Summary
Este estudo utiliza citometria de fluxo e duas estratégias diferentes de gating em camundongos isolados com plexos cerebrais coroides; este protocolo identifica os principais subconjuntos de células imunes que povoam essa estrutura cerebral.
Abstract
O cérebro não é mais considerado como um órgão funcionando isoladamente; acumular evidências sugere que mudanças no sistema imunológico periférico podem moldar indiretamente a função cerebral. Na interface entre o cérebro e a circulação sistêmica, os plexos coroides (CP), que constituem a barreira do fluido sangue-cefalorraquidiano, têm sido destacados como um local-chave da comunicação periferia-cérebro. Cp produz o fluido cefalorraquidiano, fatores neurotróficos e moléculas de sinalização que podem moldar a homeostase cerebral. Cp também são um nicho imunológico ativo. Em contraste com o parênquimo cerebral, que é povoado principalmente por microglia em condições fisiológicas, a heterogeneidade das células imunes CP recapitula a diversidade encontrada em outros órgãos periféricos. A diversidade e a atividade das células imunes CP mudam com o envelhecimento, o estresse e a doença e modulam a atividade do epitélio CP, moldando indiretamente a função cerebral. O objetivo deste protocolo é isolar o CP murine e identificar cerca de 90% dos principais subconjuntos imunológicos que os povoam. Este método é uma ferramenta para caracterizar células imunes CP e entender sua função na orquestração da comunicação periférica-cérebro. O protocolo proposto pode ajudar a decifrar como as células imunes cp modulam indiretamente a função cerebral na saúde e em várias condições da doença.
Introduction
Desde a descoberta da barreira hematoencefálica por Paul Erhlich no final do século XIX, o cérebro tem sido considerado virtualmente separado dos outros órgãos e da corrente sanguínea. No entanto, nesta última década, viu o surgimento do conceito de que a função cerebral é moldada por vários fatores biológicos, como microbiota intestinal e células imunes sistêmicas e sinais1,2,3,4. Paralelamente, outras fronteiras cerebrais, como meninges e plexos coroides (CP) foram identificadas como interfaces de conversa transversal-imuno-cérebro ativa em vez de tecidos de barreira inerte5,6,7,8.
O PC constitui a barreira do fluido sangue-cefalorraquidiano, uma das fronteiras que separam o cérebro e a periferia. Eles estão localizados em cada um dos quatro ventrículos do cérebro, ou seja, o terceiro, o quarto, e ambos os ventrículos laterais, e são adjacentes a áreas envolvidas na neurogênese, como a zona subventricular e a zona subgranular do hipocampo3. Estruturalmente, o PC é composto por uma rede de capilares de sangue fenestrados fechados por uma monocamada de células epiteliais, que são interligadas por junções apertadas e aderentes9,10. Os principais papéis fisiológicos do epitélio CP envolvem a produção de fluido cefalorraquidiano, que libera o cérebro de metabólitos de resíduos e agregados proteicos, e a produção e passagem controlada sangue-cérebro de várias moléculas de sinalização, incluindo hormônios e fatores neurotróficos11,12,13. Moléculas secretadas da CP moldam a atividade do cérebro, ou seja, modulando a neurogênese e a função microglial14,15,16,17,18,19, o que torna o CP crucial para a homeostase cerebral. CP também se engaja em várias atividades imunológicas; enquanto o principal tipo de célula imune no parenchyma cerebral em condições não patológicas é a microglia, a diversidade de populações de células imunes CP é tão ampla quanto em órgãos periféricos3,7, sugerindo que vários canais de regulação e sinalização imunológica estão em ação no CP.
