Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء سرطان الخلايا الكبدية xenografts مع وبدون ربط الشريان الكبدي وإجراء التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني غير الغازية (PET) لنقص الأكسجة في الورم باستخدام [18 F] Fluoromisonidazole ([18 F] FMISO) و [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG).
Abstract
تمثل النماذج التجريبية قبل السريرية لسرطان الخلايا الكبدية (HCC) التي تلخص الأمراض البشرية أداة مهمة لدراسة تكوين الورم وتقييم الأساليب العلاجية الجديدة. يوفر التصوير غير الجراحي لكامل الجسم باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) رؤى مهمة حول الخصائص في الجسم الحي للأنسجة على المستوى الجزيئي في الوقت الفعلي. نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء xenograft لتقويم سرطان الكبد مع وبدون ربط الشريان الكبدي (HAL) للحث على نقص الأكسجة في الورم وتقييم استقلاب الورم في الجسم الحي باستخدام [18 F] فلوروميسونيدازول ([18 F] FMISO) و [18 F] فلوروديوكسي جلوكوز ([18F] FDG) التصوير بالرنين المقطعي بالإصدار البوزيتروني / الرنين المغناطيسي (MR). يمكن تصور نقص الأكسجة في الورم بسهولة باستخدام علامة نقص الأكسجة [18 F] FMISO ، ووجد أن امتصاص [18 F] FMISO كان أعلى في الفئران HCC التي خضعت ل HAL مقارنة بالمجموعة غير HAL ، في حين أن [18F] FDG لم يستطع التمييز بين نقص الأكسجة في الورم بين المجموعتين. أظهرت أورام HAL أيضا مستوى أعلى من تعبير العامل المحرض لنقص الأكسجة (HIF) -1α استجابة لنقص الأكسجة. أظهر القياس الكمي لأورام HAL زيادة بمقدار 2.3 ضعف في امتصاص [18F] FMISO بناء على نهج امتصاص القيمة الموحدة (SUV).
Introduction
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو سادس أكثر أنواع السرطان تشخيصا وثالث أكثر أسباب الوفاة شيوعا بسبب السرطان في جميع أنحاء العالم ، مع أكثر من 900,000 حالة جديدة و 800,000 حالة وفاة في عام 20201. عامل الخطر الرئيسي هو تليف الكبد ، والذي يحدث نتيجة للعدوى الفيروسية (فيروسات التهاب الكبد B و C) ، وتعاطي الكحول ، ومرض السكري ، والتهاب الكبد الدهني غير الكحولي2. إدارة سرطان الكبد معقدة إلى حد ما ، وتتوفر العديد من خيارات العلاج ، بما في ذلك الاستئصال الجراحي ، والاستئصال الحراري أو الكيميائي ، والزرع ، والانصمام الكيميائي عبر الشرايين ، والإشعاع ، والعلاج الكيميائي ، اعتمادا على مرحلة المرض 2,3. سرطان الكبد هو ورم مقاوم للعلاج الكيميائي مع تكرار المرض في ما يصل إلى 70 ٪ من المرضى بعد العلاج العلاجي2.
على الرغم من الدرجة العالية من عدم تجانس الورم ، يرتبط سرطان الكبد بنتيجتين شائعتين: (i) سرطان الكبد هو نقص الأكسجين للغاية ، و (ii) يرتبط نقص الأكسجة في الورم بزيادة عدوانية الورم وفشل العلاج. يؤدي الانتشار غير المنضبط لخلايا سرطان الكبد إلى ارتفاع معدل استهلاك الأكسجين الذي يسبق الأوعية الدموية ، مما يخلق بيئة دقيقة ناقصة الأكسجين. ثم يؤدي انخفاض مستويات الأكسجين داخل الورم إلى مجموعة من الاستجابات البيولوجية التي تؤثر على عدوانية الورم والاستجابة للعلاج. غالبا ما يتم التعرف على العوامل المسببة لنقص الأكسجة (HIFs) على أنها منظمات النسخ الأساسية في الاستجابة لنقص الأكسجة 2,3. وبالتالي ، فإن القدرة على اكتشاف نقص الأكسجة أمر بالغ الأهمية لتصور أنسجة الأورام وتحديد المواقع التي يتعذر الوصول إليها ، والتي تتطلب إجراءات غازية. كما أنه يساعد على فهم أفضل للتغيرات الجزيئية التي تؤدي إلى عدوانية الورم وتحسين نتائج علاج المريض.
يشيع استخدام التصوير الجزيئي باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) في تشخيص العديد من أنواع السرطان وتحديد مراحلها ، بما في ذلك سرطان الكبد. على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤدي الاستخدام المشترك لتصوير PET ثنائي التتبع الذي يتضمن [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG) و [11C] Acetate إلى زيادة الحساسية الكلية بشكل كبير في تشخيص سرطان الكبد 4,5. من ناحية أخرى ، يمكن تحقيق تصوير نقص الأكسجة باستخدام علامة نقص الأكسجين شائعة الاستخدام [18 F] فلوروميزونيدازول ([18F] FMISO). في الممارسة السريرية ، يعد التقييم غير الجراحي لنقص الأكسجة مهما للتمييز بين أنواع مختلفة من الأورام والمناطق لتخطيط العلاج الإشعاعي6.
