Summary
Denna studie använder flödescytometri och två olika gatingstrategier på isolerade perfuserade möss hjärnkoroidplexus; detta protokoll identifierar de viktigaste immuncellsdelmängderna som fyller denna hjärnstruktur.
Abstract
Hjärnan betraktas inte längre som ett organ som fungerar isolerat; ackumulerande bevis tyder på att förändringar i det perifera immunsystemet indirekt kan forma hjärnans funktion. Vid gränssnittet mellan hjärnan och den systemiska cirkulationen har choroid plexus (CP), som utgör blod-cerebrospinalvätskebarriären, lyfts fram som en nyckelplats för periferi-till-hjärnkommunikation. CP producerar cerebrospinalvätskan, neurotrofa faktorer och signalmolekyler som kan forma hjärnans homeostas. CP är också en aktiv immunologisk nisch. I motsats till hjärnparenkymen, som huvudsakligen befolkas av mikroglia under fysiologiska förhållanden, sammanfattar heterogeniteten hos CP-immunceller den mångfald som finns i andra perifera organ. CP-immuncellens mångfald och aktivitet förändras med åldrande, stress och sjukdom och modulerar aktiviteten hos CP-epitelet och därigenom indirekt formar hjärnans funktion. Målet med detta protokoll är att isolera murin CP och identifiera cirka 90% av de viktigaste immundelmängderna som fyller dem. Denna metod är ett verktyg för att karakterisera CP-immunceller och förstå deras funktion i orkestrering av periferi-till-hjärnkommunikation. Det föreslagna protokollet kan hjälpa till att dechiffrera hur CP-immunceller indirekt modulerar hjärnans funktion i hälsa och över olika sjukdomstillstånd.
Introduction
Sedan upptäckten av blod-hjärnbarriären av Paul Erhlich i slutet av 1800-talet har hjärnan ansetts vara praktiskt taget separerad från de andra organen och blodomloppet. Ändå har det senaste decenniet sett framväxten av konceptet att hjärnans funktion formas av olika biologiska faktorer, såsom tarmmikrobiota och systemiska immunceller och signaler1,2,3,4. Parallellt har andra hjärngränser som hjärnhinnor och koroidplexus (CP) identifierats som gränssnitt för aktivt immun-hjärnkorspalt snarare än inerta barriärvävnader5,6,7,8.
CP utgör blod-cerebrospinalvätskebarriären, en av gränserna som skiljer hjärnan och periferin. De är belägna i var och en av hjärnans fyra ventriklar, dvs den tredje, den fjärde och båda laterala ventriklarna, och ligger intill områden som är involverade i neurogenes såsom hippocampusens subventrikulära zon och subgranulära zon3. Strukturellt består CP av ett nätverk av fenestrated blodkapillärer inneslutna av ett monolager av epitelceller, vilka är sammankopplade med täta och vidhäftande korsningar9,10. Viktiga fysiologiska roller i CP-epitelet involverar produktion av cerebrospinalvätska, som spolar hjärnan från avfallsmetaboliter och proteinaggregat, och produktion och kontrollerad blod-till-hjärnpassage av olika signalmolekyler inklusive hormoner och neurotrofa faktorer11,12,13. Utsöndrade molekyler från CP formar hjärnans aktivitet, dvs genom att modulera neurogenes och mikrogliafunktion14,15,16,17,18,19, vilket gör CP avgörande för hjärnans homeostas. CP engagerar sig också i olika immunaktiviteter; Medan den huvudsakliga immuncellstypen i hjärnparenkymen under icke-patologiska förhållanden är mikroglia, är mångfalden av CP-immuncellpopulationer lika bred som i perifera organ3,7, vilket tyder på att olika kanaler för immunreglering och signalering är i arbete vid CP.