O espaço entre as células endotelial e epitelial, o estroma CP, é povoado principalmente por macrófagos associados à borda (BAM), que expressam citocinas pró-inflamatórias e moléculas relacionadas à apresentação de antígenos em resposta a sinais inflamatórios3. Outro subtipo de macrófagos, as células epiplexas de Kolmer, estão presentes na superfície apical do epitélio CP20. O estroma CP também é um nicho para células dendríticas, células B, células de mastro, basófilos, neutrófilos, células linfoides inatas e células T que são principalmente células T efeito ou memória capazes de reconhecer antígenos do sistema nervoso central7,21,22,23,24. Além disso, a composição e a atividade das populações de células imunes no PC alteram a perturbação sistêmica ou cerebral, por exemplo, durante o envelhecimento10,14,15,21,25, microbiota perturbação7, stress26 e doença27,28. Notavelmente, essas alterações foram sugeridas para moldar indiretamente a função cerebral, ou seja, uma mudança das células T CP CD4+ para a inflamação Th2 ocorre no envelhecimento cerebral e desencadeia sinalização imune do PC que pode moldar o declínio cognitivo associado ao envelhecimento14,15,21,25,29 . Iluminar as propriedades das células imunes cp seria, portanto, crucial para entender melhor sua função regulatória na fisiologia e secreção do epitélio CP e, assim, decifrar seu impacto indireto na função cerebral em condições saudáveis e de doenças.
CP são pequenas estruturas que contêm apenas algumas células imunes. Seu isolamento requer microdisseção após uma etapa preliminar de perfusão; células imunes na corrente sanguínea constituiriam contaminantes graves. Este protocolo visa caracterizar os subconjuntos de células mielóide e T do CP usando citometria de fluxo. Este método identifica cerca de 90% das populações de células imunes que compõem o PC do camundongo sob condições não inflamatórias, de acordo com trabalhos recentemente publicados usando outros métodos para dissecar a heterogeneidade cp imune7,10,28. Este protocolo poderia ser aplicado para caracterizar alterações no compartimento de células imunes cp com doenças e outros paradigmas experimentais in vivo.
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Protocol
Todos os procedimentos acordados com as diretrizes da Comissão Europeia para o manejo de animais de laboratório, diretiva 86/609/CEE. Eles foram aprovados pelos comitês de ética nº 59, pelo CETEA/CEEA nº 089, sob o número dap210067 e APAFIS nº 32382-2021070917055505 v1.
1. Preparação dos materiais
- Armazene todos os anticorpos (Tabela de Materiais) a 4 °C, protegidos contra exposição à luz.
- Solução de estoque DAPI (1 mg/mL): Resuspend o pó em PBS-/- (Tabela de Materiais), aliquot e armazenar a -20 °C.
- Solução de trabalho DAPI (0,1 mg/mL): Diluir a solução de estoque DAPI com PBS-/- a uma razão de 1:10.
- Tampão de células ativados por magnético (MACS): Prepare 2 mM de diamina de diamiácetico (EDTA) e albumina de soro bovino de 0,5% (BSA) (Tabela de Materiais) em PBS-/-.
- Solução de estoque de colagenase IV (20 U/μL): Resuspend o pó em PBS+/+ (Tabela de Materiais), aliquot e armazenar a -20 °C.
NOTA: A Colagemnase IV requer que o MgCl2 esteja totalmente ativo; não congele a solução de Colagenase IV. - Solução anestésica-analgésico: Misture 150 μL de cetamina (150 mg/kg), 25 μl de xilazina (5 mg/kg) e 330 μl de buprecare (0,1 mg/kg) em 1 mL de PBS-/-.
NOTA: Prepare a solução anestésica-analgésico extemporâneamente e não a mantenha por mais de um dia. - Solução de heparina (100 U/mL): Resuspend o pó em PBS-/-.
- Prepare o sistema de inset de infusão que conecta um tubo a um decantador Erlenmeyer preenchido com PBS-/-. Conecte uma agulha de 23 G à extremidade do tubo de infusão. Abra o inset de infusão e deixe o PBS funcionar até que não haja bolhas no tubo.
- Prepare a lupa binóculo equipada com uma luz.
2. Habitação de ratos C57BL/6
- Para a análise de células mielóides CP ou T, utilize quatro camundongos para cada um e acumule os quatro CP (dois de cada ventrículo lateral, o terceiro ventrículo e o quarto ventrículo CP; para oito ratos no total). Não reunir CP traz o risco de não detectar as raras populações imunes em CP devido à sua baixa abundância.
- Deixe os ratos aclimatar por pelo menos 7 dias antes de qualquer experimentação. Mantenha os camundongos em condições livres de patógenos em temperatura e umidade constantes, em um ciclo claro/escuro de 12/12 h ou 14/10 h, com água e alimento padrão de pelotas ad libitum.
