Drosophila Neuromusculaire junction (NMJ) kwantificering: een methode om synaptische morfologie en functie te beoordelen

Overview

De Drosophila neuromusculaire verbinding (NMJ) wordt gebruikt als model om de morfologie en functie van synapsen te bestuderen. Deze video beschrijft belangrijke kenmerken die onderzoekers kwantificeren om de NMJ te karakteriseren. Het voorbeeldprotocol demonstreert een software die de kwantificering automatisch kan uitvoeren.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).

1. Vereisten voorafgaand aan beeldverwerking

1. Voer Drosophila open boekpreparaten uit van derde instar zwervende larven (L3), zoals eerder beschreven.
2. Co-immunolabel Drosophila NMJ terminals met behulp van een combinatie van twee markers: Dlg-1 of Hrp samen met Brp voor analyse met "Drosophila NMJ Morphometrics", en Syt of Csp samen met Brp voor analyse met "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   OPMERKING: Antilichamen van dezelfde soort kunnen worden gecombineerd door er een vooraf te labelen met een antilichaamconjugatiekit zoals de Zenon Alexa Labeling Kits.
3. Beeld NMJ-terminals met behulp van een microscoop naar keuze, bijvoorbeeld fluorescentie (met of zonder ApoTome) of confocale microscopie.
   1. Verkrijg een 2-kanaals beeldstack van de NMJ-terminal.
      1. Pas de microscoopinstellingen aan op een manier dat kanaal 1 het NMJ-terminale immunolabel krijgt met Dlg-1 (of Hrp, Syt, Csp) en kanaal 2 het NMJ-terminale immunolabel met Brp.
      2. Analyseer desgewenst eenkanaalsafbeeldingen (van synapsen met een immunolabel met één antilichaam) met de macro's. Afbeelding NMJs immunoactief gelabeld met Dlg-1 of Hrp voor analyse met "Drosophila NMJ Morphometrics", of Syt of Csp voor "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
         OPMERKING: Het is niet mogelijk om synapsen immunostained met alleen anti-Brp te analyseren.
   2. Exporteer de verkregen afbeeldingen als afzonderlijke .tiff bestanden. Keer de kanaalvolgorde om voordat u de macro's uitvoert als deze niet zijn verkregen zoals aangegeven.

2. Softwarevereisten en installatie

1. Download de macro's: "Drosophila NMJ Morphometrics" en "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" van de volgende website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Verplaats de cursor naar de map "Macro's update 1", en klik op de verschijnende optie "weergave". Er verschijnt een lijst met de inhoud van deze map. De map bevat de macro's "Drosophila NMJ Morphometrics" en "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   OPMERKING: Beide macro's zijn compatibel met Fiji-versies 1.4, die ook in dezelfde map worden geleverd. De macro's worden mogelijk niet uitgevoerd op recente versies. Gebruik de meegeleverde versie 1.4. Het is onproblematisch om deze versie te starten, zelfs op computers met een recentere Fiji-versie beschikbaar.
3. Klik op "Alles downloaden". De mapinhoud wordt als .zip-bestand naar de computer gedownload. Pak het gedownloade bestand uit.
4. Kopieer de bestanden Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm en Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm naar Fiji.app/plugins/ directory. Wanneer u het programma opnieuw opstart, verschijnen de macro's onder aan het vervolgkeuzemenu Plug-ins.

3. Voer submacro "Converteren naar stack" uit om Z-projecties en hyperstacks van de NMJ-afbeeldingen te maken

1. Start de grafische interface door Plug-ins in de werkbalk te selecteren en kies "Drosophila NMJ Morphometrics" in het vervolgkeuzemenu.
2. Definieer de instelling "Unieke bestandsreeks" in de grafische interface van de macro.
   OPMERKING: De microscoopsoftware gebruikt een identificatiehandtekening om vlakken en kanalen te ordenen bij het opslaan van stapels als afzonderlijke '.tiff bestanden. De ingevoerde unieke bestandsreeksinstelling moet de handtekening opgeven die door de software is toegewezen aan het eerste vlak van het eerste kanaal (belangrijk: het laagste vlak en het kanaalnummer moeten worden aangegeven).
3. Selecteer alleen de submacro "Converteren naar stapel" en klik op "ok" en selecteer de map waarin de afbeeldingen zich bevinden. Als een hoofdmap met meerdere submappen is geselecteerd, worden alle afzonderlijke '.tiff-bestanden in de hoofdmap en submap die voldoen aan de unieke criteria voor bestandsreeksen verwerkt.
   1. Als de z-stack slechts één kanaal bevat, selecteert u het vakje "Alleen kanaal 1".
4. Merk op dat er twee nieuwe bestanden per NMJ-image verschijnen, standaard stack_image_name en flatstack_image_name. Bewaar alleen deze stack en flatstack voor verdere analyse. De .tiff-bestandsreeksen kunnen op dit punt worden verwijderd, waardoor de vereiste opslagcapaciteit wordt geminimaliseerd en potentiële foutbronnen worden vermeden.

