Summary
在这里，我们提出了一种方案来创建有和没有肝动脉结扎的原位肝细胞癌异种移植物，并使用[18 F]氟咪唑（[18 F]FMISO）和[18 F]氟脱氧葡萄糖（[18F]FDG）对肿瘤缺氧进行非侵入性正电子发射断层扫描（PET）成像。
Abstract
肝细胞癌（HCC）的临床前实验模型概括了人类疾病，是研究肿瘤发生和评估新治疗方法的重要工具。使用正电子发射断层扫描 （PET） 的非侵入性全身成像可在分子水平上实时提供对组织体内特征的关键见解。我们在这里提出了一个原位HCC异种移植物创建的方案，有和没有肝动脉结扎（HAL）诱导肿瘤缺氧，并使用[18 F]氟咪唑（[18 F]FMISO）和[18 F]氟脱氧葡萄糖（[18F]FDG）PET/磁共振（MR）成像评估其体内肿瘤代谢。使用缺氧标记物[18 F]FMISO可以很容易地观察到肿瘤缺氧，并且发现接受HAL的HCC小鼠的[18 F]FMISO摄取高于非HAL组，而[18F]FDG无法区分两组之间的肿瘤缺氧。HAL肿瘤在缺氧反应中也表现出更高水平的缺氧诱导因子（HIF）-1α表达。HAL肿瘤的定量显示，基于标准化价值摄取（SUV）方法的[18F] FMISO摄取增加了2.3倍。
Introduction
肝细胞癌 （HCC） 是全球第六大确诊癌症和第三大常见癌症死因，2020 年新增病例超过 900，000 例，死亡800，000 例 1.主要危险因素是肝硬化，这是病毒感染（乙型和丙型肝炎病毒）、酗酒、糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎2 的结果。肝细胞癌的管理相当复杂，有几种治疗选择，包括手术切除、热消融或化学消融、移植、经动脉化疗栓塞、放疗和化疗，具体取决于疾病分期2，3。肝细胞癌是一种化疗难治性肿瘤，在根治性治疗后，多达 70% 的患者会复发2。
尽管肿瘤异质性很高，但肝细胞癌与两种常见结局有关：（i）肝细胞癌非常缺氧，（ii）肿瘤缺氧与更大的肿瘤侵袭性和治疗失败有关。HCC细胞不受控制的增殖导致血管形成前的高耗氧率，从而产生缺氧微环境。低肿瘤内氧水平会触发一系列影响肿瘤侵袭性和治疗反应的生物反应。缺氧诱导因子（HIF）通常被认为是对缺氧反应的基本转录调节因子2，3。因此，检测缺氧的能力对于可视化肿瘤组织和识别需要侵入性手术的难以接近的部位至关重要。它还有助于更好地了解导致肿瘤侵袭性的分子变化并改善患者的治疗结果。
使用正电子发射断层扫描（PET）的分子成像通常用于许多癌症（包括HCC）的诊断和分期。特别是，联合使用涉及 [18F] 氟脱氧葡萄糖 （[18F]FDG） 和 [11C] 乙酸盐的双示踪 PET 成像可显著提高肝细胞癌诊断的总体敏感性4，5。另一方面，缺氧成像可以通过使用常用的缺氧标记物[18 F]氟米索硝唑（[18F]FMISO）来实现。在临床实践中，缺氧的无创评估对于区分各种类型的肿瘤和放射治疗计划的区域非常重要6。