3. Perfusão da PBS e dissecção cerebral
- Peso cada rato e injete 10 μL/g da solução de mistura anestésica-analgésico (passo 1.6) intraperitoneally.
- Aguarde cerca de 30 min por analgesia eficiente (verifique a profundidade da anestesia beliscando os dígitos do mouse).
- Posicione o mouse anestesiado de costas, no suporte de dissecção e tape as palmas das mãos ao suporte de dissecção.
- Beliscando a pele do animal com fórceps e usando tesouras, abra o abdômen, o diafragma e o tórax para expor o coração.
NOTA: Quando o tórax é aberto, o cérebro se torna anoxico. Deve-se prosseguir com precisão e rapidez através dos próximos passos da perfusão. - Injete 20 μL de solução de heparina U/mL diretamente no ventrículo esquerdo.
- Com uma tesoura fina, faça uma incisão de pelo menos 3 mm no átrio direito para permitir que o sangue flua para fora do corpo.
- Imediatamente depois, insira a agulha de 23 G colocada na extremidade do tubo de infusão através da ponta do ventrículo esquerdo.
- Abra o sistema de infusão no máximo e espere por perfusão completa: Usando uma agulha de 23 G, a uma vazão de cerca de 6 mL/min, a perfusão é completa em 3 min.
NOTA: A descoloração uniforme de órgãos como o fígado atesta a eficácia da perfusão. - Feche o sistema de infusão e remova a agulha do ventrículo cardíaco.
- Remova a fita das palmas das mãos do rato. Coloque o mouse em uma posição ventral.
- Beliscando a pele do animal com fórceps e usando tesouras, remova a pele da parte superior da cabeça dos olhos para as orelhas.
- Com a ajuda da tesoura, corte o crânio primeiro entre os olhos e, em seguida, lateralmente de cada olho para a medula espinhal logo acima dos músculos do masseter. Para isso, use a extremidade da tesoura e proceda suavemente para evitar danificar o cérebro com a tesoura.
- Abra o crânio com fórceps beliscando-o da extremidade entre os olhos.
- Use uma tesoura para cortar a medula espinhal e extrair o cérebro com fórceps, colocando seus dois pontos no lado lateral do cérebro para incliná-lo e colocá-lo em uma placa de Petri cheia de PBS+/+. O CP é imediatamente coletado.
NOTA: Verifique se há descoloração do cérebro para verificar a eficácia da perfusão.
4. Dissecção do Plexo Choroide do cérebro
- Posicione o lado dorsal do cérebro na placa de Petri e abaixo dos objetivos das lupas binóculos.
- Com a ajuda de fórceps para manter o cérebro no lugar, insira as duas extremidades de outro fórceps através da linha média entre os hemisférios.
- Use os fórceps para puxar o córtex com o caloso e o hipocampo longe do septo, expondo o ventrículo lateral e uma parte do terceiro ventrículo.
- Identifique o CP lateral como um longo véu que reveste o ventrículo lateral que está em chamas em ambas as extremidades. Use as duas extremidades de um fórceps fino para pegar o CP lateral. Tenha cuidado para coletar a parte posterior triangular que pode ser escondida pela dobra posterior do hipocampo.
- Puxe o córtex com o corpus caloso e hipocampo do hemisfério contralateral para longe do septo para expor todo o terceiro ventrículo e o ventrículo lateral oposto.
- Colete com adoces finos o terceiro CP, que pode ser identificado como uma estrutura curta com aspecto de superfície granular.
- Pegue o outro CP lateral.
- Insira as duas extremidades de um fórceps entre o cerebelo e o cérebro médio. Retire o cerebelo dos pons e medulla para expor o quarto ventrículo.
- Identifique o quarto CP como uma longa estrutura globular com um aspecto de superfície granular que reveste o quarto ventrículo da extremidade direita lateral para a extremidade esquerda entre o cerebelo e a medula. Pegue o quarto CP com fórceps finos.
NOTA: O revestimento de fórceps de base de silano pode evitar a pegajosa do CP em fórceps. - Repita as etapas 3.1-4.9 para cada um dos outros sete ratos. Enquanto isso, o CP coletado pode ser mantido temporalmente em um tubo colocado no gelo.