4. Voer submacro "Roi definiëren" uit om de NMJ-terminal van belang af te baken

1. Start de grafische interface van "Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Schakel alleen het selectievakje "ROI definiëren" in en druk op "OK" en selecteer de hoofdmap waar de afbeeldingen met de titel flatstack_name zijn opgeslagen en druk op "Selecteren". De submacro "Roi definiëren" zoekt automatisch door alle submappen in de geselecteerde hoofdmap.
3. Wanneer de eerste projectie wordt geopend, selecteert u het gereedschap "Selecties uit de vrije hand" op de werkbalk.
4. Teken met de muis een selectie die uitsluitend de volledige NMJ-terminal van belang bevat en klik op "OK" in het venster "Terminal definiëren". De macro gaat verder met de volgende projectie.
5. Definieer de volgende ROI en herhaal deze totdat alle ROI's zijn gedefinieerd. Het ROI-afbeeldingsbestand, genaamd "roi_image_name", wordt opgeslagen in dezelfde map als de eerder gegenereerde stack- en projectieafbeeldingen voor elk van de verwerkte afbeeldingen. De uitvoer van deze submacro is een binaire afbeelding van de ROI in wit op een zwarte achtergrond.

5. Voer submacro "Analyseren" uit om NMJ-terminalfuncties te kwantificeren

1. Ga naar de werkbalk, selecteer "Plug-ins" en gebruik:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" bij het analyseren van synapsen immunoactief met anti-Dlg-1 of anti-Hrp (kanaal 1) samen met anti-Brp (kanaal 2), of "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" bij het analyseren van synapsen immunoactief gelabeld met anti-Syt of anti-Csp (kanaal 1) samen met Brp (kanaal 2).
   1. Wanneer een kanaalbeeldstapels moeten worden geanalyseerd (het structurele kanaal Dlg-1 of HRP voor "Drosophila_NMJ_Morphometrics", of Syt of Csp voor "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), selecteert u het vak "Alleen kanaal 1".
2. Pas de schaal aan die overeenkomt met de te analyseren afbeeldingen.
   1. Als één pixel in de afbeelding overeenkomt met 2,5 μm, geeft u Scale-Pixels = 1, Scale-Distance in μm = 2,5 aan. Als beide instellingen op 0 blijven staan, worden het NMJ-gebied, de omtrek, de lengte en de langste vertakkingslengte uitgedrukt in het aantal pixels.
3. Pas indien nodig de standaardanalyse-instellingen van de macro aan. Voer alleen aanpassingen uit als de submacro "Analyseren" eerder met onbevredigende resultaten is uitgevoerd (zie het einde van deze sectie en sectie 6 voor instructies voor het optimaliseren van de instellingen).
4. Schakel de selectievakjes "Analyseren" en "Wachten" in en druk op "OK".
   1. Schakel het selectievakje "Wachten" in wanneer u de submacro "Analyseren" uitvoert op 2-kanaalsafbeeldingen. Anders kunnen fouten in het tellen van actieve zone optreden als gevolg van beperkte computercapaciteiten.
5. Wanneer een nieuw venster "Kies een map" wordt geopend, selecteert u de map waar de afbeeldingen zich bevinden en drukt u op "selecteren". De macro analyseert alle afbeeldingen die zijn opgeslagen in de hoofdmap en, indien van toepassing, volgende mappen (met behulp van de drie bestanden van het uitvoeren van de vorige submacro's: stack_image_name, flatstack_image_name en roi_image_name). De macro verwerkt elke afbeelding afzonderlijk en opeenvolgend. Dit kan enkele minuten per afbeeldingsstapel duren (afhankelijk van de computercapaciteit).
6. Nadat u de macro hebt uitgevoerd, wordt er een nieuw afbeeldingsbestand met de naam res_image_name gemaakt voor elke geanalyseerde synaps die is opgeslagen in de bovenliggende map. De kwantitatieve metingen worden opgeslagen als "resultaten.txt" bestand.
7. Inspecteer alle resultaatafbeeldingen om afbeeldingen met segmentatiefouten te detecteren en uit te sluiten. Mogelijke segmentatiefouten worden beschreven in tabel 1, samen met advies over het aanpassen van instellingen om deze fouten te omzeilen. Resultaatafbeeldingen met dergelijke segmentatiefouten worden als voorbeelden in figuur 1gegeven .
   OPMERKING: Bij het uitvoeren van de macro met de standaardinstellingen die in de gebruikersinterface werden waargenomen, was er een nauwkeurigheid van ongeveer 95% wanneer macrobeoordeling werd vergeleken met handmatige evaluatie.