Utrymmet mellan endotel- och epitelcellerna, CP-stroma, befolkas huvudsakligen av gränsassocierade makrofager (BAM), som uttrycker proinflammatoriska cytokiner och molekyler relaterade till antigenpresentation som svar på inflammatoriska signaler3. En annan subtyp av makrofager, Kolmers epiplexusceller, finns på den apikala ytan av CP-epitelet20. CP stroma är också en nisch för dendritiska celler, B-celler, mastceller, basofiler, neutrofiler, medfödda lymfoida celler och T-celler som mestadels är effektorminne t-celler som kan känna igen antigener i centrala nervsystemet7,21,22,23,24. Dessutom förändras sammansättningen och aktiviteten hos immuncellspopulationer vid CP vid systemisk störning eller hjärnstörning, till exempel under åldrande10,14,15,21,25, mikrobiotastörning7, stress26 och sjukdom27,28. I synnerhet föreslogs dessa förändringar för att indirekt forma hjärnans funktion, dvs ett skifte av CP CD4 + T-celler mot Th2-inflammation uppträder i hjärnans åldrande och utlöser immunsignalering från CP som kan forma åldringsassocierad kognitiv nedgång14,15,21,25,29 . Att belysa egenskaperna hos CP-immuncellerna skulle därför vara avgörande för att bättre förstå deras reglerande funktion på CP-epitelfysiologi och utsöndring och därigenom dechiffrera deras indirekta inverkan på hjärnans funktion under friska och sjukdomsförhållanden.
CP är små strukturer som bara innehåller ett fåtal immunceller. Deras isolering kräver mikrodissektion efter ett preliminärt steg av perfusion; immunceller i blodet skulle annars utgöra stora föroreningar. Detta protokoll syftar till att karakterisera myeloida och T-celldelmängder av CP med hjälp av flödescytometri. Denna metod identifierar cirka 90% av immuncellpopulationerna som komponerar mus-CP under icke-inflammatoriska tillstånd, i enlighet med nyligen publicerade verk som använder andra metoder för att dissekera immun-CP-heterogenitet7,10,28. Detta protokoll kan tillämpas för att karakterisera förändringar i CP-immuncellsfacket med sjukdom och andra experimentella paradigmer in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden överensstämde med Europeiska kommissionens riktlinjer för hantering av försöksdjur, direktiv 86/609/EEG. De godkändes av de etiska kommittéerna nr 59, av Cetea/CEEA nr 089, med nummer dap210067 och APAFIS #32382-2021070917055505 v1.
1. Beredning av materialen
- Förvara alla antikroppar (materialtabell) vid 4 °C, skyddade mot ljusexponering.
- DAPI-stamlösning (1 mg/ml): Återsuspendera pulvret i PBS-/- (materialtabell), alikvot och förvara vid -20 °C.
- DAPI-arbetslösning (0,1 mg/ml): Späd DAPI-stamlösning med PBS-/- i förhållandet 1:10.
- Magnetisk aktiverad cellsorteringsbuffert (MACS): Förbered 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och 0,5% bovint serumalbumin (BSA) (materialtabell) i PBS-/-.
- Kollagenas IV-stamlösning (20 U/μL): Återsuspendera pulvret i PBS+/+ (materialtabell), alikvot och förvara vid -20 °C.
OBS: Kollagenas IV kräver att MgCl2 är fullt aktiv; frys inte-tina Kollagenas IV-lösning. - Anestesi-analgetisk lösning: Blanda 150 μL ketamin (150 mg/kg), 25 μl xylazin (5 mg/kg) och 330 μl buprecare (0,1 mg/kg) i 1 ml PBS-/-.
OBS: Förbered anestesi-smärtstillande lösning extempore och håll den inte längre än en dag. - Heparinlösning (100 U/ml): Resuspendera pulvret i PBS-/-.
- Förbered infusionsinsatsen som ansluter ett rör till en karaff Erlenmeyer fylld med PBS-/-. Anslut en 23 G nål till infusionsrörets extremitet. Öppna infusionsinsatsen och låt PBS löpa tills det inte finns några bubblor i röret.
- Förbered kikarluppen utrustad med ett ljus.
2. Hölje av C57BL/6 möss
- För analys av CP-myeloida eller T-celler, använd fyra möss för var och en och poola de fyra CP (två från varje lateral ventrikel, den tredje ventrikeln och den fjärde ventrikeln CP; för åtta möss totalt). Att inte slå samman CP medför risken att inte upptäcka de sällsynta immunpopulationerna i CP på grund av deras låga överflöd.
- Låt mössen acklimatisera sig i minst 7 dagar före experiment. Håll mössen under patogenfria förhållanden vid konstant temperatur och fuktighet, i en 12/12 h eller 14/10 h ljus / mörk cykel, med vatten och standardpelletsmat ad libitum.
3. PBS-perfusion och hjärndissektion
- Vikta varje mus och injicera 10 μL/g av den anestesi-analgetiska blandningslösningen (steg 1.6) intraperitonealt.