5. Preparação de amostras para análise de citometria de fluxo
- Encha o tubo contendo todos os CP dissecados a 750 μL de PBS+/+.
NOTA: A deposição de CP dissecada com fórceps finos no tubo traz um pequeno volume de PBS+/+. Preencha o volume existente até 750 μL do que removê-lo e substituí-lo por 750 μL fresco de PBS+/+ para evitar uma possível perda do tecido CP. - Adicione 15 μL de 20 soluções de estoque de Colagenase IV U/μL (ver passo 1.5) para uma concentração final de 400 U/mL.
NOTA: O DNAse I (150 μg/mL) pode evitar o agrupamento excessivo de células. - Incubar CP com Colagenase IV a 37 °C sob agitação leve (300 RPM) por 45 min.
- Pipeta suavemente para cima e para baixo cerca de 10 vezes para finalizar a dissociação do CP.
- Encha o tubo CP a 1,5 mL com tampão MACS (ver passo da receita 1.4) para parar a atividade de colagemnase IV.
NOTA: A atividade de Colagenase IV é interrompida a baixa temperatura e inibida pela albumina de soro. - Centrifugar as células a 500 x g, por 5 min, a 4 °C. Descarte o supernatante e lave as células com 1,5 mL de tampão MACS.
- Centrifugar as células a 500 x g por 5 min, a 4 °C. Descarte as células supernascidas e resuspend em 220 μL de buffer MACS.
- Separe uma alíquota de 10 μL da suspensão celular para ser usada como controle não manchado (próximo passo 5.18).
- Separe uma alíquota de 10 μL da suspensão celular a ser usada como controle mono-manchado da DAPI (próximo passo 5.12).
- Pré-insuscie os 200 μL restantes com anticorpo de bloqueio CD16/CD32 anti-mouse (1:100) por 20 min, a 4 °C, para bloquear interações não específicas mediadas por Fc.
- Divida as células em dois tubos de 100 μL (um para análise de células mielóides, o outro para análise de células T) (próximo passo 5.14).
- Pegue a amostra com 10 μL de células para o controle dapi-mono-manchado (etapa 5.9) e preencha-a até 100 μL com tampão MACS (próximo passo 5.14).
- Prepare onze novos tubos contendo 100 μL de MACS para os anticorpos mono-manchados (etapa 5.14.4) e controles totalmente manchados (passo 5.14.5) e adicione uma gota de contas de compensação em cada um.
NOTA: Os controles de compensação permitirão configurar a tensão do laser de detecção fluorescente e avaliar a potencial detecção de sinal inespecífico de corante fluorescente nos outros canais que serão ainda mais compensados. - Incubação de anticorpos de amostras:
- Amostra de meloide: Adicionar 0,1 mg/mL DAPI (1:100) (ver passo 1.3), FITC anti-mouse CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b (1:100), APC anti-mouse-mouse CX3CR1 (1:100), BV711 anti-mouse Ly6C (1:100), PE anti-mouse F4/80 (1:100) e APC-Cy7 anti-mouse IA-IE (1:100).
- Amostra de células T: Adicionar 0,1 mg/mL DAPI (1:100), FITC anti-mouse CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b (1:100), TCRβ anti-mouse APC (1:100), PE anti-mouse CD8a (1:100) e CD4 anti-mouse APC-Cy7 (1:50).
- Controle mono-manchado DAPI (a partir da etapa 5.12): Adicionar 0,1 mg/mL DAPI (1:100).
- Contas de compensação mono-manchadas de anticorpos: Adicione cada um dos nove anticorpos usados anteriormente para amostras de células mielóides e T (mesma diluição), separadamente (um para cada tubo) aos nove tubos contendo as contas.
NOTA: Os controles de compensação mono-manchados permitirão a determinação de picos positivos de fluorescência para cada um dos marcadores fluorescentes usados durante a etapa de compensação. O analisador irá compará-los com o sinal negativo observado nas células CP de controle não manchadas. - Contas de compensação de anticorpos totalmente manchadas: Adicione todos os anticorpos usados para coloração de mielóides em um tubo e aqueles usados para coloração de células T a outro.
