенциальное неспецифическое обнаружение сигнала флуоресцентного красителя в других каналах. - Инкубировать в течение 30-45 мин на льду, защищенном от воздействия света.
- Заполните все пробирки объемом до 1,5 мл буфером MACS. Центрифугирование ячеек и компенсационных шариков при 500 х г, в течение 5 мин, при 4 °С.
- Выбросьте супернатант и промыть ячейки и компенсационные шарики в 1,5 мл буфера MACS.
- Центрифугирование ячеек и компенсационных шариков при 500 х г, в течение 5 мин, при 4 °С. Выбросьте супернатант.
- Повторное суспендирование клеток и компенсация шариков в 500 мкл буфера MACS. Заполните незапятнанный элемент управления (шаг 5.8) до 500 мкл с помощью буфера MACS.
- Фильтруйте каждую трубку с CP-клетками через 70-мкм-ситечко (неиспорченный CP, dapi моно окрашенный контроль, а также образцы миелоидных и Т-клеток).
6. Проточная цитометрия
ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный цитометр, используемый в этом протоколе, оснащен следующими 5 лазерами: 355 нм УФ-лазером, 405 нм Фиолетовым лазером, 488 нм Синим лазером, 561 нм Желто-зеленым лазером и 637 нм Красным лазером.
- Выполняйте ежедневные проверки качества цитометра с использованием установки цитометра, интерфейса отслеживания (CST) и контрольных шариков CST для обеспечения согласованности между анализами, качеством прибора и постоянной интенсивностью целевой флуоресценции.
- Чтобы настроить эксперимент по проточной цитометрии, создайте новый эксперимент с двумерными графиками и гистограммами. Обеспечьте включение графиков прямой области рассеяния (FSC-A) и боковой области рассеяния (SSC-A), а также графиков гистограммы для каждого цвета для мониторинга захвата.
- Определите морфологию ячейки, установив напряжение PMT для параметров FSC-A и SSC-A на неиспорченных управляющих ячейках CP.
- Определите напряжения каждого флуоресцентного маркера, установив отрицательные пики фторхромов на незапятнанных контрольных клетках CP и положительные пики фторхромов, используя компенсационные шарики, окрашенные всеми антителами, и гарантируя, что сигналы детектора не зашкаливают и не слишком сильно перекрестно обнаруживаются в других каналах.
- Создайте матрицу компенсаций для анализа каждого из одноцветных элементов управления компенсацией. После проверки соответствующих популяций FSC-A/SSC-A проверьте элементы управления с одним окрашиванием на гистограммных участках и запишите контроль компенсации. После записи всех одноокрашенных образцов рассчитайте компенсационную матрицу.
- Запишите все события, обнаруженные как для миелоидных, так и для Т-клеточных популяций.
7. Cp миелоидные клетки
- Выберите FSC-A против SSC-A и затвор для ячеек (в зависимости от размера).
- Создайте дочерний затвор для одиночных ячеек с высотой FSC-A и прямого рассеяния (FSC-H).
- Создайте дочерний шлюз для живых ячеек с DAPI и FSC-A, чтобы исключить ячейки DAPI+ .
- Создайте дочерние ворота для иммунных клеток CD45+ с CD45 против FSC-A.
- Создайте дочерний затвор из ячеек CD45+ и выберите CD11b против F4/80, определите следующие две группы: CD11b+ F4/80+ и CD11b+ F4/80- популяции (следующий шаг 7.8).
- Создайте дочерний шлюз для ячеек CD11b+ F4/80+ и выберите CX3CR1 против IA-IE. Идентифицируйте как CX3CR1+ IA-IE+ BAM, которые далее обозначаются как CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM, так и CX3CR1+ IA-IE- макрофаги.
- Создайте дочерний шлюз для макрофагов CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- и выберите F4/80 против CD11b. Определите как CD11bhigh F4/80intermediate, так и CD11b+ F4/80, которые далее называются CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- макрофаги эпиплексуса Колмера и CD11b+ F4/80high CX3 CR1+ IA-IE- БАМ, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: CD11bhigh F4/80 промежуточные CX3CR1+ IA-IE- и CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE-клетки оказались немного смешанными между уровнями F4/80intermediate-F4/80high и CD11bhigh-CD11b+. - Из CD11b+ F4/80- популяции (шаг 7.5), ворота для Ly6C против IA-IE. Выберите как IA-IE+ Ly6C-популяцию, так и IA-IE-Ly6C+ клетки, которые в основном соответствуют моноцитам/нейтрофилам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокое присутствие клеток IA-IE-Ly6C+, вероятно, отражает проблемы в перфузионной эффективности животных без воспалительного состояния; их обилие должно быть низким. - Создайте дочерний шлюз для CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- популяции и выберите CD11b против CX3CR1, определите как CD11bhigh CX3CR1low, так и CD11b+ CX3CR1- популяции.