临床前成像已成为对不同疾病的小鼠模型进行无创和纵向评估不可或缺的工具。稳健且高度可重复的HCC模型代表了人类HCC病理生理学的临床前和转化研究以及新疗法评估的重要平台。结合PET成像，可以阐明体内行为，以在任何给定时间点提供分子水平的重要见解。在这里，我们描述了用于生成肝动脉结扎（HAL）原位HCC异种移植物的方案，并使用[18 F]FMISO和[18F]FDG PET / MR分析其体内肿瘤代谢。HAL的掺入使得转基因或化学诱导的HCC小鼠异种移植物成为研究体内肿瘤缺氧的合适模型，因为HAL可以有效阻断动脉血液供应以诱导肿瘤内缺氧7，8。此外，与使用匹莫硝唑的离体免疫组织化学染色不同，缺氧引起的肿瘤代谢变化可以很容易地使用PET成像进行无创可视化和准确定量，从而能够纵向评估治疗反应或测量耐药性的出现3，7，8.我们这里显示的方法允许创建一个强大的缺氧HCC模型，以及使用PET / MR成像对肿瘤缺氧进行无创监测，以研究体内HCC生物学。
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Protocol
所有动物研究均按照香港大学比较医学研究中心（CCMR）的活体动物教学和研究委员会（CULATR）进行，该委员会是国际实验动物护理评估和认证协会（AAALAC）认可的计划。研究中使用的动物是6-8周龄的雌性BALB / cAnN-nu（裸体）小鼠，体重为20g±2g。食物和水是 随意提供的。
1.皮下注射人肝细胞癌细胞系
注意：MHCC97是一种人HCC细胞系，用于生成皮下HCC异种移植模型。MHCC97L细胞取自上海复旦大学附属中山医院肝癌研究所，中华人民共和国9，并通过短串联重复（STR）分析进行认证。
- 培养MHCC97L细胞并维持在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素和链霉素的培养基中，在T-75细胞培养瓶中于37°C在5%CO2 提供的加湿培养箱中（参见 材料表）。每2天更换一次培养基，并以80%-90%汇合度收获细胞。
注意：起始细胞数为1.5 x 10 6个细胞，细胞在6-8 代内使用。 - 将培养基和胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（胰蛋白酶 - EDTA）在4°C下在黑暗中储存直至使用。使用前将培养基预热至37°C，将胰蛋白酶-EDTA预热至室温。有关本节中使用的所有试剂和耗材，请参阅 材料表 。
- 移除培养基。用 10 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水（DPBS，参见 材料表）冲洗细胞层。
- 向培养瓶中加入5mL胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育细胞。 在倒置显微镜下以20倍放大倍率检查细胞（参见 材料表），直到细胞层分散并从烧瓶中完全分离。确保细胞在胰蛋白酶-EDTA中停留不超过15分钟。
- 向培养瓶中加入 5 mL 培养基。通过轻轻移液吸出细胞。将细胞悬液转移到离心管中，并以1，107× g 离心5分钟（参见 材料表）。
- 取出上清液，用 1 mL PBS 轻轻重悬细胞沉淀。彻底移液以获得单细胞悬液。使用自动细胞计数器（参见 材料表）确定细胞数，并在PBS中制备浓度为5 x 106 细胞/ mL的细胞悬液。