6. Pas de macro-instellingen aan de afbeeldingen aan

1. Wanneer meer dan 5% van de afbeeldingen segmentatiefouten vertoont, verkent u de verschillende algoritmen om de meest geschikte macro-instellingen voor de afbeeldingen te definiëren/kiezen.
2. Rolkogelradiuswaarde aanpassen
   OPMERKING: De rolbalradiusfunctie trekt de achtergrond van de afbeelding af. Deze functie is van cruciaal belang bij het werken met beelden die zijn verkregen op fluorescentiemicroscopen en/of wanneer beelden een hoog achtergrondgeluid hebben. Het aftrekken van de achtergrond zal de automatische drempelstappen van de macro helpen om een adequate segmentatie van de NMJ-terminals te produceren.
   1. Selecteer drie NMJ-stack_image_name afbeeldingen die worden gegenereerd door de submacro "Converteren naar stapel". Kies afbeeldingen die representatief zijn voor de afbeeldingsgegevensset.
   2. Selecteer afbeelding | op de werkbalk Kleur | Kanalen splitsen. Er worden twee afbeeldingsstapels gemaakt, één die respectievelijk kanaal 1 en het andere kanaal 2 vertegenwoordigt en opslaat.
   3. Open de afbeeldingsstapel van kanaal 1 open, overeenkomend met Dlg-1, Hrp, Syt of Csp immunolabeling.
   4. Voer het filter "Achtergrond aftrekken" uit door "Proces" op de werkbalk te selecteren, gevolgd door "Achtergrond aftrekken..." in het vervolgkeuzemenu.
   5. Klik op het selectievakje voorbeeld in het pop-upvenster en pas de straal van de rollende bal aan de waarde aan die het meest geschikt is voor de afbeeldingen. De instelling "Rolling ball radius" moet worden aangepast aan waarden die het contrast tussen synaps en achtergrond verhogen (zie figuur 2A').
      1. Zie figuur 2 voor een voorbeeld. In paneel A vertonen delen van de synaps dezelfde grijswaarden als de achtergrond, terwijl in figuur 2 paneel A' een "Rolling ball radius" van 500 resulteert in een sterk contrast tussen de synaps en de achtergrond.
   6. Maak een z-projectie door te selecteren in de werkbalk Afbeelding | Stapel| Z-projectie, koos Projectietype = Maximale intensiteit en sla de resulterende afbeelding op. Wanneer de juiste waarde voor de rolkogelradius is gedefinieerd, voert u het algoritme "Achtergrond aftrekken" uit op de resterende representatieve afbeeldingen met dezelfde rolbalradiuswaarde. Maak de Z-projecties en sla ze op (in elke map).
      OPMERKING: De rolling ball radius-waarde voor 8-bits of RGB-afbeeldingen moet minstens zo groot zijn als de straal van het grootste object in de afbeelding die geen deel uitmaakt van de achtergrond. Voor 16-bits en 32-bits afbeeldingen moet de straal omgekeerd evenredig zijn met het pixelwaardebereik.
3. Bepaal de verschillende automatische drempels die worden gebruikt
   1. Open de Z-projecties die in de vorige stap zijn opgeslagen (6.2.6) en Selecteer afbeelding | | aanpassen AutoThreshold | Probeer alles.
   2. Als een binaire resultaatafbeelding met drempel waarden wordt weergegeven met alle verschillende algoritmen voor automatische drempels, bepaalt u het meest geschikte algoritme voor de afbeeldingen.
      1. Wanneer u de macro later uitvoert, wijzigt u de drempelwaarde in de macro-instellingen dienovereenkomstig.
      2. Gebruik meer beperkende drempels zoals "RenyiEntrofie" of "Momenten" als de NMJ-omtrekdrempel en meer tolerante drempels zoals "Li" om het NMJ-skelet te bepalen, en "Huang" om actieve zones te bepalen. Wanneer afbeeldingen zeer scherp zijn met weinig tot geen achtergrond, gebruikt u "Huang" als" NMJ-overzichtsdrempel. Anders kunnen delen van de synaps ontbreken na afbeeldingssegmentatie.