8. CP Т-клетки
- Выберите FSC-A против SSC-A и затвор для ячеек (в зависимости от размера).
- Создайте дочерний затвор для одиночных ячеек с высотой FSC-A и прямого рассеяния (FSC-H).
- Создайте дочерний шлюз для живых ячеек с DAPI и FSC-A, чтобы исключить ячейки DAPI+ .
- Создайте дочерние ворота для иммунных клеток CD45+ с CD45 против FSC-A.
- Создайте дочерний затвор из клеток CD45+ и выберите TCRβ против CD11b. Исключите CD11b+ миелоидные клетки и выберите популяцию TCRβ+ CD11b-Т-клеток.
- Создайте дочерний шлюз для популяции TCRβ+ CD11b- и выберите CD4 против CD8a. Идентифицируйте как CD8-CD4+ Т-клетки, так и CD8+ CD4-Т-клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализы проточной цитометрии, представленные здесь, успешно выявили основные подмножества миелоидных и Т-клеток (рисунок 1 и рисунок 2 соответственно) и их относительное общее количество на мышь в высоко воспроизводимым способом (рисунок 3).
Анализ проточной цитометрии миелоидных клеток показал, что CP населены CD11b + CX3CR1 + F4 / 80high BAM, что составляет почти 80% иммунных клеток CD45 + в CP. Эти BAM были разделены на две разные популяции в соответствии с их экспрессией MHC-II: IA-IE + BAM, которая составляла основную группу (72% иммунных клеток CD45 +), в соответствии с ранее опубликованными данными7, и IA-IE-BAM. CD11bhigh F4/80 интермедиат CX3CR1+ IA-IE- популяция макрофагов эпиплексуса Колмера7,2 также была идентифицирована и представляла только около 1,2% иммунных клеток CD45+ CP, в соответствии с литературой7. Среди CD11b + F4 / 80- иммунных клеток были охарактеризованы две различные популяции клеток Ly6C- IA-IE+, которые, вероятно, соответствуют дендритным клеткам, и которые можно разделить на CD11bhigh CX3CR1low и CD11b + CX3CR1- популяции, которые составляли около 3,1% и 3,7% иммунных клеток CD45 + CP соответственно. CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+ клеточная популяция, включающая как моноциты, так и нейтрофилы, составляла только 0,5% иммунных клеток CD45+ в соответствии с предыдущими отчетами и свидетельствует о высокой эффективности перфузии PBS3. Эти результаты в значительной степени согласуются с ранее опубликованными данными, оценивающими иммунные популяции CP с помощью секвенирования одноклеточной РНК7.
Анализ и стратегия гаширования Т-клеток выявили наличие незначительной популяции CD45+ CD11b-TCRβ+ клеток. Среди них около 30-50 CD8-CD4+ и CD8+ CD4-Т-клеток на мышь, заселенную CP в физиологических условиях, что составляет 1,3% и 0,9% иммунных клеток CD45+ CP соответственно. Cd4+ клетки были немного более обильными, чем CD8+ Т-клетки, что согласуется с предыдущими результатами с точки зрения как количества, так и пропорции21,30. Эта стратегия гатинга также выявила популяцию CD45+ CD11b-TCRβ+ CD4-CD8-клеток, которые могут включать NKT-клетки, и недавно описанное регуляторное подмножество Т-клеток10,28,31. Предложенный анализ проточной цитометрии и стратегии гатинга позволили аннотировать тип клеток почти 90% иммунных клеток (CD45+), составляющих ДЦП мыши.