NOTA: Os controles de compensação totalmente manchados permitirão configurar a tensão de cada detecção de laser fluorescente e avaliar a potencial detecção de sinal inespecífico de corante fluorescente nos outros canais. - Incubar por 30-45 min no gelo, protegido da exposição à luz.
- Encha todos os tubos até 1,5 mL com tampão MACS. Centrifugar as células e as contas de compensação a 500 x g, por 5 min, a 4 °C.
- Descarte o supernatante e lave as células e as contas de compensação em 1,5 mL de tampão MACS.
- Centrifugar as células e as contas de compensação a 500 x g, por 5 min, a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Resuspenda as células e contas de compensação em 500 μL de buffer MACS. Encha o controle não manchado (etapa 5.8) até 500 μL com buffer MACS.
- Filtre cada tubo com células CP através de um coador de 70 μm (CP não manchado, controle mono-manchado da DAPI e amostras de células mielóides e T).
6. Citometria de fluxo
NOTA: O citómetro de fluxo usado neste protocolo é equipado com os seguintes 5 lasers: um laser UV de 355 nm, um laser Violet de 405 nm, um laser azul de 488 nm, um laser verde-amarelo de 561 nm e um laser vermelho de 637 nm.
- Realize as verificações diárias de controle de qualidade no citômetro usando a configuração do citômetro, a interface de rastreamento (CST) e as contas de controle CST para garantir a consistência entre análises, qualidade do instrumento e intensidades consistentes de fluorescência de alvo.
- Para configurar o experimento de citometria de fluxo, crie um novo experimento com tramas bivarias e histogramas. Garantir a inclusão de uma área de dispersão para a frente (FSC-A) e parcelas de área de dispersão lateral (SSC-A), bem como parcelas histogramas para cada cor para monitorar a aquisição.
- Defina a morfologia celular configurando a tensão pmt para parâmetros FSC-A e SSC-A em células CP de controle não manchadas.
- Defina as tensões de cada marcador fluorescente, configurando os picos negativos dos fluorochromes em células CP de controle não manchadas e os picos positivos dos fluorochromes usando contas de compensação manchadas com todos os anticorpos e garantindo que os sinais do detector não estejam fora da escala e não sejam fortemente detectados em outros canais.
- Crie uma matriz de compensação para analisar cada um dos controles de compensação de cores únicas. Depois de atacar as populações apropriadas de FSC-A/SSC-A, verifique controles de uma única mancha em parcelas de histograma e registiculhe controles de compensação. Depois de registrar todas as amostras manchadas, calcule a matriz de compensação.
- Registo todos os eventos detectados para populações de células mielóides e T.
7. Células mielóides CP gating
- Selecione FSC-A vs. SSC-A e portão para células (com base no tamanho).
- Crie um portão de filha para células individuais com altura de dispersão FSC-A vs. para a frente (FSC-H).
- Crie um portão de filha para células vivas com DAPI vs. FSC-A para excluir células DAPI+ .
- Crie um portão de filha para células imunes CD45+ com CD45 vs. FSC-A.
- Crie um portão de filha a partir das células CD45+ e selecione CD11b vs. F4/80, identifique os seguintes dois grupos: o CD11b+ F4/80+ e o CD11b+ F4/80- populações (próximo passo 7.8).
- Crie um portão de filha para células CD11b+ F4/80+ e selecione CX3CR1 vs. IA-IE. Identifique tanto cx3cr1+ IA-IE+ BAM que são ainda mais denominados como CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM, e CX3CR1+ IA-IE- macrófagos.
- Crie um portão de filha para cd11b+ F4/80+ CX3CR1+ IE- macrófagos e selecione F4/80 vs. CD11b. Identifique tanto o CD11bhigh F4/80intermediate quanto as populações CD11b+ F4/80high que são ainda chamadas de CD11bigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Macrofagos epiplexos de Kolmer e CD11b+ F4/80high CX3 CR1+ IA-IE-BAM, respectivamente.