أصبح التصوير قبل السريري أداة لا غنى عنها للتقييم غير الجراحي والطولي لنماذج الفئران للأمراض المختلفة. يمثل نموذج سرطان الكبد القوي والقابل للتكرار بدرجة كبيرة منصة مهمة للبحوث قبل السريرية والانتقالية في الفيزيولوجيا المرضية لسرطان الكبد البشري وتقييم العلاجات الجديدة. جنبا إلى جنب مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، يمكن توضيح السلوكيات في الجسم الحي لتوفير رؤى مهمة على المستوى الجزيئي لأي نقطة زمنية معينة. هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد الطعوم الخارجية لربط الشريان الكبدي (HAL) وتحليل استقلاب الورم في الجسم الحي باستخدام [18 F] FMISO و [18F] FDG PET / MR. إن دمج HAL يجعل نموذجا مناسبا لطعوم الفئران المعدلة وراثيا أو المستحثة كيميائيا لدراسة نقص الأكسجة في الورم في الجسم الحي ، حيث يمكن ل HAL أن يمنع بشكل فعال إمداد الدم الشرياني للحث على نقص الأكسجة داخل الورم 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس التلوين الكيميائي المناعي خارج الجسم الحي باستخدام بيمونيدازول ، يمكن تصور التغيرات في استقلاب الورم نتيجة لنقص الأكسجة بسهولة وقياسها بدقة غير جراحية باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، مما يتيح التقييم الطولي لاستجابة العلاج أو قياس ظهور المقاومة3،7،8 . تسمح طريقتنا الموضحة هنا بإنشاء نموذج قوي لنقص الأكسجين في سرطان الكبد جنبا إلى جنب مع المراقبة غير الغازية لنقص الأكسجة في الورم باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير بالرنين المغناطيسي لدراسة بيولوجيا سرطان الكبد في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات وفقا للجنة استخدام الحيوانات الحية في التدريس والبحث (CULATR) في مركز أبحاث الطب المقارن (CCMR) في جامعة هونغ كونغ ، وهو برنامج معتمد من قبل جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية (AAALAC). كانت الحيوانات المستخدمة في الدراسة إناث الفئران BALB / cAnN-nu (عارية) في عمر 6-8 أسابيع ، موزونة عند 20 جم ± 2 جم. تم توفير الطعام والماء حسب الطلب.
1. الحقن تحت الجلد لخطوط خلايا سرطان الكبد البشري
ملاحظة: MHCC97 هو خط خلايا HCC بشري يستخدم لإنشاء نموذج xenograft HCC تحت الجلد. يتم الحصول على خلايا MHCC97L من معهد سرطان الكبد ، مستشفى تشونغشان بجامعة فودان ، شنغهاي ، جمهورية الصين الشعبية9 ويتم توثيقها عن طريق التنميط القصير للتكرار الترادفي (STR).
- استزرع خلايا MHCC97L واحتفظ بها في وسط الاستزراع مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين وستربتومايسين في دورق زراعة الخلايا T-75 عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مزودة ب 5٪ CO2 (انظر جدول المواد). تغيير وسائل الإعلام ثقافة كل 2 أيام وحصاد الخلايا في التقاء 80٪ -90٪.
ملاحظة: رقم خلية البداية هو 1.5 × 10 6 خلايا ، ويتم استخدام الخلايا ضمن6-8 ممرات. - قم بتخزين وسائط الاستزراع وحمض التربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك (trypsin-EDTA) على حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى الاستخدام. قم بتسخين وسائط الاستزراع مسبقا إلى 37 درجة مئوية وتسخين التربسين-EDTA إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. راجع جدول المواد لجميع الكواشف والمواد الاستهلاكية المستخدمة في هذا القسم.
- إزالة الوسائط الثقافية. شطف طبقة الخلية مع 10 مل من المياه المالحة المخزنة بالفوسفات المعقم (DPBS ، انظر جدول المواد).
- أضف 5 مل من التربسين-EDTA إلى دورق الاستزراع واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية. افحص الخلايا تحت المجهر المقلوب عند تكبير 20x (انظر جدول المواد) حتى تشتت طبقة الخلية وتنفصل تماما عن القارورة. تأكد من عدم ترك الخلايا في التربسين-EDTA لأكثر من 15 دقيقة.
- أضف 5 مل من وسائط الثقافة إلى دورق الثقافة. نضح الخلايا عن طريق سحب الإصبع برفق. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي وقم بتدويره بسرعة 1107 × جم لمدة 5 دقائق (انظر جدول المواد).
- قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني. ماصة جيدا للحصول على تعليق خلية واحدة. حدد رقم الخلية باستخدام عداد الخلية الآلي (انظر جدول المواد) وقم بإعداد تعليق الخلية بتركيز 5 × 106 خلايا / مل في PBS.
- ارسم 200 ميكرولتر من تعليق الخلية بإبرة 25 جرام في حقنة سعة 1 مل. تحتوي كل حقنة على 1 × 106 خلايا MHCC97L (في 200 ميكرولتر). الحفاظ على حقنة على الجليد الرطب.
- تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق (i.p.) لخليط من الكيتامين (87.5 مجم / كجم) والزيلازين (12.5 مجم / كجم). تأكد من التخدير المناسب باستخدام منعكس قرصة إصبع القدم. تأكد من وضع مواد تشحيم العين على الماوس لمنع الجفاف والتكوين المحتمل لقرحة القرنية. ضع الماوس في وضع ضعيف على وسادة معقمة (انظر جدول المواد).
- تعقيم المنطقة الظهرية بالقرب من الجانب السفلي (إما الجانب الأيسر أو الأيمن) من الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول (انظر جدول المواد). ارفع الجلد باستخدام الملقط وأدخل الإبرة المائلة برفق تحت الجلد.
- دفع الإبرة 4-5 مم على طول المستوى تحت الجلد من موقع البزل لتجنب التسرب العرضي لتعليق الخلية من موقع الحقن عند سحب الإبرة. تأكد من أن إدخال الإبرة ليس عميقا جدا تحت الجلد ، مما قد يتسبب في تلف الأعضاء العرضي.
- حرر الملقط وقم بتفريغ محتويات المحقنة بعناية وببطء ، مع الحرص على عدم اختراق الجانب الآخر. اسحب الإبرة للتحقق من وجود انتفاخ في الحقن. ضع الماوس مرة أخرى في القفص جالسا فوق وسادة تدفئة تم تسخينها مسبقا للمساعدة في التعافي من التخدير واستعادة الحركة. استمر في مراقبة الماوس حتى يستيقظ الماوس تماما ويحافظ على الاستلقاء القصي.
- مراقبة نمو الورم ورفاهية الفأر على أساس أسبوعي. قم بقياس حجم الورم (V) باستخدام الفرجار (انظر جدول المواد). احسب وسجل حجم الورم باستخدام الصيغة التالية10:
V = (W 2× L) / 2
حيث W هو العرض و L هو طول الورم. - بين 4-6 أسابيع بعد الحقن ، تأكد من الحصول على حجم كبير من الورم تحت الجلد ، بين 800-1000 مم3. تأكد من أن الحمل الكلي للورم لا يتجاوز 10 ٪ من وزن الجسم.
2. زرع الكبد التقويمي وربط الشريان الكبدي
- قم بإعداد الكواشف والأدوات الجراحية التالية في خزانة السلامة البيولوجية المطهرة: 10 مل من وسائط الاستزراع في طبق ، 10٪ محلول بوفيدون اليود ، 70٪ إيثانول ، أدوات جراحية معقمة ، أي مقص حاد ، مقص زنبركي ، ملقط (منحني ناعم ومستقيم حاد) ، حامل إبرة ، شفرة مشرط ، 6-0 و 5-0 خياطة نايلون ، وسادة تدفئة.
- الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والتعامل معها فقط على مقعد معقم. توفير الرعاية الكافية والضرورية قبل وأثناء وبعد الجراحة للفئران طوال العمليات الجراحية (انظر الخطوات أدناه).
- لتخفيف الألم قبل الجراحة ، حقن الفأر بحقن تحت الجلد من البوبرينورفين (0.1 مجم / كجم) قبل 30 دقيقة على الأقل من بدء العملية الجراحية. للرعاية والإدارة بعد الجراحة ، حقن الماوس بحقن تحت الجلد من البوبرينورفين (0.1 مجم / كجم) لمدة 3 أيام متواصلة ، مرة كل 8-12 ساعة. راجع جدول المواد لجميع الكواشف والمواد الاستهلاكية المستخدمة في هذا القسم.
- القتل الرحيم للفأر الحامل للورم تحت الجلد بحقنة i.p. من بنتوباربيتال (330 مجم / كجم). قم بعمل شق على جلد موقع الورم باستخدام شفرة مشرط. استئصال كتلة الورم تحت الجلد ونقلها على الفور إلى وسائل الإعلام الثقافية. نفذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن.
- قطع كتلة الورم إلى 1 مم3 مكعبات ورم صغيرة باستخدام مقص جراحي حاد. الحفاظ على جميع مكعبات الورم في وسائل الإعلام الثقافية. تجنب استخدام المنطقة الأساسية من كتلة الورم تحت الجلد.
- تخدير الفأر الذي سيخضع لجراحة زرع الورم التقويمي اللاحقة بحقن i.p. لخليط من الكيتامين (87.5 مجم / كجم) والزيلازين (12.5 مجم / كجم). تأكد من انقضاء 30 دقيقة على الأقل بعد إعطاء البوبرينورفين قبل تخدير الماوس. تأكد من وضع مواد تشحيم العين على الماوس لتجنب الجفاف والتكوين المحتمل لقرحة القرنية.
- ضع الماوس في وضع ضعيف على وسادة معقمة أعلى وسادة تدفئة تم تسخينها مسبقا. مراقبة وتسجيل الحالة الفسيولوجية للفأر كل 15 دقيقة حتى نهاية العملية الجراحية.
- تمديد أطراف الماوس. قم بتثبيتها بشريط لاصق لزيادة تعرض البطن البطني والصدر. تعقيم كامل جلد البطن من الماوس مع محلول 10 ٪ من البوفيدون اليود ، تليها 70 ٪ من الإيثانول. قم بتقييم عمق التخدير للماوس عن طريق التحقق من عدم وجود استجابة لقرص إصبع القدم - منعكس سحب الدواسة.
- قم بإجراء بضع البطن عن طريق إجراء شق في خط الوسط يبلغ حوالي 10 مم للوصول إلى الصفاق باستخدام مقص حاد. قم بتثبيت وسحب عملية الخنجري نحو الرأس بالملقط وقم بتطبيق المبعدات تحت الضلعية لفتح المجال الجراحي. تأكد من إجراء شق مناسب لتمكين رؤية جراحية جيدة لموقع العملية.
- اسحب الفصوص المتوسطة واليسرى لأعلى باستخدام قطعة شاش مبللة. انقل الأمعاء خارج البطن إلى الجانب الأيسر من الماوس وقم بتغطيتها بقطعة شاش مبللة. إجراء ربط الشريان الكبدي (HAL) على الشريان الكبدي المشترك (CHA) ، والذي ينشأ من رأس البنكرياس إلى جذره في عنيق الكبد ، تحت مصباح مكبرة لتحسين التصور.
- اسحب الفص المتوسط والأيسر للخلف / لأسفل باستخدام مسحة شاش مبللة لكشف الفص الأيسر. قم بعمل شق يبلغ طوله وعمقه حوالي 2 مم على سطح الفص الأيسر بشفرة مشرط معقمة.
ملاحظة: من الممكن أيضا استخدام الفص المتوسط للكبد لزرع الورم لتقليل التمزقات العرضية أو التمزق بسبب الصدمة لأعضاء البطن المجاورة. - أدخل على الفور جزء الورم في شق الكبد مع ملقط معقمة. دفن الورم بحيث يجلس بشكل آمن في الكبد. ضع خياطة على شكل ثمانية مع خياطة من النايلون 6-0 على موقع الشق لضمان زرع جزء الورم بشكل صحيح في الكبد والإرقاء. قم بإجراء هذه العملية في أسرع وقت ممكن لتجنب النزيف المفرط. عند الانتهاء ، أغلق شق البطن بخيوط متقطعة 5-0.
- ضع الفأر مرة أخرى في القفص جالسا فوق وسادة تدفئة تم تسخينها مسبقا للمساعدة في التعافي من التخدير واستعادة رد الفعل الصحيح. استمر في مراقبة وتسجيل الحالة الفسيولوجية للفأر كل 15 دقيقة حتى يستيقظ الفأر تماما ويحافظ على الاستلقاء القصي.
- كرر الإجراء حتى تمر جميع الفئران بزراعة الورم التقويمي. توفير رعاية ما بعد الجراحة لجميع الفئران من خلال المراقبة المستمرة لحالتها الفسيولوجية يوميا لمدة 3 أيام بعد العملية الجراحية. يجب إعطاء البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) كل 8-12 ساعة.
3. إعداد معايرة PET / MR وسير العمل
ملاحظة: يتم إجراء التصوير باستخدام نظام PET / MR 3T قبل السريري (انظر جدول المواد).
- استخدم 5٪ إيزوفلوران (1 لتر / دقيقة O2 طبي) لتخدير الفأر في غرفة الحث. لكل مسح ، ضع الماوس المخدر بعناية على سرير تصوير مع تسخين مستمر ؛ أولا ، المسح الضوئي باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (عرض الكشافة) كمرجع تشريحي لمسح [18 F] FMISO أو [18F] FDG PET ، متبوعا بالتصوير بالرنين المغناطيسي المرجعي التشريحي.
- قم بإنشاء سير عمل تصوير PET / MR متسلسل في البرنامج (انظر جدول المواد) لتضمين فحص PET ثابت ، وتصوير بالرنين المغناطيسي T1 (تصحيح التوهين) و T2 المرجح (المرجع التشريحي) ، وإعادة بناء PET قبل يوم واحد من جلسة التصوير المجدولة.
- للحصول على PET ، حدد التمييز بمستوى 400-600 keV ، ونظير دراسة F-18 ، ووضع الصدفة 1-5 ، ومسح 20 دقيقة.
- للحصول على MR المرجح T1 لكامل الجسم ، استخدم التدرج echo-3D مع TE = 4.3 مللي ثانية ، TR = 16 مللي ثانية ، مجال الرؤية (FOV) = 90 مم × 60 مم ، عدد الإثارة (NEX) = 3 ، 28 شريحة بسمك 0.9 مم ، وحجم الفوكسل = 0.375 مم 3 × 0.375 مم 3 × 0.9 مم 3.
- للحصول على MR المرجح T2 لكامل الجسم ، استخدم صدى الدوران السريع 2D مع TE = 71.8 مللي ثانية ، TR = 3000 مللي ثانية ، FOV = 90 مم × 60 مم ، NEX = 5 ، 28 شريحة بسمك 0.9 مم ، حجم الفوكسل = 0.265 مم 3 × 0.268 مم 3 × 0.9 مم 3.
- لإعادة بناء PET ، حدد خوارزمية Tera-Tomo (TT3D) ، التكرارات = 8 ، المجموعات الفرعية = 6 ، وضع الصدفة 1-3 ، ومع تصحيحات الاضمحلال ، والوقت الميت ، والعشوائية ، والتوهين ، والشتت لإنشاء صور بحجم فوكسل إجمالي يبلغ 0.3 مم3.
- قم بإجراء اختبار نشاط PET قبل بدء التجربة للتحقق من دقة كمية PET11.
- املأ حقنة سعة 5 مل ب 5-8 ميجابايت بكريل [18فهرنهايت] FMISO مخففة بالماء أو المالحة وفقا لتوصية الشركة المصنعة. استخدم جهاز معايرة الجرعة لتسجيل نشاط المحقنة (انظر جدول المواد). لاحظ وقت القياس.
- ارسم حجما مثيرا للاهتمام (VOI) على الصورة المعاد بناؤها لتغطية المحقنة بأكملها. قارن النشاط المسترد من الصورة بالقيمة التي تم الحصول عليها من معاير الجرعة. تابع دراسات التصوير عندما يكون النشاط المستعاد دقيقا في حدود ±5٪.
4. [18 F] FMISO و [18F] حقن FDG
- احصل على جرعة سريرية من [18F] FMISO من المورد قبل 30 دقيقة من بدء دراسات التصوير. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، مثل معطف المختبر ، والقفازات ، والنظارات ، وشارة الفيلم ، ومقاييس الجرعات الحلقية عند التعامل مع المواد المشعة. قم بتغيير القفازات بشكل متكرر لتجنب التلوث المتبادل للمواد المشعة.
- ضع محاليل المخزون المشع في حاوية تخزين الرصاص خلف درع سطح الطاولة من الفئة L. الاستغناء عن حصة من [18F] FMISO وتخفيفها بمحلول ملحي معقم. تأكد من أن تركيز النشاط الكلي هو 18-20 MBq في 100 μL.
- ارسم [18F] FMISO باستخدام حقنة سعة 1 مل بإبرة (انظر جدول المواد). سجل النشاط الإشعاعي والوقت الموضح على معاير الجرعة.
- سجل وزن الماوس قبل حقن المقتفي الإشعاعي. استخدم 5٪ إيزوفلوران (1 لتر / دقيقة O2 طبي) لتخدير الفأر ، ثم حقن [18F] FMISO المحضر بعناية عبر الوريد الذيل. سجل وقت الحقن ونشاط بقايا المحقنة لحساب تصحيح التسوس. ضع الماوس مرة أخرى في القفص لمدة 180 دقيقة للسماح بامتصاص [18فهرنهايت] FMISO قبل فحص التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني. السماح للماوس لاستعادة لمدة 1 يوم بعد [18F] FMISO PET.
ملاحظة: على الرغم من الاختلاف الكبير في ملامح الحرائك الدوائية في الجسم الحي ل [18 F] FMISO و [18 F] FDG ، فإن كلا المقتفيات الإشعاعية موسومة إشعاعيا ب F-18 ، وهي نويدات مشعة PET بعمر نصف يبلغ 109.77دقيقة (< 2 ساعة). نظرا لأن إشارة PET تنشأ من F-18 ، فقد نصف النشاط الإشعاعي الأولي المحقون كل 2 ساعة. في هذه الحالة ، لم يعد من الممكن اكتشاف الإشارة المتبقية بعد الحقن بعد 24 ساعة بواسطة ماسح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفجوة لمدة يوم واحد بين كل من [18 F] FMISO (اليوم 1) و [18 F] FDG (اليوم 3) ستسمح بالاضمحلال الكامل ل [18 F] FMISO عند إجراء [18 F] FDG PET ، وبالتالي لا يوجد تداخل لإشارة [18 F] FMISO في فحص [18F] FDG PET. - كرر الخطوات من 4.1.إلى 4.4. لحقن [18F] FDG في اليوم 3 ، باستثناء أن تركيز النشاط الكلي من 6-8 MBq في 100 μL يتم حقنه بامتصاص 60 دقيقة قبل بدء فحص التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
- احسب نشاط [18 F] FMISO أو [18F] FDG المحقون باستخدام الصيغةالتالية 11:
نشاط الحقن (MBq) = النشاط في المحقنة قبل الحقن - النشاط في المحقنة بعد الحقن
5. اقتناء PET / MR
- قم بتشغيل سخان الهواء لتدفئة سرير تصوير الماوس قبل فحص التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني المجدول. استخدم 5٪ إيزوفلوران (1 لتر / دقيقة O2 طبي) لتخدير الفأر في غرفة الحث.
- بمجرد تخديره وفحصه بشكل صحيح باستخدام استجابة قرصة إصبع القدم ، انقل الماوس بعناية وعلى الفور إلى سرير التسخين وحافظ على التخدير بنسبة 2٪ -2.5٪ إيزوفلوران. ضع رأس الفأر المعرضة على شريط اللدغة وضع مزلق العين على كلتا العينين لتجنب الجفاف والتكوين المحتمل لتقرحات القرنية. قم بتغطية سرير التصوير بغطاء بلاستيكي للحفاظ على درجة الحرارة المحيطة بالسرير.
- مراقبة وتسجيل معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم للماوس باستخدام وسادة التنفس الداخلية والمسبار الحراري ، على التوالي. تأكد من الحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس عند 37 درجة مئوية بينما يتم الحفاظ على معدل التنفس في حدود 40-50 نفسا في الدقيقة (نبضة في الدقيقة) عن طريق ضبط مستوى الأيزوفلوران.
- قم بإجراء عرض كشاف لتحديد موضع الماوس داخل الماسحة الضوئية. اضبط موضع سرير الماوس لتغطية جسم الماوس بالكامل ، مع وجود منطقة الجذع في مركز مجال الرؤية للتصوير بالرنين المغناطيسي.
- لبدء فحص التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني، حدد اكتساب التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني في نافذة قائمة الدراسة، ثم اختر نطاق المسح الضوئي عند الاكتساب السابق لاستخدام موضع سرير الماوس المحدد مسبقا من طريقة عرض الكشافة. انقر فوق إعداد > "موافق " لنقل سرير الماوس تلقائيا من MR إلى PET وبدء الاستحواذ.
- ضمن محرر المستحضرات الصيدلانية الإشعاعية، حدد النويدات المشعة المناسبة، ثم أدخل تفاصيل جرعة الحقن والوقت قبل وبعد [18 F] FMISO أو [18F]FDG، كما هو مقيس في الخطوة 4.3. والخطوة 4.4. أدخل وزن الماوس ضمن قائمة معلومات الموضوع.
- تابع عمليات الاستحواذ بالرنين المغناطيسي عند الانتهاء من فحص التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني. للقيام بذلك، حدد إعداد لنقل الماوس إلى MR من PET. انقر فوق موافق للمتابعة.
- بمجرد اكتمال جميع عمليات الفحص، حدد الصفحة الرئيسية لإعادة قاعدة التصوير إلى الموضع الافتراضي.
- قم بإيقاف تشغيل التخدير وشطف سرير التصوير باستخدام O2 الطبي. تحقق من منعكس سحب دواسة الماوس. انقل الماوس من سرير التصوير إلى قفص مبيت نظيف يوضع أعلى وسادة التدفئة للمساعدة في التعافي من التخدير واستعادة رد الفعل الصحيح.
- ضمن الفحص الأولي، حدد اقتناء PET لتحميل بيانات PET الأولية المكتسبة لإعادة بناء PET. حدد MM لاستخدامها كخريطة مادية. تابع إعادة بناء PET باستخدام المعلمة كما هو موضح في الخطوة 3.6.
- الالتزام الصارم بالإرشادات المحلية والمؤسسية عند التعامل مع الفئران بعد دراسات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني. تعامل مع جميع المواد الاستهلاكية المستخدمة ، على سبيل المثال ، المحاقن والإبر والقفازات والمناديل والنفايات البيولوجية ، على سبيل المثال ، فراش الأقفاص والمواد البرازية ، التي كانت على اتصال مباشر مع الفأر كنفايات مشعة ، وتعامل معها بعناية وفقا للوائح المحلية.
6. تحليل صورة PET
- افتح برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد)، وحدد تحميل بيانات DICOM لفتح صور PET وMR.
- اسحب صور PET وMR المقابلة إلى نافذة عرض البرنامج، وحدد التسجيل التلقائي لإجراء التسجيل المشترك التلقائي لصور PET وMR الناتجة.
- ضمن قائمة إعداد التسجيل ، حدد تحويل جامد. استخدم العالي والتدوير في قائمة جامدة/أفين.
- ضمن قائمة اختيار الدور العالمي ، انقر فوق MM كمرجع ومسح PET الثابت ك Reslice.