Рисунок 1: Анализ проточной цитометрии и стратегия определения миелоидных клеток от ДЦП перфузированных мышей. Ячейки закрыты в зависимости от размера с использованием FSC-A против SSC-A. Синглетные ячейки выбираются с помощью FSC-A и FSC-H. Живые ячейки закрываются путем исключения ячеек DAPI+ на графике DAPI против FSC-A. Иммунные клетки CD45+ затем идентифицируются на графике CD45 против FSC-A. Отбираются популяции CD11b и F4/80, CD11b+ F4/80+ и CD11b+ F4/80. При измерении популяции CD11b+ F4/80+ с использованием CX3CR1 по сравнению с IA-IE определяются как CD11b+ F4/80hi CX3CR1+ IA-IE+ BAM, так и CX3CR1+ IA-IE-популяции. Эта последняя популяция затем закрывается с использованием F4/80 против CD11b для лучшего разделения CD11b + F4 / 80high CX3CR1 + IA-IE- BAM и CD11bhigh F4 / 80 посреднических CX3CR1 + IA-IE - макрофагов эпиплексуса Колмера. Отбирается Ly6C против IA-IE на CD11b + F4 / 80-, оба CD11b + F4 / 80 - IA-IE - Ly6C + клетки, которые в основном соответствуют моноцитам и нейтрофилам, и CD11b + F4 / 80 - IA-IE + Ly6C-клетки, которые, вероятно, представляют собой популяцию дендритных клеток. CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- ячейки защищены с использованием CD11b против CX3CR1, что позволяет идентифицировать CD11bhigh CX3CR1low и CD11b + CX3CR1- ячейки. Если это не указано, значения под каждой закрытой популяцией представляют частоту родительской популяции. привет: высокий; int: промежуточный; lo: низкий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ проточной цитометрии и стратегия измерения Т-клеток от ДЦП перфузированных мышей. Ячейки закрыты в зависимости от размера с использованием FSC-A против SSC-A. Отдельные ячейки выбираются с помощью FSC-A против FSC-H. Живые клетки идентифицируются, исключая ячейки DAPI+ на графике DAPI против FSC-A. Иммунные клетки CD45 + затем закрываются на график CD45 против FSC-A. Выбраны CD11b против TCRβ, CD11b-TCRβ+. При сравнении CD4 с CD8 определяются пропорции CD8-CD4+ и CD4-CD8+ Т-клеток. Если это не указано, значения под каждой закрытой популяцией представляют частоту родительской популяции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количество основных подмножеств иммунных клеток в CP на мышь. Среднее значение общего числа клеток на мышь различных иммунных подмножеств, идентифицированных в четырех CP, объединенных вместе. Представление: Среднее + стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования, направленные на понимание иммунологического вклада в гомеостаз мозга и болезни, в основном сосредоточены на клетках, находящихся в паренхиме мозга, пренебрегая границами мозга, такими как CP, которые, тем не менее, являются решающими факторами функции мозга2,3. Анализ популяций иммунных клеток в CP является сложным из-за небольшого размера CP, низкого количества резидентных иммунных клеток и сложного доступа к этой ткани. Проточная цитометрия, выполняемая на общих иммунных клетках мозга (CD45+), не позволяет характеризовать редкие иммунные популяции, которые находятся в ДЦП. Чтобы охарактеризовать иммунный состав ДЦП с высокой точностью, анализы проточной цитометрии были проведены на ДЦП, рассеченных у мышей с перфузией PBS. Этот подход позволяет исключить циркулирующие cd45+ клетки и CP CD45-клетки, такие как перициты, эндотелиальные и эпителиальные клетки32. Стратегии гейтинга, ориентированные на популяции миелоидных и Т-клеток, идентифицируют основные иммунные подмножества CP.
Критическим этапом текущего протокола является перфузия PBS. Поскольку иммунные клетки CP встречаются редко, загрязнение крови может полностью маскировать их местную гетерогенность. Обесцвечивание печени и мозга всегда проверяется в качестве контроля, и поэтому загрязнение крови минимально. Последовательно, CD11b + F4 / 80- Ly6C +, который включает в себя как моноциты, так и нейтрофилы, присутствующие в крови, а не в мозге в невоспалительных состояниях3, составлял всего 0,5% клеток CD45 + , демонстрируя высокую эффективность перфузии PBS. Другим полезным средством контроля эффективности перфузии PBS может быть включение антител против Ter119, маркера, специфичного для эритроцитов. Наконец, дополнительный анализ CP из PBS-перфузированных участков мозга мыши с помощью иммуноокрашивания и микроскопии также может быть полезен для проверки того, сопротивлялись ли какие-либо иммунные клетки крови, которые могут сильно прилипать к эндотелию, перфузии PBS и оставались прикрепленными к просвету сосудистой сети.
Стратегия миелоидного гатинга выявила две популяции макрофагов: CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+/-BAM и CD11b+ F4/80 посреднические клетки эпиплексуса CX3CR1+ IA-IE- Колмера, которые экспрессируют высокие уровни CD11b и низкие уровни F4/807. Ворота клеток эпиплексуса Колмера7,20 и IA-IE-BAM не были четко разделены с помощью маркеров CD11b и F4/80. Включение маркера CD206 в эту стратегию измерения может помочь лучше дифференцировать CD206+ IA-IE-BAM от клеток эпиплексуса CD206лоу Колмера7.
Почти 7% иммунных клеток CP оказались CD11b + F4 / 80 - Ly6C - IA-IE +. Это подмножество состояло из двух популяций в соответствии с их уровнями экспрессии CD11b и CX3CR1. Эти клетки, вероятно, соответствуют дендритным клеткам, но это еще предстоит подтвердить, проанализировав их экспрессию CD11c либо с помощью FACS3, либо иммунофлуоресценции33. Популяция CD11b+ F4/80-Ly6C-IA-IE+ также, вероятно, включает тучные клетки. Включение антител для обнаружения CD117 и c-kit в стратегию gating поможет отличить их от CD11c+ дендритных клеток3,34. Определена доля CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ клеток среди иммунных клеток CP. Тем не менее, они включают как моноциты, так и нейтрофилы, и добавление маркера Ly6G к стратегии гатинга клеток CD45 + CD11b + F4 / 80 + Ly6C + определит отношение Ly6G-моноцитов к нейтрофилам Ly6G +. Помимо описанной популяции CD45+ CD11b-TCRβ+, стратегия гатинга на CD45+ CD11b-популяциях может быть обогащена с использованием маркеров NK1.1 и CD11c для идентификации NK-клеток, TCRγδ для анализа γδ-Т-клеток, CD19 и/или B220 для характеристики В-клеток и CD138 для идентификации плазматических клеток3. Экспрессия репортерных генов также может быть включена в этот анализ. Например, использование трансгенных мышей Foxp3-GFP может быть полезно для идентификации CP-резидентных Т-регуляторных (Treg) клеток3,30. Наконец, этот протокол может также включать внутриклеточное окрашивание факторов транскрипции или цитокинов21.
В то время как иммунные клетки паренхимы головного мозга были широко изучены, гораздо меньше известно об иммунных клетках, заполняющих мозговые барьеры, такие как CP3,35,36. ДЦП у мышей представляют собой небольшие ткани, расположенные в четырех разных областях мозга, и их выделение требует довольно сложной микродиссекции. Из-за этого ДЦП в основном изучались с использованием визуализации. Окрашивание иммунных клеток CP из всей рассеченной ткани CP или из участков мозга с последующим микроскопическим анализом обеспечило значительные успехи в понимании иммунных механизмов CP14,15,21,22,26,27,29,30,33 . Однако этот метод не позволяет проводить обширный анализ разнообразия иммунных клеток CP, поскольку одновременно могут быть проанализированы только четыре-шесть маркеров. Кроме того, некоторые субпопуляции, такие как CD4 + или CD8 + Т-клетки, довольно редки на CP, и количественный анализ их фенотипов с помощью микроскопии будет сложной задачей. Подход проточной цитометрии позволяет параллельно анализировать десятки маркеров для каждой иммунной клетки, обеспечивая более подходящий инструмент для количественной оценки иммунного состава CP.
Совсем недавно технология транскриптомы одиночных ядер (snRNA-seq) стала мощным методом изучения гетерогенности CP10,28. Тем не менее, он не очень хорошо подходит для анализа иммунных клеток CP, поскольку они составляют лишь небольшую часть клеток CP. Поскольку snRNA-seq отбирает образцы клеток в той пропорции, в которой они присутствуют в ткани, иммунные клетки недостаточно представлены в snRNA-seq, и их низкое количество представляет собой препятствие для углубленного анализа10,28.
Одноклеточная транскриптомика (scRNA-seq) была недавно применена для точного картирования гетерогенности иммунных клеток изолированных иммунных клеток CP7. В то время как scRNA-seq довольно сложен и дорог в выполнении, проточная цитометрия может служить более доступным способом обследования иммунных субпопуляций на CP. Наконец, этот протокол может служить частью протокола сортировки клеток, где выбранные подтипы клеток сортируются с использованием FACS для анализа с помощью молекулярных методов, таких как scRNA-seq или объемный анализ РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Institut Pasteur Animalerie Centrale и членов CB-UTechS за их помощь. Эта работа была финансово поддержана Институтом Пастера.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -W.
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