      3. Zie figuur 2B voor een voorbeeld. De juiste segmentatie van de synaps wordt verkregen met automatische drempelwaarden gemarkeerd door groene vakken. Enkele voorbeelden van niet-geschikte drempelwaarden worden gemarkeerd met rode vakjes (controleer synapsen bij hoge vergroting). In de laatste worden delen van de synaps ontbreken of delen van de achtergrond worden opgenomen.
4. Bepaal de maximale grootte van de kleine deeltjes
   OPMERKING: Deze functie sluit alle deeltjes die worden gedetecteerd door de NMJ-omtrekdrempel en skeletdrempel die kleiner zijn dan de gedefinieerde waarde in de instelling "kleine deeltjes" uit van de analyse. Deze waarde wordt gedefinieerd in pixels. Deze functie dient als ruisfilter en is zeer nuttig wanneer hoge snelheden van niet-uniforme achtergrond (zoals kristallen / stof) aanwezig zijn in de verkregen beelden.
   1. Open de Z-projecties die zijn opgeslagen in stap 6.2.6. en stel de schaal in om het aantal pixels te detecteren via Analyze | Schaal instellen. Pas de volgende instellingen toe: afstand in pixels = 1, bekende afstand = 1, pixelverhouding = 1, Eenheid van lengte = pixel en druk op "Ok". Klik op het gereedschap "Ovale selectie" in de werkbalk.
   2. Teken met behulp van de muis een selectie die nauw aansluit bij afzonderlijke deeltjes die aanwezig zijn in de immunostaining, maar niet tot de NMJ behoren. Druk op Ctrl+m voor een Windows-gebruiker of cmd+m voor Mac-gebruikers. Er wordt een resultaatvenster geopend dat het gebied aangeeft van de deeltjes die in het aantal pixels zijn geselecteerd.
   3. Herhaal de vorige stap meerdere keren met verschillende artefacten in de afbeeldingen om het grootste vervuilende deeltjes/artefactgebied te bepalen. Dit is de waarde die in de instelling moet worden ingesteld wanneer de macro later wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van de macro de "Small Particles Size" als de kleinste deeltjesgrootte waargenomen pus een marge van 25%.
   4. Zie figuur 2D voor een voorbeeld. Het grootste gedetecteerde kristal heeft een oppervlakte van 112 pixels. De instelling "Kleine deeltjesgrootte" moet bij het verwerken van deze afbeelding met de macro worden ingesteld op 125 - 150.
5. Bepaal de minimale boutongrootte
   OPMERKING: Deze functie sluit alle boutonen die worden gedetecteerd door de NMJ-omtrekdrempel uit die kleiner zijn dan de gedefinieerde waarde van de analyse. Deze waarde wordt gedefinieerd in pixels.
   1. Volg dezelfde stappen als beschreven in paragraaf 6.4, maar teken in dit geval een selectie rond de kleinste boutons die aanwezig zijn in de NMJ-terminal. Kies het kleinste gebied dat overeenkomt met de kleinste bouton van de gemeten. Dit is de waarde die moet worden ingesteld in de minimale boutongrootte-instelling bij het uitvoeren van de macro later.
6. Definieer de waarde "Maxima ruistolerantie"
   1. Als u de waarde "Maximale ruistolerantie zoeken" voor de macro wilt definiëren, opent u kanaal 2 Z-stack die is opgeslagen in sectie 6.2.2.
   2. Ga naar het tabblad plug-ins in het pop-upmenu en selecteer Proces | Maximum(3D) en wanneer de maximum_image_name wordt weergegeven (wat enkele minuten kan duren), sluit u de oorspronkelijke afbeeldingsstapel.