- 在 1 mL 注射器中用 25 G 针头抽取 200 μL 细胞悬液。每个注射器包含1 x 106 MHCC97L细胞（200μL）。将注射器放在湿冰上。
- 腹膜内（ip）注射氯胺酮（87.5mg / kg）和甲苯噻嗪（12.5mg / kg）的混合物麻醉小鼠。使用捏脚趾反射确保适当的麻醉。确保在鼠标上涂抹眼睛润滑剂，以防止干燥和角膜溃疡的潜在形成。将鼠标仰卧放在无菌垫上（参见 材料表）。
- 用70%乙醇对小鼠下胁（左侧或右侧）附近的背侧区域进行灭菌（参见 材料表）。用镊子提起皮肤，然后将针头斜面轻轻插入皮肤下方。
- 将针头从穿刺部位沿皮下平面推进4-5毫米，以避免在抽出针头时细胞悬液从注射部位意外泄漏。确保针头插入皮肤下不要太深，这可能会造成意外的器官损伤。
- 释放镊子，小心缓慢地排出注射器的内容物，注意不要穿透另一侧。拔出针头以检查注射是否有肿胀。将鼠标放回笼子中，放在预热的加热垫上，以帮助从麻醉中恢复并恢复活动能力。继续监测鼠标，直到鼠标完全清醒并保持胸骨卧位。
- 每周监测小鼠的肿瘤生长和健康状况。使用卡尺测量肿瘤体积（V）（见 材料表）。使用以下公式10计算并记录肿瘤体积：
V = （W 2× L）/2
其中W是肿瘤的宽度，L是肿瘤的长度。 - 在注射后4-6周之间，检查是否获得显着大小的皮下肿瘤，在800-1000mm3之间。确保总肿瘤负荷不超过体重的10%。
2.原位肝植入和肝动脉结扎术
- 在消毒的生物安全柜中准备以下手术试剂和工具：培养皿中的10mL培养基，10%聚维酮碘溶液，70%乙醇，高压灭菌手术器械，即锋利的剪刀，弹簧剪刀，镊子（弯曲的细直钝），针架，手术刀刀片，6-0和5-0尼龙缝合线，加热垫。
- 高压灭菌所有手术器械，并仅在无菌工作台上处理它们。在整个外科手术过程中为小鼠提供充分和必要的术前，术中和术后护理（见以下步骤）。
- 为了缓解术前疼痛，在手术开始前至少30分钟向小鼠注射丁丙诺啡（0.1mg / kg）。对于术后护理和管理，连续3天向小鼠注射丁丙诺啡（0.1mg / kg），每8-12小时一次。有关本节中使用的所有试剂和耗材，请参阅 材料表 。
- 用腹腔注射戊巴比妥（330mg / kg）对皮下荷瘤小鼠实施安乐死。使用手术刀刀片在肿瘤部位的皮肤上切开一个切口。切除皮下肿瘤阻滞并立即将其转移到培养基中。尽快执行此步骤。
- 使用锋利的手术剪刀将肿瘤块切成1mm3 小肿瘤立方体。将所有肿瘤立方体保存在培养基中。避免使用皮下肿瘤阻滞的核心区域。
- 麻醉将要接受随后的原位肿瘤植入手术的小鼠，腹膜注射氯胺酮（87.5mg / kg）和甲苯噻嗪（12.5mg / kg）的混合物。确保在麻醉小鼠之前给予丁丙诺啡后至少经过 30 分钟。确保在鼠标上涂抹眼睛润滑剂，以避免干燥和可能形成角膜溃疡。
- 将鼠标仰卧放在预热加热垫顶部的无菌垫上。每15分钟监测和记录一次小鼠的生理状态，直到手术过程结束。
- 伸展鼠标的四肢。用胶带固定它们，以最大限度地暴露腹腹部和胸部。用10%聚维酮碘溶液灭菌小鼠的整个腹部皮肤，然后用70%乙醇消毒。通过检查对脚趾捏伤 - 踏板撤回反射没有反应来评估鼠标的麻醉深度。
- 通过做一个大约 10 毫米的中线切口来使用锋利的剪刀进入腹膜进行剖腹手术。用镊子夹紧剑突并将其拉向头部，并应用肋下牵开器以打开手术区域。确保做一个正确的切口，以便能够很好地看到手术部位。
- 用湿纱布拭子向上缩回正中叶和左叶。将腹部外的肠子移到小鼠的左侧，并用湿纱布拭子覆盖它们。在放大灯下对肝总动脉 （CHA） 进行肝总动脉结扎 （HAL），该动脉从胰头到肝蒂根部，以优化可视化。
- 用湿纱布拭子向后/向下缩回正中叶和左叶，露出左叶。用无菌手术刀刀片在左叶表面做一个长度和深度约为 2 mm 的切口。
注意：也可以使用肝脏的正中叶进行肿瘤植入，以尽量减少因创伤而对邻近腹部器官造成的意外撕裂或撕裂伤。 - 立即用无菌镊子将肿瘤碎片插入肝脏切口。埋葬肿瘤，使其牢固地位于肝脏中。在切口部位用6-0尼龙缝合线进行八字形缝合，以确保肿瘤碎片适当植入肝脏并止血。尽快执行此操作以避免出血过多。完成后，用中断的5-0缝合线关闭腹部切口。
- 将鼠标放回笼子中，放在预热的加热垫上，以帮助从麻醉中恢复并恢复矫正反射。继续监测和记录小鼠的生理状态，每15分钟，直到小鼠完全清醒并保持胸骨卧位。
- 重复该过程，直到所有小鼠都经历了原位肿瘤植入。通过连续监测所有小鼠在手术后的3天内每天的生理状态，为所有小鼠提供术后护理。每8-12小时给予丁丙诺啡（0.1mg / kg）。
3. 设置 PET/MR 校准和工作流程
注意：使用临床前PET / MR 3T系统进行成像（见 材料表）。
- 使用5%异氟醚（1L / min医用O2）在诱导室中麻醉小鼠。对于每次扫描，小心地将麻醉小鼠放在连续加热的成像床上;首先，使用 MR（侦察视图）作为静态 [18 F] FMISO 或 [18F]FDG PET 扫描的解剖参考进行扫描，然后进行解剖参考 MR 成像。
- 在软件中创建顺序 PET/MR 成像工作流程（参见 材料表），包括静态 PET 扫描、T1 加权（衰减校正）和 T2 加权（解剖参考）MR 成像，以及预定成像会话前 1 天的 PET 重建。
- 要获得 PET，请选择 400-600 keV 水平判别、F-18 研究同位素、1-5 重合模式和 20 分钟扫描。
- 要获取全身 T1 加权 MR，请使用梯度回波-3D，TE = 4.3 ms，TR = 16 ms，视场 （FOV） = 90 mm x 60 mm，激发数 （NEX） = 3，28 个厚度为 0.9 mm 的切片，体素大小 = 0.375 mm 3 x 0.375 mm 3 x 0.9 mm 3。
- 要获得全身 T2 加权 MR，请使用快速自旋回波 2D，TE = 71.8 毫秒，TR = 3000 毫秒，FOV = 90 毫米 x 60 毫米，NEX = 5，28 个切片，厚度为 0.9 毫米，体素大小 = 0.265 毫米 3 x 0.268 毫米3 x 0.9 毫米3.
- 要重建 PET，请选择 Tera-Tomo （TT3D） 算法，迭代 = 8，子集 = 6，1-3 重合模式，并使用衰减、死区时间、随机、衰减和散射校正来创建整体体素大小为 0.3 mm的图像 3.