- افحص صور PET / MR المسجلة بشكل مشترك لضمان المحاذاة المناسبة. إذا لزم الأمر ، استخدم التسجيل اليدوي لضبط الصور يدويا.
- حدد موقع الورم التقويمي في الكبد باستخدام صورة التصوير بالرنين المغناطيسي. استخدم عائد استثمار القطع الناقص المقحم لرسم VOI على الورم ، باستخدام صورة MR كمرجع. نقل VOI الورم الذي تم إنشاؤه من MR إلى صورة PET. حدد أداة الفرشاة وأداة الممحاة لتعريف حدود VOI بعناية شريحة تلو الأخرى. تأكد من تجنب انتشار امتصاص النشاط الإشعاعي من الكبد على صورة التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
- استخدم VOI الإهليلجي لإنشاء 3 مم3 VOI على الكبد كعضو مرجعي. تأكد من تجنب مناطق الهياكل الوعائية والصفراوية الكبدية المرئية باستخدام صورة التصوير بالرنين المغناطيسي كدليل.
- حدد إظهار جدول عائد الاستثمار لإعادة تسمية جميع VOIs المرسومة. سجل جميع البيانات الضرورية ، على سبيل المثال ، النشاط الإشعاعي (kBq / mL) وحجم الورم (مم3) ، في جدول بيانات. احفظ نسخة من رسومات VOI وأرشفة كل من بيانات التصوير الأولية والمعاد بناؤها على محرك أقراص ثابت خارجي عند الانتهاء.
- احسب قيمة الاستيعاب القياسية (SUV) لجميع VOIs باستخدام المعادلةالتالية 11:
سيارات الدفع الرباعي = CPET (t) / (ID / BW)
حيث CPET (t) هو النشاط المقاس في VOI ، ID هي الجرعة المحقونة المقاسة بالكيلو بايت ، و BW هو وزن جسم الفأر بالكيلوغرام ، بافتراض كثافة الأنسجة 1 جم / مل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحصول على كتلة ورم مناسبة للزرع التقويمي المتتالي ، تم إنشاء الحيوانات المستنسخة المستقرة لأول مرة عن طريق الحقن تحت الجلد ل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في DPBS (تحتوي على خلايا MHCC97L) في الجناح السفلي للفئران العارية (الشكل 1 أ). تمت مراقبة نمو الورم ، وعندما وصل حجم الورم إلى 800-1000 مم 3 (حوالي 4 أسابيع بعد الحقن) ، تم القتل الرحيم للفئران ، وتم قطع كتلة الورم الناتجة إلى حوالي 1 مم3 شظايا لزرع تقويم الكبد اللاحق في مجموعة أخرى من الفئران العارية (ن = 6). تم اختيار الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعتين: التحكم (C1 ، n = 3) وربط الشريان الكبدي (H2 ، n = 3). تم إجراء HAL عن طريق ربط خيط رفيع حول الفرع الرئيسي للشريان الكبدي. تم إنقاذ الفئران C1 من HAL قبل زرع تقويم العظام. أدى هذا التلاعب إلى نقص الأكسجة في الورم في الفئران H2 ولكن ليس C1 ، ويمكن مراقبة حالة نقص الأكسجين في الورم بشكل غير جراحي باستخدام متتبع نقص الأكسجين PET [18F] FMISO. أظهرت دراسات PET / MR أن زيادة في امتصاص الورم [18 F] FMISO لوحظت فقط في الفئران H2 ، بينما باستخدام علامة تحلل السكر [18F] FDG ، ظل امتصاص الورم مشابها بين المجموعتين (الشكل 1B).
تم التحقق من صحة نقص الأكسجة الناجم عن HAL في الأورام من خلال فحص مستويات التعبير عن HIF-1α12 ، وتم إجراء مقارنات بين المجموعات. تماشيا مع ورم أكثر نقص الأكسجين بعد HAL ، أظهرت مجموعة H2 تعبيرا HIF-1α أعلى من مجموعة C1 (الكثافة البصرية: 0.17 مقابل 0.13 ، H2 مقابل C1 ، على التوالي) ، مما يؤكد مع امتصاص الورم [18F] FMISO (الشكل 2A). [18فهرنهايت] تم قياس امتصاص FMISO باستخدام النهج القائم على سيارات الدفع الرباعي. أظهرت أورام H2 زيادة بمقدار 2.3 ضعف في امتصاص [18F] FMISO مقارنة بأورام C1 (الحد الأقصى لسيارات الدفع الرباعي: 1.2 مقابل 2.8 ، على التوالي ، الشكل 2B). وبالمثل ، أدى HAL أيضا إلى امتصاص أعلى لسيارات الدفع الرباعي الكبدية في H2 مقارنة بالفئران C1 (الشكل 2C). مجتمعة ، نظهر هنا أن HAL يمكن أن يحفز بشكل فعال نقص الأكسجة في الورم في الطعوم الخارجية لتقويم سرطان الكبد ، ويمكن مراقبة نقص الأكسجة في الورم بشكل غير جراحي باستخدام [18F] FMISO PET التصوير ، بدعم من علامة الكيمياء الهيستولوجية المناعية خارج الجسم الحي HIF-1α التعبير. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر دمج التصوير بالرنين المغناطيسي تباينا ممتازا للأنسجة الرخوة لتمكين التحديد الواضح للورم من الكبد ، مما يجعل القياس الكمي الدقيق للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ممكنا.
الشكل 1: التصوير بالإصدار البوزيتروني / التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي للطعوم الخارجية للفئران HCC التقويمية. (أ) رسم تخطيطي لإبداعات الطعم الخارجي تحت الجلد وتقويم العظام ودراسات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني في أورام MHCC97L التقويمية. (B) صور PET لإسقاط الكثافة القصوى التمثيلية (MIP) ل [18 F] FMISO و [18F] FDG في الفئران التي تحمل أورام MHCC97L التقويمية (C1) بدون أو (H2) مع HAL. تشير الدوائر الزرقاء إلى موقع الورم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل الفئران التي تحمل أورام MHCC97L التقويمية مع وبدون HAL. (أ) ممثل مسجل بشكل مشترك [18F] FMISO PET / MR الصور ، تلطيخ الكيمياء المناعية ل HIF-1α ، والهيماتوكسيلين ويوزين (HE) في أقسام الورم. (ب-ج) التحليل الكمي لامتصاص [18F] FMISO في الورم والكبد. N = 3 لكل مجموعة. يتم عرض قيم سيارات الدفع الرباعي كمتوسط ± خطأ قياسي للمتوسط (SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، وصفنا إجراءات إجراء HAL على الطعوم الخارجية لسرطان الكبد التقويمي باستخدام الأورام تحت الجلد ، جنبا إلى جنب مع طرق المراقبة غير الغازية لنقص الأكسجة في الورم في الطعوم الخارجية التقويمية باستخدام [18 F] FMISO و [18F] FDG PET / MR. يكمن اهتمامنا في التصوير الأيضي لمختلف نماذج السرطان والمرض للتشخيص المبكر وتقييم استجابة العلاج11،13،14،15. حتى الآن ، نادرا ما تم وصف إنشاء الطعوم الخارجية HAL HCC واستقلاب الورم في الجسم الحي في الأدبيات ، مما دفعنا إلى التحقيق في الخصائص الأيضية لنماذج الورم هذه باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
يمثل الإنشاء الناجح للطعوم الخارجية التقويمية مع HAL كنموذج قوي للفئران لدراسة نقص الأكسجة في سرطان الكبد جانبا مهما لدراسة بيولوجيا سرطان الكبد في الجسم الحي. من المعروف أن نقص الأكسجة يحفز الأورام الخبيثة السرطانية. علاوة على ذلك ، ارتبط نقص الأكسجة داخل الورم بتعزيز الانتشار ، ورم خبيث ، ومقاومة إشعاعية وكيميائية ويستدعي توصيفا شاملا للاستجابة لحالات نقص الأكسجين7. في حين أن الطعوم الخارجية تحت الجلد غالبا ما تستخدم لدراسة تكوين ورم سرطان الكبد أو استراتيجيات العلاج ، يمكن لنماذج تقويم العظام أن تلخص بشكل أفضل تطور سرطان الكبد البشري لأنها تعكس بشكل أكثر دقة البيئة المكروية للورم ، لا سيما التأثيرات على الأوعية الدموية وتفاعلات الورم وسدى الورم نحو ورم خبيثHCC 12. يسمح دمج HAL في الفئران التقويمية HCC بتحريض نقص الأكسجة داخل الورم عن طريق منع الإمداد الدموي الشرياني الكبدي للورم7. تمكن هذه النماذج الحيوانية من توضيح الآليات الكامنة وراء تأثيرات HAL على سرطان الكبد وخلق طرق جديدة للعلاجات الفعالة التي تستهدف مسار نقص الأكسجة في سرطان الكبد. بالنسبة لزرع تقويم العظام ، استخدمنا مكعب الورم من الورم تحت الجلد بدلا من الحقن المباشر لمعلقات خلايا سرطان الكبد. لقد وجدنا أن حقن الخلايا المباشرة غالبا ما تسبب كمية صغيرة من التسرب من موقع الحقن ، على الرغم من أن الإجراء تم تنفيذه ببطء قدر الإمكان مع انخفاض حجم الحقن. قد يؤدي هذا إلى ورم خبيث بريتوني ، وهو ضار برفاهية الحيوان ، مما يؤثر في النهاية على النتيجة الإجمالية للدراسة. من ناحية أخرى ، فإن زرع كتلة ورم صغيرة سيتغلب على المشكلة ، على الرغم من أنه يجب توخي الحذر لضمان خياطة الورم بشكل آمن بعد الزرع. عند عزل مكعبات الورم الصغيرة من كتلة الورم تحت الجلد ، ينصح أيضا بتجنب المناطق الأساسية للورم الصلب ، والتي تكون أقل وعائية نسبيا وأكثر إجهادا من الناحية الأيضية بسبب نقص الأكسجة والحرمان من المغذيات. سيؤدي القيام بذلك إلى تقليل إدراج الخلايا السرطانية الميتة التي تبدو نخرية داخل مكعب الورم الصغير وسيحافظ على معدلات نمو الورم أكثر اتساقا عبر الفئران الفردية.
نقص الأكسجة هو عامل إنذار لمقاومة السرطان ، ومراقبة التغيرات في نقص الأكسجة باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني يسمح باكتشاف وتحديد الأنسجة التي تعاني من نقص الأكسجين بحساسية وخصوصية عالية. أحد الاعتبارات المهمة ل [18 F] FMISO و [18F] FDG PET ينطوي على وقت امتصاص المقتفي الإشعاعي وطريقة الإعطاء في الفئران. كلا المقتفيات الإشعاعية لها حركية دوائية مختلفة في الجسم الحي ، أحدهما هو اختلاف الامتصاص الفسيولوجي ، الذي لوحظ في الأمعاء / المثانة والقلب / المثانة ل [18 F] FMISO و [18 F] FDG ، على التوالي ، والآخر هو أن [18 F] FMISO يتراكم في منطقة نقص الأكسجين في الورم ، و [18F] يتم تناول FDG بشكل تفضيلي في منطقة الورم الأيضيةالعالية 16. تتطلب نسبة الدهون العالية والخلوص الكبدي البطيء ل [18F] FMISO وقتا بعد الحقن لمدة 2-4 ساعات للحصول على تباين جيد بين الورموالكبد 17. وجدنا أن الحقن بعد 3 ساعات يكفي لتمييز وتحديد امتصاص الورم [18F] FMISO من الكبد لكل من مجموعات نقص الأكسجين (H2) والمجموعة الضابطة (C1). في حالة [18F] FDG PET ، يكون وقت ما بعد الحقن لمدة 1 ساعة كافيا لتحقيق تباين جيد ، كما هو موضح سابقا13,15 ، وتم استخدامه في هذه الدراسة. ومع ذلك، فإن الحفاظ على وقت ثابت لامتصاص المقتفي الإشعاعي أمر حتمي لضمان موثوقية نتائج التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني، خاصة بالنسبة للتحليلات القائمة على سيارات الدفع الرباعي. هنا ، استخدمنا تقنيات الحقن الوريدي لإدارة المقتفي الإشعاعي للفئران. يشار إلى حقن الوريد الذيل الناجح من خلال الفلاش باك الدموي المرئي قبل ضخ المقتفي الإشعاعي ، حيث يتم وضع الإبرة بدقة داخل الوريد. العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو أنه قد يكون من الصعب ملاحظة الفلاش باك المتوقع للدم بسبب انخفاض ضغط الدم ، مع ملاحظة التباين بين الفئران. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذه الصعوبة عن طريق تسخين الذيل لفترة قصيرة من 1-2 دقيقة قبل إدخال الإبرة ، إما بمنشفة دافئة أو بمصباح حراري لزيادة تدفق الدم وتحسين رؤية الوريد للحقن الناجح.
مع الاستخدام المتزايد لتصوير التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لتحديد التوزيع الحيوي للمقتفي الإشعاعي في الحيوانات الصغيرة ، فإن أحد الاعتبارات المهمة التي يجب ملاحظتها هو استخدام ماسح ضوئي PET دقيق ومعاير جيدا لإنتاج بيانات PET جيدة وقابلة للتكرار وقابلة للقياس الكمي. يسمح نظام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني الدقيق بإجراء دراسات التصوير بطريقة أكثر كفاءة من حيث الوقت وفعالية من حيث التكلفة ويتيح تنفيذ مبادئ 3Rs (الاستبدال والتقليل والصقل) في البحوث الحيوانية. لهذا السبب ، يجب إجراء عمليات تفتيش روتينية لمراقبة الجودة ، ويفضل أن يكون ذلك على أساس أسبوعي ، لفحص مكونات PET و MR لنظام التصوير وفقا لتوصية الشركة المصنعة. على وجه الخصوص ، يجب التحقق من دقة نشاط التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني وتسجيله بشكل متكرر ، وكذلك قبل بدء تجربة التصوير ، لضمان موثوقية القياس الكمي للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني. هذا أمر حتمي لأي دراسات طولية تنطوي على التقييم الكمي للورم والأنسجة على مدى فترة الفحص لتحقيق نتائج ذات مغزى وقابلة للمقارنة. يلزم معايرة النظام عندما يتبين أن دقة نشاط التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني خارج النطاق الموصى به ، وكذلك عند اكتشاف اختلال في محاذاة صور PET و MR.
على الرغم من أن التقنيات الموصوفة هنا تمكن من تصوير التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني للطعوم الخارجية لسرطان الكبد الناقص الأكسجين لمجموعة واسعة من التحقيقات في الجسم الحي ، إلا أنه ينبغي مراعاة بعض القيود عند التفكير في استخدام هذه البروتوكولات. يعد إنشاء الطعوم الخارجية HAL HCC إجراء جراحيا معقدا داخل البطن يتم إجراؤه على الفئران التي تعاني من نقص المناعة والتي تبلغ من العمر 6-8 أسابيع. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب تحديد موقع الشريان الكبدي الصغير في هذه الفئران الصغيرة ، مما يجعل عملية الربط صعبة تقنيا. تتطلب هذه الإجراءات موظفين مدربين تدريبا مناسبا لتحسين معدل تعاقب الجراحة ، وكذلك بقاء الفئران على قيد الحياة على مدى فترة من الزمن ، أي قبل 4-6 أسابيع من تشكل الطعوم الخارجية ، في حين يتوقع توفير رعاية مكثفة للحيوانات طوال فترة الجراحة ، والتي تتطلب الكثير من الوقت والموارد. ومن المتوقع أيضا أن يتطلب إنشاء الطعوم الخارجية لسرطان الكبد التقويمي باستخدام هذه الطريقة حوالي 8 أسابيع قبل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني الناجح ، حيث يتم استخدام زرع مكعب الورم بدلا من الحقن المباشر لمعلقات الخلايا لتجنب ورم خبيث بريتوني. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذه القيود من خلال التخطيط والتدريب المناسبين لموظفي البحوث. كما أن حجم عينة المجموعات التجريبية المبلغ عنها هنا صغير ، وقد لا يكون مناسبا للتحليل الإحصائي. ومع ذلك ، فإن ملاحظاتنا تكشف بشكل شخصي عن اتجاه حيث تم قياس نقص الأكسجة الناجم عن HAL في كل من الورم والكبد في H2 مقارنة بمجموعة C1 ، والتي يدعمها تلطيخ HIF-1α الأكثر بروزا في عينات الورم H2. نحن نعمل حاليا على توسيع نماذج الورم مع خطوط خلايا سرطان الكبد البشرية الأخرى. أيضا ، الدراسات العلاجية التي تستهدف مسار نقص الأكسجة في سرطان الكبد التي تنطوي على هذه الطعوم الأجنبية جارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نحن نقر بدعم الصندوق الاستئماني لمكافحة السرطان في هونغ كونغ ، صندوق البحوث التعاونية لمجلس هونغ كونغ للمنح البحثية (CRF C7018-14E) لتجارب تصوير الحيوانات الصغيرة. كما نشكر دعم مركز التصوير الجزيئي والسيكلوترون الطبي (MIMCC) في جامعة هونغ كونغ لتوفير [18 F] FMISO و [18F] FDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