   3. Selecteer de Maximum..._image_name (de nieuw verkregen afbeeldingsstack) en selecteer Plug-ins | | verwerken Minimum (3D), wanneer de nieuwe afbeelding Minimum van Maximum..._image_name apears sluit de maximum... _image_name stapel.
   4. Selecteer proces | op de werkbalk Vind maxima.... Een nieuw venster "Vind maxima..." gaat open. Klik op het selectievakje "Voorbeeldpuntselectie..." en vul het vak "Ruistolerantie" met de standaard macro-instelling 50. De maximapunten worden in de afbeelding aangegeven als kleine kruisjes.
      1. Verhoog de waarde "Ruistolerantie" als u een overmaat aan geannoteerde actieve zones waarneem, d.w.z. kruisen die zich niet boven actieve zones bevinden die niet scherp zijn op het geselecteerde stapelvlak, of valse actieve zones die op de achtergrond worden gedetecteerd.
         1. Aan de andere kant, als het observeren van onvolledig geannoteerde actieve zones, d.w.z. actieve zones in focus niet worden herkend, vermindert u de waarde "Maxima-geluidstolerantie". Blijf verschillende waarden proberen volgens deze procedure totdat de kruisen actieve zones op de juiste manier in focus labelen. Vul de "Zoek maximale ruistolerantie" met deze waarde.
         2. Zie figuur 2C voor een voorbeeld. Er worden te veel actieve zones gedetecteerd. In figuur 2C' worden alleen de actieve scherpstelzones gedetecteerd bij het verhogen van de waarde "Maxima-geluidstolerantie".
   5. Voer de submacro "Analyseren" uit voor de representatieve afbeeldingen die zijn geselecteerd in stap 5.1, waarbij de instellingen zijn gedefinieerd in alle voorgaande stappen.
7. Brp-puncta onder- en bovendrempel aanpassen
   1. Merk op dat er een nieuw bestand verschijnt na het uitvoeren van de macro volgens stap 6.6, genaamd 2_active_zone_stack_image_name. In deze afbeeldingsstapel worden de actieve zones gedetecteerd door de functie "Maxima zoeken" aangegeven door witte stippen in elk vlak.
   2. Open dit bestand door het naar de werkbalk te slepen en neer te zetten en Afbeelding | Stapel | Z-project | Projectietype = Somsegmenten. Er zal een projectie van de 2_active_zone_stack_image_name worden verkregen.
   3. Afbeelding | selecteren | aanpassen Drempel. Er wordt een nieuw venster "Drempel" geopend. Schuif de bovenste balk om een drempelwaarde te kiezen waarbij alle gewenste foci/Brp-positieve vlekken in rood worden gevisualiseerd.
      OPMERKING: Als de drempelwaarde te laag is ingesteld, wordt een overmaat aan actieve zones geteld. Als deze te hoog is ingesteld, wordt een fractie van de actieve zones gemist.
      1. Zie figuur 2E voor een voorbeeld. Wanneer de drempelwaarde is ingesteld op 400, worden de meeste actieve zones (gesymboliseerd als foci van 1 pixel) niet opgenomen in de segmentatie, omdat ze niet rood zijn gemarkeerd (figuur 2E). Wanneer de drempelwaarde is ingesteld op een waarde van 50, worden alle actieve zones rood gemarkeerd (figuur 2E').
   4. Definieer deze waarde als minimumdrempel. Laat "Bovenste punctadrempel" op de maximale waarde staan.
   5. Voer de submacro "Analyseren" opnieuw uit voor de representatieve afbeeldingen met de instellingen die zijn gedefinieerd in alle vorige stappen van deze sectie. Evalueer de resulterende afbeeldingsbestanden kritisch en zorg ervoor dat de segmentatie correct wordt uitgevoerd. Als dit niet het geval is, moet u de instellingen aanpassen aan de aard van de segmentatiefouten (figuur 1, tabel 1).