- 在实验开始前进行PET活性测试，以检查PET定量的准确性11。
- 按照制造商的建议，用用水或盐水稀释的 5-8 MBq [18F] FMISO 填充 5 mL 注射器。使用剂量校准器记录注射器的活性（见 材料表）。注意测量时间。
- 在重建的图像上绘制感兴趣的体积（VOI）以覆盖整个注射器。将图像中恢复的活性与从剂量校准器获得的值进行比较。当恢复的活动准确在 ±5% 以内时，继续进行影像学检查。
4. [18 F]FMISO 和 [18F] FDG 注射
- 在成像研究开始前30分钟从供应商处获得[18F] FMISO的临床剂量。处理放射性物质时，请穿戴适当的个人防护装备 （PPE），例如实验室外套、手套、眼镜、胶片徽章和环形剂量计。经常更换手套，以避免放射性物质的交叉污染。
- 将放射性储备溶液放入L块桌面防护罩后面的铅储存容器中。分配等分试样 [18F] FMISO，并用灭菌盐水稀释。确保总活性浓度在 100 μL 中为 18-20 MBq。
- 用带针头的1 mL注射器绘制[18F]FMISO（见 材料表）。记录剂量校准器上显示的放射性和时间。
- 在注射放射性示踪剂之前记录小鼠重量。使用5%异氟醚（1L / min医用O2）麻醉小鼠，然后通过尾静脉小心地注射制备的[18F] FMISO。记录注射器的注射时间和残留活性，以说明腐烂校正。在PET扫描之前，将鼠标放回笼中180分钟，以允许[18F] FMISO摄取。让鼠标在 [18F]FMISO PET 后恢复 1 天。
注意：尽管[18 F]FMISO和[18F]FDG的体内药代动力学特征非常不同，但两种放射性示踪剂都用F-18放射性标记，F-18是一种PET放射性核素，半衰期为109.77分钟（<2小时）。由于PET信号来自F-18，因此每2小时将损失一半的初始注入放射性。在这种情况下，PET扫描仪无法再检测到注射后24小时的残留信号。此外，当进行[18F]FDG PET时，[18 F]FMISO（第1天）和[18F]FDG（第3天）注射之间的1天间隔将允许[18 F]FMISO完全衰减，因此在[18 F]FDG PET扫描中没有[18F]FMISO信号重叠。 - 重复步骤 4.1.-4.4。对于第3天的[18F]FDG进样，除了在PET扫描开始前60分钟注射100μL中总活性浓度为6-8MBq。
- 使用以下公式11计算注入的[18 F]FMISO或[18F]FDG活性：
注射活性（MBq）=注射前注射器中的活性-注射后注射器中的活性
5. PET/MR 获取
- 在计划的PET扫描之前，打开空气加热器以加热鼠标成像床。使用5%异氟醚（1L / min医用O2）在诱导室中麻醉小鼠。
- 一旦正确麻醉并使用脚趾捏反应进行检查，小心并立即将小鼠转移到加热床并保持麻醉在2%-2.5%异氟醚。将鼠标头俯卧放在咬杆上，并在双眼上涂抹眼睛润滑剂，以避免干燥和潜在的角膜溃疡形成。用塑料布覆盖成像床，以保持床的周围温度。
- 分别使用内部呼吸垫和热探头监测和记录小鼠的呼吸频率和体温。通过调节异氟醚水平，确保小鼠的体温保持在37°C，同时呼吸频率保持在每分钟40-50次呼吸（bpm）的范围内。
- 执行侦察视图以定位扫描仪内的鼠标位置。调整小鼠床位置以覆盖整个小鼠身体，躯干区域位于MR的中心FOV。
- 要开始 PET 扫描，请在研究列表窗口中选择“ PET 采集”，然后选择 “上次采集的扫描范围 ”以使用侦察视图中预先确定的小鼠床位置。单击 “准备>确定 ”以自动将鼠标床从MR移动到PET并开始采集。
- 在放射性 药物编辑器下，选择合适的放射性核素，然后输入注射剂量和[18F]FMISO或[18F]FDG注射前后的时间的详细信息，如步骤4.3中测量的那样。和步骤 4.4。在 “主题信息 ”菜单下输入鼠标的重量。
- 完成 PET 扫描后继续进行 MR 采集。为此，请选择 “准备” 以将鼠标从 PET 移动到 MR。单击 “确定 ”继续。
- 完成所有扫描后，选择 “主页 ”将成像床移回默认位置。
- 关闭麻醉并用医用O2冲洗成像床。检查鼠标踏板退出反射。将鼠标从成像床转移回放置在加热垫顶部的干净外壳笼中，以帮助从麻醉中恢复并恢复矫正反射。
- 在“原始扫描”下，选择“PET 采集”以加载采集的 原始 PET 数据以进行 PET 重建。选择 MM 以用作材质贴图。使用步骤 3.6 中所述的参数继续 PET 重建。
- 在PET成像研究后处理小鼠时，请严格遵守当地和机构指南。将所有与小鼠直接接触的用过的消耗品（例如注射器、针头、手套、湿巾）和生物废物（例如笼子垫料和粪便）视为放射性废物，并根据当地法规小心处理。
6. PET图像分析
- 打开 图像分析 软件（请参阅 材料表），然后选择 加载 DICOM 数据 以打开 PET 和 MR 图像。
- 将相应的 PET 和 MR 图像拖动到软件显示窗口，然后选择“自动配准”以对生成的 PET 和 MR 图像执行 自动共配准 。
- 在“注册设置”菜单下，选择“刚性转换”。使用刚性/仿射菜单中的平移和旋转。
- 在 “全局角色选择 ”菜单下，单击“ MM 作为 参考 ”和“ 静态 PET 扫描 ”作为 “重新切片”。
- 检查共同注册的 PET/MR 图像以确保正确对齐。如有必要，请使用手动 配准手动 调整图像。
- 使用 MR 图像定位肝脏中的原位肿瘤。使用 插值椭圆ROI 在肿瘤上绘制VOI，使用MR图像作为参考。将产生的肿瘤VOI从MR转移到PET图像。选择“ 画笔 工具”和 “橡皮擦工具 ”以逐张幻灯片仔细定义 VOI 边框。确保避免肝脏放射性摄取溢出到PET图像上。
- 使用 椭球体VOI 在肝脏上创建3毫米3 VOI作为参考器官。确保使用 MR 图像作为指导，避开可见的肝血管和胆道结构区域。
- 选择 显示投资回报率表 以重命名所有绘制的 VOI。将所有必要的数据记录在电子表格中，例如放射性（kBq/mL）和肿瘤体积（mm3）。保存VOI图纸的副本，并在完成后将原始和重建的成像数据存档到外部硬盘驱动器。
- 使用以下公式11 计算所有 VOI 的标准化摄取值 （SUV）：
SUV = CPET（t）/（ID/BW）
其中 CPET（t）是VOI中测量的活性， ID 是以kBq为单位测量的注射剂量， BW 是以kg为单位的小鼠体重，假设组织密度为1g / mL。
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Representative Results
为了获得适合连续原位植入的肿瘤阻滞，首先通过将DPBS（含有MHCC97L细胞）中的200μL细胞悬液皮下注射到裸鼠的下侧来产生稳定的克隆（图1A）。监测肿瘤生长，当肿瘤大小达到800-1000mm 3（注射后约4周）时，对小鼠实施安乐死，并将所得肿瘤块切成约1mm3片段，随后将肝原位植入另一批裸鼠（n = 6）。将小鼠随机分为两组：对照组（C1，n = 3）和肝动脉结扎术（H2，n = 3）。HAL是通过在肝动脉的主要分支周围系上细线来进行的。C1小鼠在原位植入前免于HAL。这种操作导致H2小鼠的肿瘤缺氧，而不是C1小鼠，并且可以使用PET缺氧示踪剂[18F]FMISO无创地监测肿瘤缺氧状态。PET / MR研究表明，仅在H2小鼠中观察到肿瘤[18 F] FMISO摄取的增加，而使用糖酵解标记[18F]FDG，两组之间的肿瘤摄取保持相似（图1B）。
通过探测HIF-1α12的表达水平，进一步验证了HAL诱导的肿瘤缺氧，并在两组之间进行了比较。与HAL后缺氧更多的肿瘤一致，H2组表现出比C1组更高的HIF-1α表达（光密度：分别为0.17和0.13，H2与C1），这与他们的肿瘤[18F]FMISO摄取相吻合（图2A）。[18楼]FMISO的吸收使用基于SUV的方法进行量化。与C1肿瘤相比，H2肿瘤的[18F]FMISO摄取增加了2.3倍（SUVmax：分别为1.2和2.8，图2B）。同样，HAL也导致H2小鼠的肝脏SUV摄取高于C1小鼠（图2C）。综上所述，我们在这里表明HAL可以有效地诱导HCC原位异种移植物中的肿瘤缺氧，并且可以使用[18 F]FMISO PET成像进行无创监测肿瘤缺氧，由离体免疫组织化学标记HIF-1α表达支持。此外，MR成像的结合提供了出色的软组织对比度，能够清晰地从肝脏中划出肿瘤，从而使准确的PET定量成为可能。
图1：原位HCC小鼠异种移植物的 体内 PET / MR成像。 （A）原位MHCC97L肿瘤的皮下和原位异种移植物创建和PET成像研究示意图。（B）[18F] FMISO和[18F] FDG的代表性最大强度投影（MIP）PET图像，在携带原位MHCC97L肿瘤（C1）的小鼠中没有或（H2）有HAL的小鼠。蓝色圆圈表示肿瘤的位置。 请点击此处查看此图的大图。
图2：携带原位MHCC97L肿瘤的小鼠分析，有和没有HAL的。 （A）代表性的共同注册[18 F]FMISO PET / MR图像，HIF-1α的免疫组织化学染色，以及肿瘤切片中的苏木精和伊红（HE）。（乙-丙）肿瘤和肝脏中[18F] FMISO摄取的定量分析。每组 N = 3。SUV 的值表示为平均值±平均值的标准误差 （SEM）。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在这项研究中，我们描述了使用皮下肿瘤对肝原位HCC异种移植物进行HAL的程序，以及使用[18 F]FMISO和[18F]FDG PET / MR对原位异种移植物中肿瘤缺氧进行无创监测的方法。我们的兴趣在于各种癌症和疾病模型的代谢成像，用于早期诊断和治疗反应评估11，13，14，15。迄今为止，HAL HCC异种移植物的产生及其体内肿瘤代谢在文献中很少被描述，这促使我们使用PET成像研究这些肿瘤模型的代谢特征。
成功建立以HAL为研究HCC缺氧的原位异种移植物是研究体内HCC生物学的重要 方面。众所周知，缺氧会刺激癌症恶性肿瘤。此外，肿瘤内缺氧与增殖、转移以及放射性和化学抵抗性增强有关，需要彻底表征对缺氧条件的反应7。虽然皮下异种移植物通常用于研究HCC肿瘤发生或治疗策略，但原位模型可以更好地概括人类HCC的发展，因为它们更准确地反映了肿瘤微环境，特别是对血管形成和肿瘤 - 基质相互作用的影响HCC转移12。将HAL掺入HCC原位小鼠中可以通过阻断肝动脉向肿瘤的血性供应来诱导肿瘤内缺氧7。这些动物模型能够阐明HAL对HCC影响的潜在机制，并为针对HCC缺氧途径的有效治疗创造新的途径。对于原位植入，我们利用皮下肿瘤的肿瘤立方体而不是直接注射HCC细胞悬液。我们发现，直接细胞注射通常会导致注射部位的少量泄漏，即使该过程是在低注射量下尽可能缓慢地进行的。这可能会导致腹膜转移，这对动物健康有害，最终影响整体研究结果。另一方面，植入一个小的肿瘤块将克服这个问题，尽管需要注意确保植入后肿瘤被安全缝合。从皮下肿瘤阻滞中分离小肿瘤立方体时，还建议避开实体瘤的核心区域，这些区域由于缺氧和营养剥夺而血管化相对较少，代谢应激更大。这样做将减少小肿瘤立方体中似乎坏死的死肿瘤细胞的包含，并将在个体小鼠中保持更一致的肿瘤生长速率。
缺氧是癌症耐药性的预后因素，使用PET监测缺氧变化可以高灵敏度和特异性地检测和定量缺氧组织。[18 F]FMISO和[18F]FDG PET的一个重要考虑因素涉及小鼠的放射性示踪剂摄取时间和给药途径。两种放射性示踪剂具有不同的体内药代动力学，一种是[18 F]FMISO和[18 F]FDG分别在肠/膀胱和心脏/膀胱中观察到的生理摄取差异，另一种是[18 F]FMISO积聚在肿瘤的缺氧区域，[18 F]FDG优先在高代谢肿瘤区域被吸收16。[18F]FMISO的高亲脂性和缓慢的肝清除率需要注射后2-4小时才能获得良好的肿瘤-肝脏对比17。我们发现，注射后3小时足以区分和描绘缺氧（H2）和对照（C1）组的肝脏对肿瘤[18F]FMISO摄取。在[18F]FDG PET的情况下，注射后1小时的时间足以产生良好的对比度，如前所述13，15，并在本研究中使用。然而，保持一致的放射性示踪剂摄取时间对于确保PET结果的可靠性至关重要，特别是对于基于SUV的分析。在这里，我们使用静脉注射技术向小鼠施用放射性示踪剂。尾静脉注射的成功表现为放射性示踪剂输注前可见的血液闪回，其中针头被准确定位在静脉内。这种方法的一个主要缺点是，由于低血压，可能难以观察到预期的血液闪回，并且在小鼠之间观察到变异性。然而，这种困难可以通过在针头插入前加热尾巴1-2分钟的短时间来克服，无论是用温暖的毛巾还是用加热灯来增加血流量并提高静脉可见度以成功注射。
随着越来越多地使用PET成像来量化小动物中的放射性示踪剂生物分布，需要注意的一个重要考虑因素是使用准确且校准良好的PET扫描仪来产生良好，可重复和可量化的PET数据。精确的PET系统能够以更省时和更具成本效益的方式进行成像研究，并能够在动物研究中实施3R原则（替换，减少和改进）。因此，必须根据制造商的建议进行常规质量控制检查，最好是每周一次，以检查成像系统的PET和MR组件。特别是，应经常检查和记录PET活性的准确性，以及在成像实验开始之前，以确保PET定量的可靠性。这对于任何涉及在检查期间对肿瘤和组织进行定量评估的纵向研究都是必不可少的，以产生有意义和可比较的结果。当发现PET活性精度超出推荐范围时，以及发现PET和MR图像未对准时，需要对系统进行校准。
尽管此处描述的技术能够对缺氧HCC异种移植物进行PET成像以进行广泛的 体内 研究，但在考虑使用这些方案时应考虑一些局限性。HAL HCC异种移植物的创建是一种复杂的腹内外科手术，可在6-8周龄的免疫缺陷小鼠上进行。此外，这些年轻小鼠的小型肝动脉可能难以定位，这使得结扎过程在技术上具有挑战性。这些程序需要经过适当培训的人员来提高手术继任率，以及小鼠在一段时间内的存活率，即异种移植物形成前4-6周，同时预计在整个手术期间提供广泛的动物护理，这既是时间和资源密集型的。还预计使用这种方法创建原位HCC异种移植物将需要大约8周才能成功进行PET成像，因为使用植入肿瘤立方体而不是直接注射细胞悬液以避免腹膜转移。然而，这些限制可以通过对研究人员进行充分的规划和培训来克服。此外，这里报告的实验组的样本量很小，可能不适合统计分析。然而，我们的观察主观地揭示了一种趋势，即与C1组相比，在H2组的肿瘤和肝脏中都测量了HAL诱导的缺氧，H2肿瘤样本中更突出的HIF-1α染色支持了这一趋势。我们目前正在努力用其他人类HCC细胞系扩展肿瘤模型。此外，针对涉及这些异种移植物的HCC缺氧途径的治疗研究正在进行中。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢香港抗癌信托基金、香港研究资助局合作研究基金（CRF C7018-14E）对小动物影像实验的支持。我们亦感谢香港大学分子成像及医学回旋加速器中心（MIMCC）提供[18 F]FMISO及[18F]FDG的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
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