NOTA: AS células CX3CR1+ CD11bigh F4/80intermediato CX3CR1+ e CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- apareceram um pouco misturadas entre os níveis F4/80intermediate-F4/80high e CD11bhigh-CD11b+. - Da população CD11b+ F4/80 (etapa 7.5), portão para Ly6C vs. IA-IE. Selecione tanto as células IA-IE+ Ly6C- população e IA-IE-Ly6C+ que correspondem principalmente a monócitos/neutrófilos.
NOTA: A alta presença de células IA-IE-Ly6C+ provavelmente reflete problemas na eficácia da perfusão de animais sem condição inflamatória; sua abundância deve ser baixa. - Crie um portão de filha para a população CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C e selecione CD11b vs. CX3CR1, identifique tanto as populações CD11bhigh CX3CR1low quanto CD11b+ CX3CR1- populações.
8. Células CP T gating
- Selecione FSC-A vs. SSC-A e portão para células (com base no tamanho).
- Crie um portão de filha para células individuais com altura de dispersão FSC-A vs. para a frente (FSC-H).
- Crie um portão de filha para células vivas com DAPI vs. FSC-A para excluir células DAPI+ .
- Crie um portão de filha para células imunes CD45+ com CD45 vs. FSC-A.
- Crie um portão de filha a partir das células CD45+ e selecione TCRβ vs. CD11b. Exclua células mielóides CD11b+ e selecione a população de células TCRβ+ CD11b-T.
- Crie um portão de filha para a população TCRβ+ CD11b e selecione CD4 vs. CD8a. Identifique as células CD8- CD4+ T e as células CD4-T CD8+.
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Representative Results
As análises de citometria de fluxo apresentadas aqui revelaram com sucesso os principais subconjuntos das células mielóide e T (Figura 1 e Figura 2, respectivamente), e seu número total relativo por rato de forma altamente reprodutível (Figura 3).
A análise de citometria de fluxo das células mielóides mostrou que o CP é povoado por CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM, representando quase 80% das células imunes CD45+ no CP. Estes BAM foram divididos em duas populações diferentes de acordo com sua expressão de MHC-II: o IA-IE+ BAM que constituía o grupo principal (72% das células imunes CD45+), em linha com os dados publicados anteriormente7, e o IA-IE-BAM. O CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- população do macrófago epiplexo de Kolmer7,2 também foi identificado e representou apenas cerca de 1,2% das células imunes CD45+ CP, consistentemente com a literatura7. Entre as células imunes CD11b+ F4/80, duas populações diferentes de células Ly6C-IA-IE+ foram caracterizadas que provavelmente correspondem a células dendríticas, e que podem ser divididas em cd11bhigh CX3CR1low e CD11b+ CX3CR1- populações que constituíram cerca de 3,1% e 3,7% das células imunes CD45+ CP, respectivamente. CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- População celular Ly6C+, incluindo monócitos e neutrófilos, constituía apenas 0,5% das células imunes CD45+, de acordo com relatórios anteriores e atestando a alta eficácia da perfusão pbs3. Esses resultados são em grande parte consistentes com dados publicados anteriormente avaliando populações imunológicas cp por sequenciamento de RNA unicelular7.
A estratégia de análise e gating das células T destacou a presença da população menor de células CD45+ CD11b-TCRβ+. Entre elas, cerca de 30-50 células CD4+ CD4+ e CD8+ CD4-T por rato povoaram CP em condições fisiológicas, representando 1,3% e 0,9% das células imunes CD45+ CP, respectivamente. As células CD4+ eram ligeiramente mais abundantes do que as células CD8+T, o que é consistente com os resultados anteriores em termos de número e proporção21,30. Esta estratégia de gating também revelou uma população de células CD45+ CD11b-TCRβ+ CD4-CD8, que podem incluir células NKT, e um subconjunto de células T recentemente descritos 10,28,31. A análise de citometria de fluxo proposta e estratégias de gating permitiram a anotação do tipo celular de quase 90% das células imunes (CD45+) que compõem o PC do camundongo.
Figura 1: Análise da citometria de fluxo e estratégia de gating de células mielóides de CP de camundongos perfusados. As células são fechadas com base no tamanho usando FSC-A vs. SSC-A. As células singlet são selecionadas usando FSC-A vs. FSC-H. As células ao vivo são fechadas excluindo células DAPI+ no gráfico DAPI vs. FSC-A. As células imunes CD45+ são então identificadas em um lote CD45 vs. FSC-A. Gating CD11b vs. F4/80, as populações CD11b+ F4/80+ e CD11b+ F4/80- são selecionadas. Gating CD11b+ população F4/80+ usando CX3CR1 vs. IA-IE, tanto o CD11b+ F4/80hi CX3CR1+ IA-IE+ BAM quanto as populações CX3CR1+ IA-IE- são determinadas. Esta última população é então fechada usando F4/80 vs. CD11b para separar melhor o CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE-BAM e CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Macrófagos epiplexo de Kolmer. Gating Ly6C vs. IA-IE no CD11b+ F4/80-, ambas células CD11b+ F4/80- IA-IE-Ly6C+ que correspondem principalmente a monócitos e neutrófilos e células CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- células que provavelmente representam células dendriticas populacionais. As células CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C são fechadas usando células CD11b vs. CX3CR1 permitindo a identificação de células CD11bigh CX3CR1low e CD11b+ CX3CR1. Se não especificado, valores abaixo de cada população fechada representam a frequência da população-mãe. oi: alto; int: intermediário; lo: baixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise da citometria de fluxo e estratégia de gating de células T de CP de camundongos perfumados. As células são fechadas com base no tamanho usando FSC-A vs. SSC-A. As células únicas são selecionadas usando FSC-A vs. FSC-H. As células vivas são identificadas excluindo células DAPI+ no gráfico DAPI vs. FSC-A. As células imunes CD45+ são então fechadas em um lote CD45 vs. FSC-A. Gating CD11b vs. TCRβ, CD11b-TCRβ+ são selecionados. Gating CD4 vs. CD8, as proporções das células CD8- CD4+ e CD4- CD8+ T são determinadas. Se não especificado, valores abaixo de cada população fechada representam a frequência da população-mãe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Números dos principais subconjuntos de células imunes no CP por rato. Média do número total de células por rato dos diferentes subconjuntos imunológicos identificados nos quatro CP agrupados. Representação: Média + desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Estudos com o objetivo de entender as contribuições imunológicas para a homeostase cerebral e doença têm focado principalmente em células residentes dentro do parenchyma cerebral, negligenciando fronteiras cerebrais como o PC, que são, no entanto, contribuintes cruciais para a função cerebral2,3. A análise das populações de células imunes no PC é desafiadora devido ao pequeno tamanho de CP, baixo número de células imunes residentes e acesso complicado a esse tecido. A citometria de fluxo realizada em células imunes cerebrais totais (CD45+) não permite a caracterização das raras populações imunes que residem no PC. Para caracterizar a composição imune do PC com alta precisão, foram realizadas análises de citometria de fluxo em CP dissecadas de camundongos com perfusão de PBS. Essa abordagem permite a exclusão de células CD45+ circulantes e células CP CD45, como pericítos, células endoteliais e epiteliais32. As estratégias de gating com foco nas populações de células mielóides e T identificam os principais subconjuntos imunológicos de CP.
Um passo crítico do protocolo atual é a perfusão pbs. Como as células imunes cp são raras, a contaminação sanguínea pode mascarar completamente sua heterogeneidade local. A descoloração hepática e cerebral é sempre verificada como controle, e, portanto, a contaminação sanguínea é mínima. Consistentemente, CD11b+ F4/80- Ly6C+, que inclui monócitos e neutrófilos presentes no sangue em vez do cérebro em condições não inflamatórias3, representou apenas 0,5% das células CD45+ , demonstrando uma alta eficácia da perfusão de PBS. Outro controle útil para a eficácia da perfusão da PBS pode ser a incorporação de anticorpos contra Ter119, um marcador específico para eritrócitos. Finalmente, uma análise adicional do CP das seções cerebrais do camundongo com perfusão de PBS por imunossécimento e microscopia também pode ser útil para verificar se quaisquer células imunes sanguíneas que podem ser fortemente aderentes ao endotélio resistiram à perfusão pbs e permanecem presas ao lúmen da vasculatura.
A estratégia de gating mieloide revelou duas populações de macrófagos: CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+/-BAM e CD11b+ F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- As células epiplexos de Kolmer, que expressam altos níveis de CD11b e baixos níveis de F4/807. Os portões das células epiplexas de Kolmer7,20 e IA-IE-BAM não foram claramente separados usando marcadores CD11b e F4/80. A incorporação do marcador CD206 nesta estratégia de gating pode ajudar a diferenciar melhor o CD206+ IA-IE-BAM das células epiplexos de CD206low Kolmer7.
Quase 7% das células imunes cp pareciam ser CD11b+ F4/80- Ly6C-IA-IE+. Este subconjunto foi composto por duas populações de acordo com seus níveis de expressão CD11b e CX3CR1. Essas células provavelmente correspondem a células dendríticas, mas isso ainda não foi confirmado analisando sua expressão CD11c, seja por FACS3 ou imunofluorescência33. A população CD11b+ F4/80- Ly6C-IA-IE+ também provavelmente inclui células de mastro. A incorporação de anticorpos para a detecção de CD117 e c-kit na estratégia de gating ajudaria a distingui-los das células dendríticas CD11c+3,34. A proporção de células CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ entre células imunes CP foi determinada. No entanto, eles incluem monócitos e neutrófilos, e a adição do marcador Ly6G à estratégia de gating das células CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+ determinaria a razão de monócitos Ly6G-Ly6G+ para neutrófilos Ly6G+. Além da população CD45+ CD11b-TCRβ+, a estratégia de gating em populações CD45+ CD11b pode ser enriquecida usando marcadores NK1.1 e CD11c para identificar células NK, TCRγδ para analisar células γδ T, CD19 e/ou B220 para caracterizar células B, e CD138 para identificar células plasmáticas3. A expressão dos genes dos repórteres também pode ser incluída nesta análise. Por exemplo, o uso de camundongos transgênicos Foxp3-GFP pode ser útil para identificar células T residentes em CP (Treg)3,30. Por fim, este protocolo também pode incorporar coloração intracelular de fatores de transcrição ou citocinas21.
Considerando que as células imunes do parênquim cerebral têm sido extensivamente estudadas, muito menos se sabe sobre células imunes que povoam barreiras cerebrais, como o CP3,35,36. CP em camundongos são pequenos tecidos localizados em quatro áreas diferentes do cérebro, e seu isolamento requer uma microdisseção bastante complexa. Por causa disso, o PC foi estudado principalmente por meio de imagens. A coloração de células imunes CP de tecido dissecado de CP inteiro ou de seções cerebrais seguidas de análise microscópica proporcionou grandes avanços na compreensão dos mecanismos imunológicos cp14,15,21,22,26,27,29,30,33 . No entanto, este método não permite uma análise extensiva da diversidade de células imunes cp, pois apenas quatro a seis marcadores podem ser analisados por vez. Além disso, algumas subpopulações como células T CD4+ ou CD8+ são bastante raras no CP, e a análise quantitativa de seus fenótipos com microscopia seria desafiadora. A abordagem da citometria de fluxo permite a análise de dezenas de marcadores em paralelo para cada célula imune, fornecendo uma ferramenta mais adequada para avaliação quantitativa da composição imunológica cp.
Mais recentemente, a tecnologia transcriômica de núcleos únicos (snRNA-seq) surgiu como um método poderoso para estudar a heterogeneidade CP10,28. No entanto, não é adequado para analisar células imunes CP, pois constituem apenas uma pequena fração das células CP. Uma vez que o snRNA-seq amostras as células na proporção que estão presentes no tecido, as células imunes são sub-representadas no snRNA-seq, e seus baixos números representam um obstáculo para análises aprofundadas10,28.
A transcrição unicelular (scRNA-seq) foi recentemente aplicada para mapear precisamente a heterogeneidade das células imunes isoladas CP7. Embora o scRNA-seq seja bastante complexo e caro de ser realizado, a citometria de fluxo pode servir como uma maneira mais acessível de levantamento de subpopulações imunológicas no CP. Por fim, este protocolo pode servir como parte de um protocolo de triagem celular, onde os subtipos selecionados das células são classificados usando FACS para análise com métodos moleculares, como análise scRNA-seq ou RNA em massa.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a ajuda do Institut Pasteur Animalerie Centrale e dos membros das instalações da CB-UTechS. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Institut Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
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