- Vänta cirka 30 minuter för effektiv analgesi (kontrollera om det finns anestesidjup genom att klämma fast musens siffror).
- Placera den sövda musen platt på ryggen, på dissektionsstödet och tejpa handflatorna på dissektionsstödet.
- Kläm fast djurets hud med pincett och använd sax, öppna buken, membranet och bröstkorgen för att exponera hjärtat.
OBS: När bröstkorgen öppnas blir hjärnan anoxisk. Man måste gå exakt och snabbt igenom nästa steg i perfusionen. - Injicera 20 μL 100 U / ml heparinlösning direkt i vänster kammare.
- Med fin sax, gör ett snitt på minst 3 mm i höger atrium så att blodet kan strömma ut ur kroppen.
- Omedelbart efter, sätt in 23 G-nålen placerad vid infusionsrörets extremitet genom spetsen av vänster kammare.
- Öppna infusionssystemet maximalt och vänta på fullständig perfusion: Med en 23 G nål, med en flödeshastighet på cirka 6 ml / min, är perfusionen klar på 3 minuter.
OBS: Den jämna missfärgningen av organ som levern intygar perfusionseffekten. - Stäng infusionssystemet och ta bort nålen från hjärtkammaren.
- Ta bort tejpen från musens handflator. Placera musen i ventralt läge.
- Klämma djurets hud med pincett och använd sax, ta bort huden på toppen av huvudet från ögonen till öronen.
- Med hjälp av sax skär du skallen först mellan ögonen och sedan i sidled från varje öga till ryggmärgen strax ovanför massörmusklerna. För detta, använd saxens extremitet och fortsätt försiktigt för att undvika att skada hjärnan med saxen.
- Öppna skallen med pincett genom att klämma fast den från extremiteten mellan ögonen.
- Använd sax för att klippa ryggmärgen och extrahera hjärnan med pincett, placera sina två punkter på hjärnans laterala sida för att luta den och placera den i en petriskål fylld med iskall PBS +/+. CP samlas sedan omedelbart in.
OBS: Kontrollera om det finns missfärgning av hjärnan för att verifiera perfusionseffekten.
4. Dissektion av Choroid Plexus från hjärnan
- Placera hjärnans dorsala sida uppåt i petriskålen och under målen för kikarlupparna.
- Med hjälp av pincett för att hålla hjärnan på plats, sätt in de två ändarna av en annan pincett ner genom mittlinjen mellan halvklotet.
- Använd pincetten för att dra cortex med callosum och hippocampus bort från septum, exponera lateral ventrikel och en del av den tredje ventrikeln.
- Identifiera den laterala CP som en lång slöja som fodrar den laterala ventrikeln som blossar i båda ändarna. Använd de två ändarna av en tunn tång för att fånga den laterala CP. Var försiktig med att samla den triangulära bakre delen som kan döljas av hippocampusens bakre veck.
- Dra cortex med corpus callosum och hippocampus på den kontralaterala halvklotet bort från septum för att exponera hela tredje ventrikeln och motsatt lateral ventrikel.
- Samla med fina pincett den tredje CP, som kan identifieras som en kort struktur med en granulär ytaspekt.
- Samla den andra laterala CP.
- Sätt in de två ändarna av en pincett ner mellan lillhjärnan och mitthjärnan. Lossa cerebellum från pons och medulla för att exponera den fjärde ventrikeln.
- Identifiera den fjärde CP som en lång globulär struktur med en granulär ytaspekt som leder den fjärde ventrikeln från den laterala högra änden till vänster ände mellan cerebellum och medulla. Samla den fjärde CP med fina pincett.
OBS: Silan-basbeläggning av pincett kan förhindra klibbighet av CP på pincett. - Upprepa steg 3.1-4.9 för var och en av de andra sju mössen. Under tiden kan den uppsamlade CP förvaras temporärt i ett rör placerat på is.
5. Beredning av prover för flödescytometrianalys
- Fyll röret som innehåller all dissekerad CP till 750 μL PBS+/+.
OBS: Avsättningen av dissekerad CP med tunna pincett i röret ger en liten volym PBS +/+. Slutför hellre den befintliga volymen till 750 μL än att ta bort och ersätta den med färsk 750 μL PBS +/+ för att undvika en eventuell förlust av CP-vävnaden. - Tillsätt 15 μL 20 U/μL kollagenas IV stamlösning (se steg 1.5) för en slutlig koncentration på 400 U/ml.
OBS: DNAse I (150 μg / ml) kan förhindra överdriven cellklumpning. - Inkubera CP med kollagenas IV vid 37 °C under mild omrörning (300 varv/min) i 45 min.
- Pipettera försiktigt upp och ner cirka 10 gånger för att slutföra CP-dissociationen.
- Fyll CP-röret till 1,5 ml med MACS-buffert (se receptsteg 1.4) för att stoppa kollagenas IV-aktiviteten.
OBS: Kollagenas IV-aktivitet stoppas vid låg temperatur och hämmas av serumalbumin. - Centrifugera cellerna vid 500 x g, i 5 min, vid 4 °C. Kassera supernatanten och tvätta cellerna med 1,5 ml MACS-buffert.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 min, vid 4 °C. Kassera supernatant- och återsuspendcellerna i 220 μL MACS-buffert.
- Separera en alikvot på 10 μL från cellsuspensionen som ska användas som ofärgad kontroll (nästa steg 5.18).
- Separera en alikvot på 10 μL från cellsuspensionen som ska användas som DAPI-monofärgad kontroll (nästa steg 5.12).
- Förinkubera resterande 200 μL med antimus-CD16/CD32-blockerande antikropp (1:100) i 20 min, vid 4 °C, för att blockera ospecifika Fc-medierade interaktioner.
- Dela cellerna i två 100 μL-rör (en för analys av myeloida celler, den andra för T-cellanalys) (nästa steg 5.14).
- Ta provet med 10 μL celler för DAPI-monofärgad kontroll (steg 5.9) och fyll det upp till 100 μL med MACS-buffert (nästa steg 5.14).
- Förbered elva nya rör som innehåller 100 μL MACS för antikroppen monofärgad (steg 5.14.4) och alla färgade kontroller (steg 5.14.5) och tillsätt en droppe kompensationpärlor i varje.
OBS: Kompensationskontrollerna gör det möjligt att ställa in spänningen för fluorescerande detektionslaser och bedöma den potentiella ospecifika signaldetekteringen av fluorescerande färgämne i de andra kanalerna som kommer att kompenseras ytterligare. - Antikroppsinkubation av prover:
- Myeloida prov: Lägg till 0,1 mg/ml DAPI (1:100) (se steg 1.3), FITC antimus CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 antimus-CD11b (1:100), APC-musskydd CX3CR1 (1:100), BV711 antimus Ly6C (1:100), PE-mus-antimus F4/80 (1:100) och APC-Cy7 antimus IA-IE (1:100).
- T-celler prov: Lägg till 0,1 mg / ml DAPI (1: 100), FITC anti-mus CD45 (1: 100), PE-Dazzle 594 anti-mus CD11b (1: 100), APC anti-mus TCRβ (1: 100), PE anti-mus CD8a (1: 100) och APC-Cy7 anti-mus CD4 (1:50).
- DAPI-monofärgad kontroll (från steg 5.12): Lägg till 0,1 mg/ml DAPI (1:100).
- Antikroppsmonofärgade kompensationspärlor: Lägg till var och en av de nio tidigare använda antikropparna för myeloida och T-cellprover (samma utspädning), separat (en för varje rör) till de nio rören som innehåller pärlorna.
OBS: De monofärgade kompensationskontrollerna gör det möjligt att bestämma positiva fluorescenstoppar för var och en av de använda fluorescerande markörerna under kompensationssteget. Analysatorn kommer att jämföra dem med den negativa signalen som observerats i de ofärgade kontroll-CP-cellerna. - Antikroppsfärgade kompensationspäralor: Lägg till alla antikroppar som används för myeloisk färgning till ett rör och de som används för T-celler som färgar till en annan.
OBS: De allfärgade kompensationskontrollerna gör det möjligt att ställa in spänningen för varje fluorescerande laserdetektering och bedöma den potentiella ospecifika signaldetekteringen av fluorescerande färgämne i de andra kanalerna. - Inkubera i 30-45 min på is, skyddad från ljusexponering.
- Fyll alla rör upp till 1,5 ml med MACS-buffert. Centrifugera cellerna och kompensationspärlorna vid 500 x g, i 5 min, vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och tvätta cellerna och kompensationspärlorna i 1,5 ml MACS-buffert.
- Centrifugera cellerna och kompensationspärlorna vid 500 x g, i 5 min, vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- Resuspend cellerna och kompensationspärlorna i 500 μL MACS-buffert. Fyll ofärgat reglage (steg 5.8) upp till 500 μL med MACS-buffert.
- Filtrera varje rör med CP-celler genom en 70 μm sil (ofärgad CP, DAPI monofärgad kontroll och myeloida och T-cellprover).
6. Flödescytometri
OBS: Flödescytometern som används i detta protokoll är utrustad med följande 5 lasrar: en 355 nm UV-laser, en 405 nm violett laser, en 488 nm blå laser, en 561 nm gulgrön laser och en 637 nm röd laser.
- Utför de dagliga kvalitetskontrollkontrollerna på cytometern med hjälp av cytometerinställningen, spårningsgränssnittet (CST) och CST-kontrollspärlorna för att säkerställa konsekvens mellan analyser, instrumentkvalitet och konsekventa målfluorescensintensiteter.
- Om du vill ställa in flödescytometriexperimentet skapar du ett nytt experiment med bivariata diagram och histogram. Se till att ett framåtriktad spridningsområde (FSC-A) och sidospridningsområde (SSC-A) inkluderas samt histogramdiagram för varje färg för att övervaka förvärvet.
- Definiera cellmorfologin genom att ställa in PMT-spänningen för FSC-A- och SSC-A-parametrar på ofärgade CP-celler.
- Definiera spänningarna för varje fluorescerande markör genom att ställa in fluorokromernas negativa toppar på ofärgade kontroll-CP-celler och fluorokromernas positiva toppar med hjälp av kompensationspärlor färgade med alla antikroppar och se till att detektorsignalerna inte är utanför skalan och inte är för starkt korsdecenserade i andra kanaler.
- Skapa en kompensationsmatris för att analysera var och en av kompensationskontrollerna för en färg. Efter att ha gating på lämpliga FSC-A / SSC-A-populationer, kontrollera enfärgade kontroller på histogramdiagram och registrera kompensationskontroller. Efter inspelning av alla enkelfärgade prover, beräkna kompensationsmatrisen.
- Registrera alla händelser som upptäckts för både myeloida och T-cellpopulationer.
7. CP myeloida celler gating
- Välj FSC-A jämfört med SSC-A och grind för celler (baserat på storlek).
- Skapa en dottergrind för enskilda celler med FSC-A kontra framåtriktad spridningshöjd (FSC-H).
- Skapa en dotterport för levande celler med DAPI jämfört med FSC-A för att utesluta DAPI+- celler.
- Skapa en dottergrind för CD45+ immunceller med CD45 vs. FSC-A.
- Skapa en dottergrind från CD45+- cellerna och välj CD11b vs. F4/80, identifiera följande två grupper: CD11b+ F4/80+ och CD11b+ F4/80- populationerna (nästa steg 7.8).
- Skapa en dottergrind för CD11b+ F4/80+-celler och välj CX3CR1 jämfört med IA-IE. Identifiera både CX3CR1+ IA-IE+ BAM som vidare betecknas som CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM och CX3CR1+ IA-IE-makrofager.
- Skapa en dottergrind för CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE-makrofager och välj F4/80 vs. CD11b. Identifiera både CD11bhigh F4/80intermediate och CD11b+ F4/80high populations som vidare kallas CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmers epiplexus makrofager och CD11b+ F4/80high CX3 CR1+ IA-IE- BAM, respektive.
OBS: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- och CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE-celler verkade lite blandade mellan F4/80intermediate-F4/80high och CD11bhigh-CD11b+ nivåer. - Från CD11b + F4/80- populationen (steg 7.5), grind för Ly6C vs. IA-IE. Välj både IA-IE + Ly6C-population och IA-IE-Ly6C + -celler som huvudsakligen motsvarar monocyter / neutrofiler.
OBS: En hög närvaro av IA-IE-Ly6C + -celler återspeglar sannolikt problem i perfusionseffekten hos djur utan inflammatoriskt tillstånd; deras överflöd bör vara lågt. - Skapa en dottergrind för CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C-population och välj CD11b vs. CX3CR1, identifiera både CD11bhigh CX3CR1low- och CD11b+ CX3CR1-populationer.
8. CP T-celler gating
- Välj FSC-A jämfört med SSC-A och grind för celler (baserat på storlek).
- Skapa en dottergrind för enskilda celler med FSC-A kontra framåtriktad spridningshöjd (FSC-H).
- Skapa en dotterport för levande celler med DAPI jämfört med FSC-A för att utesluta DAPI+- celler.
- Skapa en dottergrind för CD45+ immunceller med CD45 vs. FSC-A.
- Skapa en dottergrind från CD45+-cellerna och välj TCRβ vs. CD11b. Exkludera CD11b+ myeloida celler och välj TCRβ+ CD11b-T-cellpopulation.
- Skapa en dottergrind för TCRβ+ CD11b- population och välj CD4 vs. CD8a. Identifiera både CD8- CD4 + T-celler och CD8 + CD4-T-celler .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödescytometrianalyserna som presenteras här avslöjade framgångsrikt de viktigaste delmängderna av myeloida och T-celler (figur 1 respektive figur 2) och deras relativa totala antal per mus på ett mycket reproducerbart sätt (figur 3).
Flödescytometrianalysen av myeloida celler visade att CP befolkas av CD11b + CX3CR1 + F4 / 80high BAM, vilket representerar nästan 80% av CD45 + immuncellerna vid CP. Dessa BAM delades in i två olika populationer beroende på deras uttryck av MHC-II: IA-IE + BAM som utgjorde huvudgruppen (72% av CD45+ immuncellerna), i linje med tidigare publicerade data7, och IA-IE-BAM. CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE-populationen av Kolmers epiplexus makrofager7,2 identifierades också och representerade endast cirka 1,2% av CD45+ CP-immuncellerna, i överensstämmelse med litteraturen7. Bland CD11b + F4/80-immuncellerna karakteriserades två olika populationer av Ly6C-IA-IE + -celler som sannolikt motsvarar dendritiska celler och som kan delas in i CD11bigh CX3CR1low och CD11b + CX3CR1- populationer som utgjorde cirka 3,1% respektive 3,7% av CD45 + CP-immuncellerna. CD45+ CD11b+ F4/80- IA-IE- Ly6C+-cellpopulation inklusive både monocyter och neutrofiler utgjorde endast 0,5 % av CD45+-immuncellerna i enlighet med tidigare rapporter och som intygar den höga effekten av PBS-perfusionen3. Dessa resultat överensstämmer till stor del med tidigare publicerade data som bedömer CP-immunpopulationer genom encells-RNA-sekvensering7.
Analys- och gatingstrategin för T-celler belyste närvaron av den mindre populationen av CD45 + CD11b- TCRβ + -celler. Bland dem befolkade cirka 30-50 CD8- CD4 + och CD8 + CD4- T-celler per mus CP under fysiologiska förhållanden, vilket motsvarar 1,3% respektive 0,9% av CD45 + CP-immuncellerna. CD4+ celler var något rikligare än CD8+ T-celler, vilket överensstämmer med tidigare resultat både vad gäller antal och andel21,30. Denna gatingstrategi avslöjade också en population av CD45 + CD11b - TCRβ + CD4- CD8-celler, som kan innefatta NKT-celler och en nyligen beskriven regulatorisk T-celldelmängd10,28,31. Den föreslagna flödescytometrianalysen och gatingstrategierna möjliggjorde celltypsannoteringen av nästan 90% av immuncellerna (CD45+) som komponerar musens CP.
Figur 1: Flödescytometrianalys och gatingstrategi för myeloida celler från CP hos perfuserade möss. Cellerna är gated baserat på storlek med FSC-A vs. SSC-A. Singletceller väljs med FSC-A jämfört med FSC-H. Levande celler är gated genom att utesluta DAPI+ -celler på DAPI kontra FSC-A-diagrammet. CD45+ immunceller identifieras sedan på en CD45 vs. FSC-A-plot. Gating CD11b vs. F4/80, CD11b + F4/ 80+ och CD11b + F4/80- populationerna väljs. Gating CD11b + F4/80+ population med CX3CR1 vs. IA-IE, både CD11b + F4 / 80hi CX3CR1 + IA-IE + BAM och CX3CR1 + IA-IE-populationerna bestäms. Denna senare population är sedan gated med F4/80 vs. CD11b för att bättre separera CD11b + F4 / 80high CX3CR1 + IA-IE- BAM och CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1 + IA-IE- Kolmers epiplexus makrofager. Gating Ly6C vs. IA-IE på CD11b + F4 / 80-, både CD11b + F4 / 80- IA-IE- Ly6C + -celler som huvudsakligen motsvarar monocyter och neutrofiler och CD11b + F4 / 80- IA-IE + Ly6C-celler som sannolikt representerar dendritiska cellpopulationer väljs. CD11b + F4 / 80- IA-IE + Ly6C-celler är gated med CD11b vs CX3CR1 vilket möjliggör identifiering av CD11bhigh CX3CR1low och CD11b + CX3CR1- celler. Om inget anges representerar värden under varje gated population frekvensen för den överordnade populationen. Hej: hög; int: mellanliggande; lo: låg. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Flödescytometrianalys och gatingstrategi för T-celler från CP hos perfuserade möss. Cellerna är gated baserat på storlek med FSC-A vs. SSC-A. Enstaka celler väljs med FSC-A vs. FSC-H. Levande celler identifieras exklusive DAPI+- celler i DAPI jämfört med FSC-A-diagrammet. CD45+ immunceller är sedan gated på en CD45 vs. FSC-A plot. Gating CD11b vs. TCRβ, CD11b- TCRβ+ väljs. Gating CD4 vs. CD8, proportionerna av CD8- CD4 + och CD4- CD8 + T-celler bestäms. Om inget anges representerar värden under varje gated population frekvensen för den överordnade populationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Antal av de viktigaste immuncellsdelmängderna vid CP per mus. Medelvärde av det totala antalet celler per mus av de olika immunundergrupper som identifierats i de fyra CP som sammanförts tillsammans. Representation: Medelvärde + standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier som syftar till att förstå de immunologiska bidragen till hjärnans homeostas och sjukdom har främst fokuserat på celler som bor i hjärnparenkymen och försummar hjärngränser som CP, som ändå är avgörande bidragsgivare till hjärnans funktion2,3. Analysen av immuncellspopulationer vid CP är utmanande på grund av den lilla storleken på CP, lågt antal bosatta immunceller och komplicerad tillgång till denna vävnad. Flödescytometri utförd på totala hjärnimmunceller (CD45+) tillåter inte karakterisering av de sällsynta immunpopulationerna som finns i CP. För att karakterisera CP: s immunsammansättning med hög precision genomfördes flödescytometrianalyser på CP dissekerad från PBS-perfuserade möss. Detta tillvägagångssätt möjliggör uteslutning av cirkulerande CD45+-celler och CP CD45-celler såsom pericyter, endotel- och epitelceller32. Gatingstrategierna med fokus på myeloida och T-cellpopulationer identifierar de viktigaste CP-immunundergrupperna.
Ett kritiskt steg i det nuvarande protokollet är PBS-perfusionen. Eftersom CP-immuncellerna är sällsynta kan blodförorening helt maskera deras lokala heterogenitet. Missfärgning av lever och hjärna kontrolleras alltid som kontroll, och därför är blodföroreningen minimal. Konsekvent stod CD11b+ F4/80- Ly6C+, som inkluderar både monocyter och neutrofiler närvarande i blodet snarare än hjärnan vid icke-inflammatoriska tillstånd3, för endast 0,5 % av CD45+ -cellerna, vilket visade en hög effekt av PBS-perfusion. En annan användbar kontroll för PBS-perfusionseffekt kan vara införlivandet av antikroppar mot Ter119, en markör som är specifik för erytrocyter. Slutligen kan en ytterligare analys av CP från PBS-perfuserade mushjärnsektioner genom immunfärgning och mikroskopi också vara användbar för att verifiera om några blodimmunceller som kan vara starkt vidhäftande till endotelet har motstått PBS-perfusionen och förblir fästa vid vaskulaturens lumen.
Myeloida gating-strategin avslöjade två populationer av makrofager: CD11b + F4 / 80high CX3CR1 + IA-IE + / -BAM och CD11b + F4 / 80intermediate CX3CR1 + IA-IE- Kolmers epiplexusceller, som uttrycker höga nivåer av CD11b och låga nivåer av F4 / 807. Portarna till Kolmers epiplexusceller7,20 och IA-IE-BAM separerades inte tydligt med CD11b- och F4/80-markörer. Införlivande av CD206-markören i denna gatingstrategi kan bidra till att bättre skilja CD206 + IA-IE- BAM från CD206low Kolmers epiplexusceller7.
Nästan 7% av CP-immuncellerna verkade vara CD11b + F4 / 80- Ly6C- IA-IE +. Denna delmängd bestod av två populationer enligt deras nivåer av CD11b- och CX3CR1-uttryck. Dessa celler motsvarar sannolikt dendritiska celler, men detta återstår att bekräfta genom att analysera deras CD11c-uttryck antingen genom FACS3 eller immunofluorescens33. CD11b + F4 / 80- Ly6C- IA-IE + -populationen innehåller sannolikt också mastceller. Att införliva antikroppar för detektion av CD117 och c-kit i gatingstrategin skulle bidra till att skilja dem från CD11c + dendritiska celler3,34. Andelen CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C+-celler bland CP-immunceller bestämdes. De inkluderar emellertid både monocyter och neutrofiler, och tillsatsen av Ly6G-markören till gatingstrategin för CD45 + CD11b + F4 / 80 + Ly6C + -celler skulle bestämma förhållandet mellan Ly6G-monocyter och Ly6G + neutrofiler. Utöver den beskrivna CD45+ CD11b-TCRβ+-populationen kan gatingstrategin på CD45+ CD11b-populationer berikas med hjälp av NK1.1- och CD11c-markörer för att identifiera NK-celler, TCRγδ för att analysera γδ T-celler, CD19 och/eller B220 för att karakterisera B-celler och CD138 för att identifiera plasmaceller3. Uttryck av reportergener kan också inkluderas i denna analys. Att använda Foxp3-GFP transgena möss kan till exempel vara till hjälp för att identifiera CP-bosatta T-regulatoriska (Treg) celler3,30. Slutligen kan detta protokoll också innehålla intracellulär färgning av transkriptionsfaktorer eller cytokiner21.
Medan immuncellerna i hjärnparenkymet har studerats i stor utsträckning, är mycket mindre känt om immunceller som fyller hjärnbarriärer, såsom CP3,35,36. CP hos möss är små vävnader som ligger i fyra olika delar av hjärnan, och deras isolering kräver en ganska komplex mikrodissektion. På grund av detta studerades CP mestadels med hjälp av bildbehandling. Färgning av CP-immunceller från hel CP-dissekerad vävnad eller från hjärnsektioner följt av mikroskopisk analys gav stora framsteg i förståelsen av CP-immunmekanismer14,15,21,22,26,27,29,30,33 . Denna metod tillåter emellertid inte omfattande analys av CP-immuncellens mångfald eftersom endast fyra till sex markörer kan analyseras åt gången. Dessutom är vissa delpopulationer som CD4 + eller CD8 + T-celler ganska sällsynta vid CP, och kvantitativ analys av deras fenotyper med mikroskopi skulle vara utmanande. Flödescytometrimetoden möjliggör analys av tiotals markörer parallellt för varje immuncell, vilket ger ett bättre lämpat verktyg för kvantitativ bedömning av CP-immunkompositionen.
Mer nyligen kom transkriptomisk teknik med enstaka kärnor (snRNA-seq) ut som en kraftfull metod för att studera CP-heterogenitet10,28. Det är dock inte väl lämpat för att analysera CP-immunceller eftersom de endast utgör en liten bråkdel av CP-cellerna. Eftersom snRNA-seq tar prover på cellerna i den proportion de är närvarande i vävnaden är immuncellerna underrepresenterade i snRNA-seq, och deras låga antal utgör ett hinder för fördjupad analys10,28.
Encellstranskriptomik (scRNA-seq) har nyligen tillämpats för att exakt kartlägga immuncellsheterogeniteten hos isolerade CP-immunceller7. Medan scRNA-seq är ganska komplext och dyrt att utföra, kan flödescytometri fungera som ett mer tillgängligt sätt att kartlägga immunsubpopulationer vid CP. Slutligen kan detta protokoll fungera som en del av ett cellsorteringsprotokoll, där de valda subtyperna av celler sorteras med hjälp av FACS för analys med molekylära metoder, såsom scRNA-seq eller bulk RNA-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Institut Pasteur Animalerie Centrale och CB-UTechS-anläggningens medlemmar för deras hjälp. Detta arbete stöddes ekonomiskt av Institut Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
| Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
| APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
| APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
| APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
| BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
| EDTA | Ion chelator | ||
| fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
| FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
| Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
| FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
| forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
| Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
| PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
| PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
| PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
| PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
| PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
| Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
| thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
| Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |
References
- Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
- Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
- Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
- Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
- da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Schwarze, E. -W.
- Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
- Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
- Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
- Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
- Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
- Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
- Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
- Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
- Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
- Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