Representative Results

Figuur 1: Voorbeelden van ongepaste macrosegmentatieresultaten. Resultaat afbeeldingen na het uitvoeren van "Drosophila NMJ Morphometrics" of "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Delen van de synaptische terminal zijn niet opgenomen in de gele omtrek (A). Delen van de achtergrond worden in de synaptische terminal opgenomen door de gele omtrek (B). Blauwe skeletlijn strekt zich uit tot voorbij de synaptische terminal (C - D). Er worden te veel actieve zones gedetecteerd (E - E'). Sommige actieve zones blijven onopgemerkt door de analyse (G - G'). Actieve zones worden gedetecteerd buiten de synaps (F). Onjuiste boutonsegmentatie (Alleen van toepassing bij het uitvoeren van Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), boutonen worden gemist (H) of te veel boutonen worden gedetecteerd door de segmentatie (I). Deeltjes zoals kristallen of stof die deel uitmaken van de achtergrond zijn opgenomen in de segmentatie (J). Tabel 1geeft informatie over het wijzigen van instellingen om deze fouten te voorkomen . Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Voorbeelden van macro-instellingsaanpassingen en de gevolgen daarvan voor beeldsegmentatie. (A) Trek achtergrondvoorbeeld af van een Dlg-1 immunoactief gelabeld synaps, afgebeeld op een fluorescentiemicroscoop met ApoTome, wanneer "Rolling ball radius" is ingesteld op 20 (A) of 500 (A'). (B) Uitvoerafbeeldingen verkregen na het uitvoeren van Image | | aanpassen Automatische drempel | Probeer alle afbeelding illustreert afbeeldingssegmentaties verkregen door de 16 verschillende autodrempelalgoritmen. (C) "Vind Maxima" voorbeeld bij het instellen van "Ruistolerantie" op 50 (C) en 500 (C"); Actieve zones die door de segmentatie worden gedetecteerd, worden gelabeld met een klein kruisje. (D) Meting van de "kleine deeltjes" die op de afbeeldingsachtergrond van een synaps immunoactief gelabeld met anti-Hrp verschijnen, afgebeeld op een confocale microscoop. ( E) "Sum slices" projectie verkregen uit de 2_active_zone_stack_ima-ge_name. De drempel is vastgesteld op 400 (E) en op 50 (E'). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Segmentatie	Waargenomen fouten	Voorbeeld	Vereiste aanpassingen
NMJ Gebied en omtrek (Vertegenwoordigd door gele omtrek in resultaatafbeelding)	Delen van de synaptische terminal zijn niet inbegrepen in de gele omtrek of delen van de achtergrond zijn opgenomen in de synaptische terminal in geel.	Figuur 2A-B	Pas de waarde 'Rolling Ball Radius' aan. Zie punt 6.1.	Pas de 'NMJ-overzichtsdrempel' aan. Zie punt 6.2.
NMJ lengte gerelateerde parameters (Vertegenwoordigd door blauwe skeletlijn in de resultatenafbeelding)	Blauwe skeletlijn strekt zich uit tot voorbij of niet aanwezig is langs de gehele synaptische terminal.	Figuur 2C-D	Pas de waarde 'Rolling Ball Radius' aan. Zie punt 6.1.	Pas de 'NMJ-overzichtsdrempel' aan. Zie punt 6.2.
Brp-positieve puncta (Vertegenwoordigd door punten in resultatenafbeelding)	Er worden te veel actieve zones gedetecteerd.	Figuur 2E-E"	Verlaag de waarde 'Zoek maximale ruistolerantie'. Zie paragraaf 6.5.
Brp-positieve puncta (Vertegenwoordigd door punten in resultatenafbeelding)	Actieve zones worden gemist door de analyse.	Figuur 2G-G"	Verhoog de waarde 'Zoek maximale ruistolerantie'. Zie paragraaf 6.5.	'Brp-puncta lower threshold' verlagen. Zie punt 6.6.
Brp-positieve puncta (Vertegenwoordigd door punten in resultatenafbeelding)	Artefacten voor actieve zone worden gedetecteerd buiten de synaptische terminal.	Figuur 2F	Pas de drempel "Actieve zone" in punt 6.2 aan.	Verhoging van de "Brp-puncta-onderdrempel". Zie punt 6.6.
Kleine deeltjes	Deeltjes zoals kristallen of stof die deel uitmaken van van de achtergrond lijken te zijn opgenomen in de segmentatie.	Figuur 2J	Selecteer het vakje 'Kleine deeltjes verwijderen'. Zie punt 6.3.	Bepaal de maximale grootte van kleine deeltjes. Zie punt 6.3.
Bouton segmentatie	Onjuiste boutonsegmentatie (Alleen van toepassing op Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; gebruik drosophila NMJ Morphometrics niet voor boutonsegmentatie).	Figuur 2H-I	Pas de 'NMJ-overzichtsdrempel' aan. Zie punt 6.1.	Bepaal 'minimale boutongrootte'. Zie punt 6.4.

Tabel 1: Handleiding voor probleemoplossing voor de verschillende soorten fouten in beeldsegmentatie die door de macro's kunnen worden geproduceerd. In deze tabel worden verschillende soorten beeldsegmentatiefouten beschreven die door de macro's worden geproduceerd. Deze kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd in de resultatenafbeeldingen. Voorbeelden van elk fouttype worden weergegeven in figuur 1. In de sectie "aanpassingen" van de tabel worden de instellingen gemarkeerd die moeten worden aangepast en wordt de gebruiker verwezen naar de kritieke substap van sectie 6, waarin wordt beschreven hoe deze instellingen kunnen worden aangepast.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI